Denne protokol viser gennemførelsen af en optimeret N-methyl-D-glucamine (NMDG) beskyttende genoprettelsesmetode af hjernen skive forberedelse. En enkelt media formulering bruges til at pålideligt få sund hjerne skiver fra dyr af enhver alder og for forskellige eksperimentelle programmer.
Denne protokol er en praktisk guide til N-methyl-D-glucamine (NMDG) beskyttende genoprettelsesmetode af hjernen skive forberedelse. Adskillige nyere undersøgelser har valideret nytten af denne metode til at styrke neuronal bevarelse og samlede hjerne skive levedygtighed. Gennemførelsen af denne teknik af tidlige adopters har lettet detaljerede undersøgelser af hjernefunktion ved hjælp af forskellige eksperimentelle programmer og spænder over en bred vifte af animalske aldre, hjerneregioner og celletyper. Trin er skitseret for udførelsen af den beskyttende opsving hjerne skive teknik bruger en optimeret NMDG kunstige cerebrospinalvæske (aCSF) medier formulering og forbedret procedure til pålideligt få sund hjerne skiver for patch klemme Elektrofysiologi. Med denne opdaterede tilgang, en væsentlig forbedring er observeret i hastigheden og pålideligheden af gigaohm segl dannelse under målrettet patch klemme optagelse eksperimenter samtidig opretholde fremragende neuronal bevarelse, dermed at lette udfordrende eksperimentelle programmer. Repræsentative resultater er leveret fra flere neuron patch klemme optagelse eksperimenter til assay synaptisk forbindelse i neocortical hjerne skiver fremstillet af unge voksne Transgene mus og modne voksne menneskers neurokirurgiske prøver. Desuden optimeret NMDG beskyttende recovery metoden til hjernen udskæring er kompatibel med både unge og voksne dyr, således løse en begrænsning af den oprindelige metode. I Resumé, kan en enkelt media formulering og hjernen udskæring procedure gennemføres på tværs af forskellige arter og aldre at opnå fremragende levedygtighed og væv bevarelse.
Akut hjernen skive forberedelse er et væsentlig eksperimentel modelsystem i neurovidenskab. For omtrent halvdelen af et århundrede, har denne platform aktiveret dynamisk funktionelle studier af living-hjernen på tværs af en bred vifte af anatomiske hjerneregioner og dyrearter. Om den tilsigtede anvendelse er biokemi, funktionel afbildning, morfologi eller Elektrofysiologi, er det af yderste vigtighed at sikre optimal integritet og levedygtigheden af de skivede væv. Det er derfor at robust juvenile gnaver hjernen skive forberedelse (dvs., yngre end postnatal dag 30 for mus) har været det mest foretrukne til dato. Vanskeligheden ved at opnå tilstrækkelig sund hjerne skiver fra modne voksne og aldrende dyr har vist sig for at være en formidabel udfordring for de fleste og har indført strenge begrænsninger for at studere den funktionelle arkitektur af modne hjernen. Dette er især sandt for patch klemme optagelse, en teknik, der kræver fremragende morfologiske og funktionelt bevarelse og er uundværlig for kendetegner detaljerede iboende og synaptic egenskaber af identificerede enkelt neuroner. For de sidste mange årtier, har størstedelen af patch klemme electrophysiologists påberåbt sig en ‘beskyttende skæring’ metode ved hjælp af saccharose i stedet lave Na+ aCSF1 for at forberede sund hjerne skiver fra juvenile, og en langt mindre omfang, unge voksne dyr. Denne metode er baseret på den forudsætning, at passive Na+ tilstrømning og efterfølgende vand ind og celle hævelse under trinnet skive skæring er den fremherskende fornærmelse, der fører til dårlig overlevelse af neuroner, især for disse neuroner beliggende i den overfladiske lag, der er mest tilbøjelige til at opretholde direkte traumer fra bevægelsen blade. Men beskyttende klippe metode stadig lader meget tilbage at ønske for hjernen skive forberedelse fra modne voksne dyr uanset den særlige aCSF formulering gennemført.
En enkel, men effektiv løsning på dette problem har været beskrevet2,3,4,5,6 og kaldes “beskyttende nyttiggørelse” hjernen skive metode. Den oprindelige version af denne metode bruger et NMDG-substituerede aCSF, som NMDG blev udpeget som den mest alsidige og effektive blandt forskellige andre kandidat natrium ion erstatninger (herunder saccharose, glycerol, cholin og Tris). Medier formuleringen blev yderligere forbedret ved tilsætning af HEPES til at modstå skive hjerneødem og give stærkere pH buffer7, såvel som tilføjelsen af kosttilskud for at modvirke de skadelige virkninger af oxidativt stress (tabel 1). Det var empirisk fastslået, at en indledende genopretning-inkubation trin i lav Na+, lave Ca2 +, og høj Mg2 + NMDG aCSF straks efter voksen hjerne væv udskæring var både nødvendige og tilstrækkelige for forbedret neuronal bevarelse over en bred vifte af områder af hjernen, celletyper og animalske aldre3,5,6.
Navnlig kan tidligere inkarnationer af hvad er nu døbt den beskyttende genoprettelsesmetode findes i litteratur1,8,9,10,11,12, 13, selv om det fulde potentiale for modne voksne og aldrende dyr hjernen skive og patch klemme optagelse blev ikke genkendt eller demonstreret i disse tidligere værker. Derudover fortsat nuanceret proceduremæssige variationer at dukke op til støtte for særlige eksperimentelle programmer4,14,15,16. Den kollektive krop arbejde af disse mange forskergrupper formidler høj tillid i robusthed beskyttende recovery metoden til forbedret væv bevarelse. NMDG beskyttende genoprettelsesmetode har nu blevet bredt vedtaget og gennemført i talrige offentliggjort forskningsundersøgelser udnytte voksne dyrs hjerne skive præparater. Undersøgelserne akut skive span neocortical3,17,18, hippocampus15,19,20,21, striatal22 , 23 , 24, midthjernen25,26,27,28,29og baghjernen30,31,32, 33 , 34 regioner, og en bred vifte af neurotransmitter og neuromodulator typer, herunder glutamatergic4,30, GABAergic18,20,31,35 ,36, dopaminerge24,29,37,38, kolinerge14,37,38, 39, noradrenerge40og serotonerge27,28 neurotransmission. Metoden er også velegnet for optogenetic kontrol af neuronal aktivitet i skiver stammer fra transgene dyr3,39 eller efter i vivo viral injektioner17,27, 28,40,41,42,43, som godt som funktionelle Ca2 + billeddannelse af neuronal aktivitet2,44 ,45,46. Analyser af såvel kortsigtede plasticitet4,47,48 og forskellige former for langsigtet plasticitet16,35,48 har været rapporteret. En nylig undersøgelse anvendes metoden NMDG beskyttende recovery for at lette, omfattende og systematiske sondering af synaptisk forbindelse i den visuelle cortex i modne voksne mus hjernen skiver ved hjælp octopatch optage konfiguration49 — en kraftfuld demonstration af nytte og robusthed af denne metode. Den beskyttende genoprettelsesmetode er endda blevet anvendt med succes i tidligere uforudsete eksperimentelle sammenhænge, såsom forbedret bevarelse af kar og pericytes i voksne kortikale hjerne skiver50, patch klemme optagelse fra transplanteret interneuron populationer i 1-1,5 år gamle Alzheimers mus modeller20, og en voksen hjerne skive receptor menneskehandel assay51.
Følgende protokol beskriver trinvise procedurer for gennemførelsen af en optimeret NMDG beskyttende genoprettelsesmetode af hjernen skive forberedelse til forbedring af levedygtigheden af akut hjernen skiver. Principper for forbedret neuronal bevarelse er diskuteret, samt demonstration af de klare fordele ved denne metode for komplekse multi neuron patch klemme optagelse eksperimenter i både unge voksne Transgene mus hjernen skiver og moden voksen neurokirurgiske menneskehjerne skiver. Følgende protokol er blevet valideret for mus fra 21 dage gamle til mere end et år gamle, samt med hensyn til menneskelige neurokirurgiske prøver stammer fra voksne patienter.
Na + Spike-i forbedrer Gigaohm Seal dannelse og Patch klemme optagelse succes
Den oprindelige version af metoden NMDG beskyttende opsving var specialdesignet til voksne og aldrende dyr2,5. Nogle tidlige adopters har også forsøgt at anvende denne metode på unge dyrs hjerne udskæring (dvs., mus < 30 dage gammel). Det er blevet bemærket, at i modsætning til den udestående visuelt bekræftet neuronal bevarelse med metoden NMDG beskyttende opsving i denne aldersgruppe, gigaohm seal dannelse kan ofte stall, fører til mislykkede patch klemme optagelse forsøg. En hypotese er, at NMDG kationer er mere let fanget i juvenile hjernen skiver i forhold til voksne hjerne skiver og kan hindre seal dannelse; men gigaohm sæler kan let danne mens juvenile hjernen skiver er fuldt neddykket i NMDG aCSF (data ikke vist), således der viser at NMDG aCSF i sig selv er ikke hindrer gigaohm seal dannelse.
Den hurtige overgang fra lav til høj Na+ løsning ved afslutningen af det oprindelige hjerne skive recovery trin beskadiger neuronal membraner og perturbs seal dannelsen processen. Dette er intuitive, da overgangen fra lav til høj Na+, kold til varm temperatur og dramatisk udvidelse af Ca2 + Mg2 + forhold til kollektivt føre til en massiv genopblussen af spontan synaptic aktivitet. Denne hæmmende rebound fase i hjernen udskæring procedure er tilbøjelige til at spejle reperfusion skade efter en iskæmisk fornærmelse. Således, at yderligere afbøde neuronal membran skader i indledende opvågningsfasen en gradvis Na+ spike-in procedure er blevet indarbejdet i som udvidelse af Na+ koncentration i NMDG beskyttende genopretning-inkubation kammer er langsomt og reproducerbar forhøjet med præcis timing. Som i den oprindelige beskyttende inddrivelsesproceduren er tidsmæssige dissociation af Na+ højde fra temperatur og Ca2 +/Mg2 + forholdet højde gavnligt. Men derudover Na+ spike-in procedure fører til små mindre stigninger i ekstracellulær Na+ koncentration over tidlige tidspunkt punkter og store stigninger over de sene tid point, derved giver hjernevæv en mulighed for at bedre plads til de stigende vandstand i Na+ . Denne procedure er et alternativ til gradvis løsning exchange kontrolleres af en perfusion pumpe eller tyngdekraften drop linjer, som føre til løbende stigninger i Na+ niveauer og kræver opmærksomhed både tilgangen og udstrømning til undgå overløb for skive afdeling. Navnlig i dette Na+ stiger spike-in procedure osmolalitet af løsningen i Skive afdeling gradvist over en periode på flere minutter før skiver er vendt tilbage til normal osmolalitet løsning, men det ikke forringe skive sundhed eller patch klemme optagelse succes. En høj osmolalitet skæring løsning har tidligere været brugt i midthjernen skive præparater for at bedre bevare dopamin neuroner for patch klemme optagelser57,58, dermed demonstrere at dette midlertidige hyperosmolality kan være gavnlig i nogle sammenhænge.
Ved at gennemføre en optimeret procedure kombinerer NMDG beskyttende genoprettelsesmetode og gradvis Na+ er spike-i trin nytten af denne hjerne skive metode blevet udvidet til at omfatte unge gennem modne voksne dyrs aldre. Denne opdaterede protokol er nu egnet til en bred vifte af animalske aldre ved hjælp af en enkelt optimal NMDG aCSF formulering og procedure. Hvis det er nødvendigt, Na+ spike-in procedure kan anvendes med en gradvis længere forsinkelse og/eller langsommere tid naturligvis at øge rentabiliteten af hjernen skiver fra ældre dyr, og vi har givet en grundlæggende guide anbefalede spike-i tidsplanerne ifølge at dyr alder (Se tabel 2). Mens vi har givet en grundlæggende ramme, der er egnet til en bred vifte af applikationer, kan yderligere avancerede trin udforskes for yderligere forbedrer levedygtighed og levetiden af hjernen skiver fra voksne og aldrende dyr. For eksempel glutathion restaurering strategier er særligt effektiv i denne henseende og kan gennemføres som beskrevet andetsteds2,6.
Forbedre overførselshastighed for udfordrende eksperimenter
Analyse af synaptisk forbindelse af patch klemme optagelse er en krævende program, der kræver fremragende bevarelse af både neuronal struktur og funktion for at opnå en høj pålidelighed af succes. Da antallet af neuroner kan registreres samtidigt går op lineært, teknisk sværhedsgrad går op supra-lineært. Der er talrige fejlmodi, og en af de hyppigste årsager til fejl er manglende evne til at form passende gigaohm sæler på en eller flere af de målrettede celler. Dette kan dramatisk langsomme fremskridt, især når tre eller flere neuroner skal registreres samtidig. Overensstemmelse med konstateringen af hurtigere gigaohm forsegle dannelse tid med optimeret NMDG beskyttende recovery metoden, der var en markant forbedring i succesrate og gennemløb af multi neuron patch klemme optagelse eksperimenter med både voksen transgene musen hjernen skiver og voksen neurokirurgiske menneskehjerne skiver. Den forbedrede effektivitet er næsten helt sikkert tilskrives både hurtigere og mere pålidelig gigaohm seal dannelsen og forbedret neuronal bevarelsen af skiver med denne protokol. Selv om denne protokol fokuserer på fordelene udtrykkeligt for patch klemme optagelse programmer, forventes lignende gevinster for andre udfordrende eksperimentelle programmer hvor hjernen skive levedygtighed er altafgørende.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af Allen Institute for hjernen videnskab. Forfatterne vil gerne takke Allen Institute stiftere, Paul G. Allen og Jody Allen, for deres vision, opmuntring og støtte. Vi takker også Allen Institute teknisk support personale til at udføre dyrs pleje, opdræt og genotypebestemmelse.
Compresstome VF-200 | Precisionary Instruments | VF-200 | Vibrating tissue slicer (recommended) |
N-methyl-D-glucamine | Sigma Aldrich | M2004 | aCSF constituent |
Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S3014 | aCSF constituent |
Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P5405 | aCSF constituent |
Sodium Phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 71505 | aCSF constituent |
Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | aCSF constituent |
HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | aCSF constituent |
Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | aCSF constituent |
Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | A4034 | aCSF constituent |
Thiourea | Sigma Aldrich | T8656 | aCSF constituent |
Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P5280 | aCSF constituent |
Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902 | aCSF constituent |
Magnesium Sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | M1880 | aCSF constituent |
2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Aldrich | T48402 | Anesthetic component 1 |
2-methyl-2-butanol | Sigma Aldrich | 240486 | Anesthetic component 2 |
Curved blunt forceps | Fine Science Tools | 11065-07 | Brain dissection tools |
Fine dissecting scissors (supercut) | Fine Science Tools | 14058-09 | Brain dissection tools |
Large heavy duty scissors 7'' | Fine Science Tools | 14000-18 | Brain dissection tools |
Metal spatula | Sigma Aldrich | Z511455-1PAK | Brain dissection tools |
Razor blades | VWR | 89031-954 | Brain dissection tools |
Brain Slice Keeper-4 | Automate Scientific | S-BSK4 | brain slice holding chamber |
nylon netting | Warner Instruments | 64-0198 | For building small slice recovery chambers |
Pyrex glass beakers (250 mL) | VWR | 89090-434 | For building small slice recovery chambers |
35 mm plastic dish, round | VWR | 100488-376 | For building small slice recovery chambers |
Gas diffuser stones (10 µm) | Sigma Aldrich | 59277 | For constant carbogenation (fine bubbles) |
Agarose Type I-B | Sigma Aldrich | A0576 | For embedding brain specimens |
Micro loader tips | Eppendorf | 22491229 | For filling patch clamp electrodes |
Sylgard | VWR | 102092-312 | For making a custom dissecting platform |
Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758-100ML | For pH adjustment of media |
Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | 221465-25G | For pH adjustment of media |
Potassium Hydroxide | Sigma Aldrich | 221473 | For pH adjustment of media |
Plastic transfer pipets 3 mL graduated | VWR | 89497-676 | For slice transfer |
Zirconium ceramic injector blades | Cadence Specialty Blades | EF-INZ10 | http://cadenceinc.com/ |
KG-33 borosilicate glass capillary w/filament | King Glass Company | custom quote | ID: 0.87mm, OD 1.50mm |
Biocytin | Sigma Aldrich | B4261 | Intern pipette solution |
Phosphocreatine disodium | Sigma Aldrich | P7936 | Intern pipette solution |
Potassium Gluconate | Sigma Aldrich | G4500-100G | Intern pipette solution |
EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | Intern pipette solution |
Mg-ATP | Sigma Aldrich | A9187 | Intern pipette solution |
Na2-GTP | Sigma Aldrich | 51120 | Intern pipette solution |
sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | Intern pipette solution |
Heated water bath (2.5L) | VWR | 13491-060 | Miscellaneous |
Filter paper rounds | VWR | 28456-022 | Miscellaneous |
Cyanoacrylate glue | Amazon | B000BQRBO6 | Miscellaneous |
Glass petri dish | VWR | 89000-326 | Miscellaneous |
10X Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P5493 | Miscellaneous |
30 mL syringes | VWR | BD302832 | Miscellaneous |
1 mL syringes | VWR | BD-309628 | Miscellaneous |
25 5/8 gauge needles | VWR | 89219-292 | Miscellaneous |
Thermomixer (w/1.5 mL tube block) | VWR | 89232-908 | To keep agarose molten |