Abstract
Intrazerebrale parenchymal Arteriolen (PAs), die parenchymal Arteriolen umfassen, eindringende Arteriolen und präkapillaren Arteriolen, sind hohe Beständigkeit Blutgefäße aus pialen Arterien und Arteriolen und tauchen in das Hirnparenchym Verzweigung. Einzelne PA einen diskreten zylindrischen Gebiet des Parenchyms perfuse und die Neuronen darin enthaltenen. Diese Arteriolen sind ein zentraler Akteur in der Regulation des zerebralen Blutflusses global beide (zerebrovaskuläre Autoregulation) und lokal (funktionelle Hyperämie). PAs sind Teil der neurovaskuläre Einheit, eine Struktur, die innerhalb des Gehirns regionalen Blutfluss zu Stoffwechselaktivität entspricht, und umfasst auch Neuronen, Inter und Astrozyten. Perfusion durch PAs ist mit der Aktivität von Neuronen in diesem bestimmten Gebiet und steigt in neuronalen Metabolismus führen zu einer Vermehrung der lokalen Perfusion verursacht durch Dilatation des Zuführungs PA verknüpft. Verordnung von PAs unterscheidet sich von der besser charakterisiertepialen Arterien. Druck-induzierte Vasokonstriktion größer in PAs und gefäßerweiternde Mechanismen variieren. Darüber hinaus erhalte PAs nicht extrinsische Innervation von perivaskulären Nerven - Innervation ist intrinsische und indirekt in der Natur durch den Kontakt mit astrozytären Endfüßen. So Regelung in Bezug auf Datenkontraktions durch Studien angehäuft pialen Arterien mit übersetzt nicht direkt an Funktion PA zu verstehen. Weiterhin bleibt es unbestimmt, wie pathologische Zustände, wie Bluthochdruck und Diabetes, PA Struktur und Reaktivität beeinflussen. Diese Wissenslücke ist eine Folge der technischen Schwierigkeiten im Zusammenhang mit PA Isolierung und Kanülierung teilweise. In diesem Manuskript präsentieren wir ein Protokoll für die Isolierung und Kanülierung Nagetier PAs. Weiterhin zeigen wir Beispiele von Experimenten, die mit diesen Arteriolen durchgeführt werden kann, einschließlich Agonisten induzierte Konstriktion und myogenen Reaktivität. Obwohl der Schwerpunkt dieses Manuskript auf PA Kanülierung und Druck Myographie ist, isoliert PAs kann auch für die biochemische, biophysikalische, molekularen und Imaging-Studien verwendet werden.
Introduction
Die cerebrale Durchblutung wird eindeutig organisiert die metabolischen Anforderungen von zentralen Neuronen zu unterstützen, Zellen, die Energie speichert und sind daher sehr empfindlich gegenüber Veränderungen in der Sauerstoffdruck und die Lieferung von notwendigen Nährstoffe begrenzt haben. Als besondere neuronale Subpopulationen aktiv wird , wenn bestimmte Aufgaben durchgeführt werden, fördert die Gefäß eine stark lokalisierte Zunahme der Perfusion 1 lokale Hypoxie und die Erschöpfung der Nährstoffe zu verhindern. Dies ist eine Form von funktionellen Hyperämie als neurovaskulären Kopplung bekannt ist , und ist abhängig von der einwandfreien Betrieb der Gefäß - Nerven - Einheit, bestehend aus aktiven Neuronen, Astrozyten und Hirnarterien 2. Intrazerebrale parenchymal Arteriolen, eine Gruppe von Blutgefäßen parenchymal umfasst, durchdringt und präkapillaren Arteriolen, sind für diese Reaktion von zentraler Bedeutung , und es ist dann kritisch , sie einzeln zu untersuchen , um 3 neurovaskulären Kopplung zu untersuchen.
<p class = "jove_content"> Parenchymale Arteriolen sind klein (20 bis 70 & mgr; m Innendurchmesser) mit hohem Widerstand der Blutgefäße, die unterschiedliche neuronale Populationen im Gehirn perfuse. Verästelung von pial Arterien auf der Oberfläche eindringen parenchymalen Arteriolen in das Hirnparenchym zu einem fast 90 ᵒ Winkel des Untergrundes der Mikrozirkulation zu füttern (Abbildung 1). Diese Arteriolen spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der entsprechenden Perfusionsdruck, da sie die am weitesten distal gelegene glatten Muskulatur haltigen Gefäßen Schutz der Kapillaren sind. Im Gegensatz zu der Oberfläche pialen Zirkulation fehlt parenchymal Arteriolen Nebenzweige und Anastomosen und folglich sind "Engpässe" der zerebralen Durchblutung 4. Als Ergebnis trägt Dysfunktion von parenchymalen Arteriolen zur Entwicklung von zerebrovaskulären Krankheiten wie vaskulären kognitiver Beeinträchtigung und kleine ischämischen Schlaganfällen (auch als stille oder lacunar Hübe bekannt). Studien INDICATe , dass Dysfunktion parenchymal Arteriolen durch essentielle Hypertonie 5, chronischem Stress 6 und ist ein frühes Ereignis in Modell genetischen Maus Kleingefäßerkrankung 7 induziert werden. Weiterhin ist experimentell induzierten Okklusion einzelner eindringende Arteriolen bei Ratten ausreichend kleinen ischämischen Schlaganfällen zu verursachen, die zylindrisch sind in Form, ähnlich 8 bei älteren Menschen beobachtet diese.Zusätzlich zu diesen anatomischen Unterschiede, Funktionsmechanismen Regulieren kontraktilen unterscheiden zwischen pial Arterien und Arteriolen Parenchym. Myogenen Vasokonstriktion größer in parenchymalen Arteriolen 9, möglicherweise wegen des Mangels an extrinsischen Innervation 10, verschiedene Arten der Mechanotransduktion 11 und Unterschieden in der intrazellulären Ca 2+ 12,13 in vaskulären glatten Muskelzellen signalisiert. Hinweise darauf, dass Endothel-abhängige gefäßerweiternde Mechanismen unterscheiden sich auch zwischen diesen Vascular Segmente mit einem stärkeren Vertrauen auf Mechanismen aufweisen parenchymal Arterien beteiligt Ca 2+ -aktivierten K + -Kanäle und elektrotonische Kommunikation innerhalb der Gefäßwand im Vergleich zu diffusionsfähig Faktoren wie Stickoxid und Prostazykline 14. Daher gesammelten Daten in Experimenten pialen Arterien verwendet, kann nicht unbedingt gelten Arteriolen parenchymal, eine Lücke in unserem Wissen über die lokalen Kontrolle der zerebralen Perfusion zu verlassen.
Trotz ihrer Bedeutung sind parenchymal Arteriolen in beträchtlichem Ausmaß untersuchtes, in erster Linie aufgrund der technischen Herausforderungen , mit Isolierung und Montage für Ex - vivo - Studie. In diesem Manuskript beschreiben wir eine Methode zur Isolierung und zerebrale parenchymale Arteriolen kanülieren, die für Druck Myographie verwendet werden kann oder das Gewebe für Immunomarkierung, Elektrophysiologie, Molekularbiologie, und biochemische Analyse zu isolieren.
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Protocol
1. Cannula und Kammer Vorbereitung
- Legen Rein Borosilikat-Glaskapillaren (Außendurchmesser: 1,2 mm; Innendurchmesser: 0,69 mm; 10 mm Länge) in die Nuten einer Pipettenzieher mit einem Platinfaden (Durchmesser: 100 um).
- Mit geeigneten Einstellungen, ziehen Sie die Kapillare eine Kanüle mit einer langen und dünnen Spitze (Abbildung 2) mit einer Mikropipette Abzieher zu erzeugen. Die Einstellungen werden verwendet: Heat - 700, Pull - 100, Geschwindigkeit - 50, Zeit - 10.
- Setzen Sie eine Kanüle in den Halter der Druck Myographions Kammer. Richten Sie die entsprechend Kanülen.
- die Spitzen der Kanülen vorsichtig brechen, indem sie mit einer Pinzette unter dem Binokular auf den gewünschten Durchmesser verwendet wird. Hier zeigen wir eine Kanüle mit einer 10 & mgr; m Spitze (Abbildung 2).
- Füllen Sie die beiden Kanülen mit künstlichem Liquor (aCSF) , die 1,8 mM Ca 2+; Füllen der Kammer mit Ca 2+ -freien aCSF mit 1% RinderserumAlbumin (BSA) + 10 & mgr; M Diltiazem (alle Lösungen sollten vor Beginn des Experiments frisch zubereitet werden). In Abhängigkeit von der Größe der Kammer, variiert das Volumen von aCSF zwischen 5 bis 20 ml. Lagern Sie die Kammer bei 4 ᵒ C , bis sie bereit Kanülierung zu starten.
HINWEIS: Diltiazem ist eine reversible L-Typ spannungsgesteuerten Calcium-Inhibitor, der eine Erweiterung der Arteriolen verursachen wird, die Kanülierung erleichtert
2. Isolierung von Parenchymale Arteriolen
- Euthanize das Tier unmittelbar vor der Präparation unter Verwendung von Standardprotokollen im Labor, die von der Institution Tierpflegekommission genehmigt werden. Die Verwendung von Barbituraten oder Kohlendioxid ist bevorzugt, da andere üblicherweise verwendete Anästhetika gefäßerweiternde Wirkung im cerebralen Zirkulations 15 aufweisen. Alle tierischen Verfahren hier gezeigt wurden von Institutional Animal Care und Use Committee der University of Nevada School of Medicine, und sind in ag genehmigtreement mit den National Institutes of Health "Guiding Principles in die Pflege und Verwendung von Tieren".
- Euthanize das Tier unter Verwendung von Kohlendioxid. Vor dem Abtrennen des Kopfes zu gewährleisten, dass das Tier die Atmung ausgesetzt hat und nicht mehr reagiert, wenn seine Pfoten einklemmen.
- Enthaupten das Tier eine scharfe Schere mit (Maus) oder Guillotine (Ratte). Entfernen Sie die Haut vom Kopf des Tieres und entlang der Mittellinie Schädelnaht geschnitten, um eine feine Spitze Schere verwenden. Mit entfernen, um eine stumpfen Pinzette (Maus) oder eine Knochenzange vorsichtig die Schädelknochen und die Gehirn- aussetzen. Entfernen Sie das Gehirn langsam und vorsichtig als nicht Oberfläche pialen Arterien zu beschädigen. Legen Sie das Gehirn in einen Behälter gefüllt mit 20 ml Ca 2+ -freien aCSF mit 1% BSA auf Eis ergänzt.
- Füllen Sie eine Dissektion Gericht ein Pad mit eiskaltem Ca2 + -freien aCSF ergänzt mit 1% BSA und übertragen das Gehirn mit der Bauchseite nach oben auf dieser Schale (2A) enthält. Die Schale unter einem dissecting Mikroskop (3A). Pin das Gehirn auf das Pad mit 27-Gauge-Nadeln. Achten Sie darauf, zu vermeiden, Pins in der Nähe der mittleren Hirnarterie platziert (MCA).
- Localize den Kreis von Willis und dem MCA von ihm Verzweigung. Mit scharfen und Vannas Feder Schere ausgerichtet sind, schneiden Sie ein kleines Rechteck um den MCA. Stellen Sie sicher, dass Rechteck in der Nähe von 5 mm über die ganze Länge des MCA. Der obere Teil des Rechtecks sollte aus dem Kreis von Willis (proximal zu dem Kreis von Willis, 2B, Pfeil) hinter dem Verzweigungspunkt sein.
- Mit Hilfe der Vannas Frühjahr Schere, führen für eine Hinterschneidung in die Tiefe des Gewebes ca. 2 - 3 mm.
HINWEIS: Dieser Teil ist von entscheidender Bedeutung für eine gute Isolierung von parenchymal Arteriolen, und es kann einige Versuche nehmen Sie es richtig zu machen. Wenn der Schnitt tief genug gemacht ist Anmerkung werden die isolierten parenchymal Arteriolen kurz sein; wenn der Schnitt zu tief ist, werden die Arteriolen an ihrem Verzweigungspunkt brechen, wenn die seziertGewebe wird entfernt. - Festnageln am meisten distale Ende des Hirnschnitt in das Sezieren Schale mit dem MCA nach oben (distal aus dem Kreis von Willis) unter Verwendung von Insekten Pins. Machen Sie einen flachen Einschnitt die pia in der Nähe von dem Stift zu schneiden, wobei darauf geachtet, nicht zu schneiden, zu tief in das darunter liegende Hirnrinde (sonst die Stifte nicht halten).
- greifen vorsichtig auf jeder Seite der pia mit kleinen Zange und starten Sie den pia aus Rinde Peeling. Falls erforderlich, halten Sie sich an die MCA, um sicherzustellen, dass die umgebende pialen Membran nicht beschädigt wird.
- Halten Sie Peeling, bis die pia die MCA enthält, aus der Rinde frei ist. Beachten Sie, dass der Widerstand gegen Abschälen an den Kreis schließen erhöhen die Willis. Seien Sie besonders vorsichtig an dieser Stelle, weil die längeren parenchymal Arteriolen in dieser Region sein wird.
- Sobald der pia frei ist, legen Sie sie vorsichtig auf der Oberseite des Pad auf dem Sezieren Schale mit der Oberfläche gegen Arteriolen nach unten (2B) zu parenchymal. <li> Mit Vannas Frühjahr Schere, schneiden Sie die seziert Arteriolen von der MCA frei heraus, sicherstellen, dass die Enden des Schiffes stumpf geschnitten werden.
- Gesammelte Arteriolen kann für Druck Myographie, molekulare Analyse oder Isolierung von nativen glatten Muskulatur oder Endothelzellen verwendet werden.
3. Druck Myographie
- Bereiten Sie die Naht vor der Zeit. Schneiden Sie das dunkelgrüne Nylonfaden in 5 mm große Stücke und legen Sie auf der klebrigen Seite eines doppelseitigen Klebeband auf einer Petrischale. Unter dem Binokular, trennen Sie jedes Stück in seine Fäden feinen Pinzette und locker eine einfache Halbkupplung Knoten in die andere, indem ein Ende der Faden herzustellen.
- Mit einer Pinzette, wählen Sie einen Knoten aus dem doppelseitigen Klebeband, um sicherzustellen, es nicht mit zu viel Druck zu greifen. Ziehen Sie den Faden in Badlösung, Rutsche Knoten auf Kanüle ein und ziehen Sie es aus der Spitze der Kanüle in einem Abstand. Wiederholen Sie diesen Vorgang 2 Nähte an jeder Kanüle zu haben.
- Mantel mit einem GlasMikropipette mit einer BSA - Lösung 10% und dann den Überschuss mit Ca 2+ -freien aCSF mit 1% BSA ergänzt abspülen.
- Ziehen Sie 50 ul-Lösung in die Glas-Mikropipette, ziehen ein parenchymal Arteriolen und übertragen auf den Druck Myographie Kammer. Drücken Sie den Kolben in einer fließenden Bewegung die parenchymal Arteriolen in die Kammer verzichten zu verhindern, dass es zu der inneren Kammer des Glasmikropipette kleben.
- Mit Hilfe von zwei Super feinen Pinzette, öffnen Sie das Lumen des PA, wobei darauf geachtet, nur das Ende des Gefäßes berühren.
- mit der Pinzette die Kanten des parenchymal Arteriolen zu halten, sorgfältig das Gefäß auf die Kanüle ziehen. Ziehen weit genug an der Kanüle , so daß der Behälter nicht ganz am verjüngten Ende der Kanüle (3A) ist.
- Lösen Sie die 2 Nähte an der Kanüle und ziehen Sie sie auf dem Schiff (3B). Raum die Fäden auseinander ein wenig auf dem Schiff, und ziehen in Richtung des Bedieners während tighzehn davon. Stellen Sie sicher, dass alle Zweige vor dem Schließen der gegenüberliegenden Ende des parenchymal arteriole abgebunden.
- Drehen Kammer um und schließen Sie das andere Ende des parenchymal arteriole als Sacksack. Um das zu erreichen, öffnen Sie die Bande auf der gegenüberliegenden Kanüle und geben es auf den Arteriolen. langsam schließen, den Knoten in einer Weise, dass die parenchymal arteriole wird auf der Seite der Kanüle gebunden werden. Vermeiden Längsdehnung der Arteriolen. (3C).
HINWEIS: Wenn das Ziel der Studie ist es Drogen durch das Lumen zu perfundieren, kanülieren das entgegengesetzte Ende statt der parenchymalen Arteriole zu der Seite der Kanüle zu binden. Stellen Sie sicher, dass die Kanülen haben keine Salzkristalle oder interne Build-ups, die intraluminale Fluss blockieren. Regulierung der Strömungsrate in geeigneter Weise, um Scherspannung innerhalb der physiologischen Niveaus zu halten. Eine Studie von Shih et al. Zeigt Flussraten innerhalb Arteriolen bei Ratten 8, stechend und kann als erste Orientierungshilfe für pi dienenViele Studien. - übertragen Sie vorsichtig die Kammer des Mikroskops auf die Bühne für die Aufzeichnung von Gefäßdurchmesser verwendet werden. Bringen Sie die Kammer auf den Mikroskoptisch, Anschlusstemperaturfühler und Ein- und Ausgänge für die Perfusion auf die richtigen Röhren. Unter Druck setzen der Arteriole bis 40 mmHg intraluminalen Druck für Arteriolen Maus parenchymalen oder 50 mmHg für Ratten - Arteriolen, erhältlich ein Drucksystem unter Verwendung im Labor (Wassersäule, verbunden peristaltische Pumpe mit einem Druckwandler, etc.). 4D zeigt ein Beispiel für eine Schlauchpumpe mit einem Druckwandler verbunden, um den kanülierten Arteriole zu beaufschlagen.
- Schalten Sie das System verwendet , um Veränderungen im Durchmesser (Abbildung 3E). Passen Sie die Einstellungen am Mikroskop, wie Beleuchtung und Kontrast, um die besten Erkennung möglich zu erhalten. Idealerweise sollten die Wände des Arteriole dunkel sein und das Lumen durchscheinend. Sobald die Erkennung geeignet ist, beginnen t Aufnahmeer experimentieren.
- Starten Sie das Superfusionssystem. Waschen Sie die kanülierte, unter Druck stehenden parenchymalen Arteriole mit warmem (37 ᵒ C) aCSF enthaltend 1,8 mM Ca 2+ für 15 bis 20 min bei einer Strömungsgeschwindigkeit zwischen 3 bis 5 ml / min. Diese aCSF sollte enthalten Diltiazem oder BSA nicht.
- Ersetzen Sie die regelmäßige aCSF mit 60 mM KCl aCSF die Lebensfähigkeit der Zubereitung zu bewerten. 20% Einschnürung 60 mM KCl - PAs An dieser Stelle sollte 10 aufweisen. Wenn die Arteriolen in diesem Umfang einengen nicht, zu entfernen und ein anderes arteriole kanülieren.
- Waschen Sie die 60 mM KCl mit regelmäßigen aCSF. Warten Sie, bis Generation von spontanen myogenic Ton, der zu einer Stunde dauern kann. Wenn arteriole bis dahin nicht myogenic Ton haben, ersetzen Sie es mit einem anderen Arteriolen.
HINWEIS: Myogenic Ton wird als graduelle, beobachtet und manchmal langsam, Verringerung des Lumendurchmesser des Gefßes ohne Stimulation durch kontraktile Agonisten oder hohen KCl-Lösung. Myogenen tone durch die folgende f berechnetormula: (1 - (aktiv Lumendurchmesser / Passiv - Lumendurchmesser)) x 100 5 Eine geeignete Menge an myogenic Ton kann sich je nach Behandlungen, Zerrungen, Spezies, Transgenen, usw.. In der Regel reicht physiologischen myogenic Ton 15 bis 30% 5.
4. Beispiel Druck Myographie Experimente: Agonist-induzierte Konstriktion und Myogenic Reaktivität
- Bereiten Sie eine Reihe von Verdünnungen eines Agonisten der Wahl in aCSF mit geeigneten Konzentrationen. Für das aktuelle Beispiel wurde der Thromboxan A 2 -Rezeptor - Agonisten U46619 verwendet. Eine Stammlösung von 1 ml U46619 bei einer Konzentration von 1 mM, wurde hergestellt. Transfer von 100 & mgr; l der 1 mM-Lösung in ein neues Röhrchen 900 ul aCSF enthält eine 10-fache Verdünnung des Medikaments zu machen, in einer Lösung führt, die 100 uM U46619. Wiederholen Sie diesen Vorgang für 6 Verdünnungen im Bereich von 1 mM bis 100 nM eine Konzentrations-Wirkungs-Kurve constrictor vorzubereiten.
- Ergänzen Sie diegesamte Volumen der Lösung der Agonist (1 ml für die erste Dosis, gefolgt von 900 & mgr; l aller nachfolgenden Dosen) enthält, zu 100 ml Superfusion aCSF. Dies wird zu einer zusätzlichen 100-fachen Verdünnung des Agonisten führen. Somit sind die Endkonzentrationen von Agonist in dem Bad Bereich von 10 pM bis 10 uM. Lassen Sie Arteriolen für ~ 10 min in jeder Konzentration inkubiert, bis luminalen Durchmesser einen stationären Zustand erreicht.
- Waschen Sie den Agonisten aus durch PAs mit aCSF ohne Drogen Superfusion, bis der PA Durchmesser wieder auf den ursprünglichen Wert. Inkubieren Sie die parenchymal arteriole in Ca 2+ -freien aCSF (ohne BSA) , ergänzt mit 10 & mgr; M Diltiazem + 2 mM EGTA maximale Dilatation und aufzeichnen passiven Durchmesser der Arteriolen zu induzieren.
- Entfernen Sie die parenchymal arteriole aus der Kanüle durch vorsichtiges Herausziehen während in das Ende der Beziehungen halten. Waschen Sie die Behälterkammer mit Doppel entsalztem Wasser Schutt und mehr als Agonisten zu entfernen. Füllen Sie die Kammer mit Ca2+ -freien aCSF + BSA und kanülieren andere arteriole. Es ist nicht mehr als ein Versuch pro Arteriole empfohlen durchzuführen.
- Um eine myogenic Reaktivität Experiment durchführen, lassen Sie den parenchymal Arteriolen bei 40 mmHg intraluminale Druck äquilibrieren bis spontane myogenic Ton erzeugt wird (wie oben beschrieben). Reduzieren Sie die intraluminale Druck auf 5 mmHg und erlauben PA für ~ 5 äquilibrieren - 10 min, bis luminalen Durchmesser stabilen Zustand erreicht. Erhöhen Sie den intraluminalen Druck schrittweise das Intervall der Wahl (zum Beispiel 5-140 mmHg in 20 mmHg-Schritten).
- Nicht die Arteriole zu intraluminalen Druck unter 5 mmHg belichten, wie Zusammenbruch verursachen könnte und das Endothel schädigen, wodurch die Ergebnisse des Experiments zu verändern.
- Am Ende der Druckkurve, die superfuse parenchymalen Arteriole mit Ca 2+ -freiem aCSF (ohne BSA) , ergänzt mit 10 & mgr; M Diltiazem + 2 mM EGTA und wiederholen Sie die Druckstufen an den Ausgangs lowest Druck.
Hinweis: Dies wird die passive Durchmesser der PA geben, die% myogenic Ton zu berechnen notwendig sind, definiert durch die Formel:% Ton = (1 - (aktiv Durchmesser / Passiv-Durchmesser)) x 100.
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Representative Results
5A zeigt eine repräsentative Verengung der Maus PAs auf 60 mM KCl aCSF die Integrität der Zubereitung zu bewerten. 30% in Gegenwart von 60 mM KCl - PAs sollte zwischen 15 verengen. Wenn die Verengung unter 15%, entsorgen Sie die PA und ein anderes kanülieren, wie es legt nahe, dass die Arteriolen bei der Isolierung und Kanülierung beschädigt wurde.
5B stellt PA Verengung Konzentrationen des Thromboxan A 2 analoge U-46619 (10.00 Uhr bis 1 & mgr; M) in die Superfusion Bad zu erhöhen. Die Einschnürung wurde als Verminderung des Lumendurchmesser nach der Inkubation mit jeder Konzentration beobachtet. Der PA wurde bei jeder Konzentration für 10 Minuten äquilibrieren. Diese Daten können als eine Änderung des Durchmessers (ΔDiameter) oder als% Vasokonstriktion KCl analysiert und dargestellt werden, was die chang normalisierte im Durchmesser durch die maximale Einschnürung 60 mM KCl.
Figur 6 zeigt eine repräsentative Verfolgung des Lumendurchmessers eines PA in einer myogenen Reaktivität Experiment. Schrittweise Erhöhung der intraluminale Druck bewirkt , dass eine abgestufte Verengung der PAs in Gegenwart von 1,8 mM extrazellulärem Ca 2+ (Abbildung 6, untere Spur). Inkubation des gleichen PA mit aCSF ohne Ca 2+ und ergänzt mit 10 & mgr; M Diltiazem + 2 mM EGTA abschafft myogenen Tonerzeugung und der Lumendurchmesser der PA steigt entsprechend intraluminalen Druck (Figur 5, obere Spur), der das passive Lumendurchmesser des Arteriole.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Parenchymale Arteriolen. PAs Zweig aus Oberfläche pial Arterien und tauchen Sie in das darunter liegende Hirnparenchym. Jeder PA perfundiert eine kleine neuronalen Population innerhalb ihrer Säulen Gebiet (Regionen hervorgehoben). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2:. Isolierung von Maus Cerebral PAs A) Bild des Gehirns mit der Bauchseite nach oben zeigt den Kreis von Willis Verblendung (Pfeil 1) und die MCA Verzweigung von ihm (Pfeil 2). B) Bild des MCA mit dem zugrunde liegenden Hirngewebe. Der Pfeil zeigt auf den meisten proximalen Bereich des MCA aus dem Kreis von Willis. C) PAs aus den MCA (Pfeile Verzweigung). Bar = 100 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 
Abbildung 3: Kanülierung von isolierten Maus - PAs A) Bild eines PA Kanüle versehen , aber noch nicht mit den Nähten gebunden.. Dieses Bild zeigt die Länge der PA auf die Kanüle eingeführt werden, bevor es mit den Fäden schließt. B) Die PA wird nun auf der Kanüle mit zwei Nähten verschlossen zu gewährleisten, dass es nicht die Kanüle nach der Druckbeaufschlagung abgleiten. C) Bild eines kanülierten, unter Druck stehenden Maus PA in einer Sack sac experimentellen Konfiguration. Bar = 50 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Ausrüstung benutzt in unserem Labor für PA Versuche A) Dissection Mikroskop mit.Lichtquelle. B) Temperaturregler. C) peristaltische Pumpe für Bad Superfusions von aCSF. D) Druckservosteuerung, Living Systems Instrumentation. E) Video Dimension Analyzer (unten rechts), Monitor (oben rechts) und Video-Kantenerkennung System auf einem Laptop (links) geladen. F) Kleine Gefäßkammer (lineare Ausrichtung Kammer). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Einschnürung des PAs auf KCl-induzierte Depolarisation und der Thromboxan A 2 Analogue U46619 A) Repräsentative Verengung der Maus PAs auf 60 mM KCl aCSF die Integrität der Zubereitung zu bewerten.. 30% in Gegenwart von 60 mM KCl - PAs sollte zwischen 15 verengen. B) U46619 Verengung der PAs induziert wird; wie bei der Verfolgung beobachtet, verursacht U46619 einkonzentrationsabhängige Verengung der PAs, wie eine Verringerung des Lumendurchmessers nach Inkubation mit jeder Konzentration beobachtet. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb . 6: Myogenic Reaktivität von PAs Stepwise steigt in intraluminalen Druck bewirkt eine abgestufte Verengung der PAs in Gegenwart von 1,8 mM extrazellulärem Ca 2+ (untere Spur). Dieser druckinduzierte Einschnürung des Widerstands Arteriolen charakteristisch. Inkubation des gleichen PA mit aCSF ohne 1,8 mM Ca 2+ und supplementiert mit 10 uM Diltiazem + 2 mM EGTA abschafft myogenen Tonerzeugung und der Lumendurchmesser der PA steigt entsprechend intraluminalen Druck (obere Spur), der die passive Lumen Durchmesser von the arteriole. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Cerebral parenchymal Arteriolen sind hohe Beständigkeit Arteriolen mit wenigen Anastomosen und Zweige, die unterschiedliche neuronale Populationen perfuse. Diese spezialisierten Blutgefäße sind zentrale Akteure bei zerebrovaskulären Autoregulation und neurovaskulären Kopplung durch Astrozyten vermittelte Vasodilatation 1. Die Bedeutung dieser spezialisierten Blutgefäße in der zerebralen Gefäßerkrankung ist seit etwa 50 Jahren bekannt, als die Pionierarbeit von Dr. Miller Fisher in den Gebieten von lacunar Infarkte im Gehirn von Patienten mit Hypertonie strukturelle Veränderungen in parenchymal Arteriolen beschriebenen post-mortem 16 . Diese Veränderungen, die mit Funktionsbeeinträchtigung kann hypoperfusion der tiefen weißen Substanz verursachen, ein wichtiger Risikofaktor für die Entwicklung von gefäßbedingten Demenz 17. Parenchymale Arteriolen sind funktionell verschieden von großen intrakraniellen und pialen Arterien sowie Oberflächen Arteriolen, so akkumuliert data dieser Mitglieder des zerebrovaskulären Baum verwendet, kann nicht ohne weiteres auf die Mikrozirkulation parenchymalen hochgerechnet werden. Trotz ihrer klaren Bedeutung in der richtigen Gehirn Aufrechterhaltung der Homöostase, Studien konzentriert sich auf die Physiologie und funktionelle Reaktionen dieser Arteriolen haben bis vor wenigen Jahren knapp gewesen, in erster Linie aufgrund von technischen Schwierigkeiten im Zusammenhang mit der Isolierung und Manipulation.
Im vorliegenden Manuskript beschreiben wir eine einfache und reproduzierbare Technik für die Isolierung und Kanülierung parenchymal Arteriolen für Druck Myographie Studien, molekulare Analyse, oder die Herstellung von nativen glatten Muskulatur oder Endothelzellen. Darüber hinaus präsentieren wir Daten über die Nutzung dieser Technik myogenic Regelung zu untersuchen, constrictor, und säumig Mechanismen in parenchymal Arteriolen. Wir beobachten, dass diese Schiffe sind myogenically aktiv, Erzeugung spontanen myogenic Ton, wenn intraluminale Druck auf einem konstanten Niveau gehalten wird, sowie die Änderung ihrermyogenic Statusänderungen in intraluminale Druck gegenüber , ein Phänomen , gut beschrieben für Widerstand Arterien myogenic Reaktivität 18 bezeichnet. Myogenen Reaktivität ist ein Schlüsselfaktor in Perfusionsdruck im Gehirn regulieren, konstant gerichtete Schwankungen in systemischen arteriellen Druck zu halten, wodurch ein Verlust der Perfusion bei niedrigen Drücken zu verhindern oder vasogenes Ödem bei höheren Drücken 18. Darüber hinaus zeigen wir, dass diese Arteriolen vasoaktiven Substanzen wie Endothelin-1, eine wichtige endogene Vasokonstriktor durch endotheliale Zellen erzeugt reagieren. Eine wesentliche Einschränkung der Zubereitung hier beschrieben ist, der durch die parenchymal Arteriolen wichtige Komponenten des neurovaskulären Einheit zu isolieren verloren und funktionelle hyperamisch Antworten können nicht untersucht werden. Andere Zubereitungen, wie Hirnschnitt, um die Struktur des intakten neurovaskulären Einheit erhalten und sind besser geeignet astrozytären Kontrolle zerebraler arteriolar Durchmesser 19 zu studieren. However, in der Hirnschnitt Herstellung sind parenchymalen Arteriolen nicht unter Druck gesetzt und exogene Verabreichung von rezeptorabhängigen Vasokonstriktorwirkstoffe benötigt wird basale Tonus, um zu imitieren vasodilatatorischen Reaktionen zu untersuchen. Druck Myographie und die Hirnschnitt Zubereitung sollte für die Untersuchung der zerebralen Mikrozirkulation ergänzen berücksichtigen.
Das hier beschriebene Protokoll wurde aus einer Zubereitung angepasst zuerst von Dacey und Duling 1982 20 und verändert durch Coyne et al. 21 beschrieben. Der wesentliche Unterschied liegt in der Kanülierung Technik verwendet. Während Dacey und Duling und Coyne et al zwei verschiedene Arten von Pipetten, eine Holding externe Pipette und eine intraluminale Kanülierung Pipette verwenden wir nur die intraluminale Pipette und manuell die PA in die Pipette schieben . Diese Technik wurde kürzlich durchzuführen Studien in Ratten - PAs nach zerebraler Ischämie - Reperfusionsschaden 22, PAs von chronmatisch hypertensive Ratten 5, unter anderem. In Mäusen, verwendeten wir diese Technik Ca 2+ Signale in unter Druck PA glatten Muskelzellen unter physiologischen Bedingungen und Azidose durch Kopplung PA Kanülierung zum Laserscanning konfokale Mikroskopie zu beurteilen Ca 2+ Wellen und Funken in glatten Muskelzellen 13 zu beurteilen. Wir testeten auch mehrere neurovaskulären Kopplung Mittel 3 und gezeigt, unter Verwendung pharmakologische Werkzeuge in Verbindung mit Membranpotential Aufnahmen, dass cerebrospecific Hochregulation von spannungsabhängigen Kaliumkanäle K V 1 7 ein Ionenkanal-ähnlichen Defekt in Kleingefäßerkrankung genetische Modell verursacht. Diese Beispiele zeigen die Lebensfähigkeit dieser Zubereitung verschiedener Forschungsfragen zu beantworten.
Es ist wichtig, dass die Isolation von cerebralen PAs aus Hirngewebe zu markieren ist der kritischste Schritt wird, wie der Leichtigkeit der Kanülierung von der Anzahl und Länge von PAs isola abhängtted. Es kann ein paar Versuche, um die Isolierung zu optimieren. Ferner kann die Lernkurve für Kanülierung lang und frustrierend sein, und die anfängliche Erfolgsraten können so niedrig wie 50% sein. Sobald jedoch beherrscht, ist die Reproduzierbarkeit und den Durchsatz dieses Verfahrens hoch, und viele Experimente in einem Tag durchgeführt werden.
Zusammenfassend beschreibt die vorliegende Manuskript, eine Technik für die Isolierung und die Kanülierung von cerebralen Parenchym Arteriolen. Eine solche Vorbereitung isoliert, um die vaskuläre Komponente der neurovaskulären Einheit, intakte Reaktionen des unter Druck stehenden Arteriolen zu halten. Studien isoliert PAs verwendet, wird wertvolle Einblicke in die zerebrale parenchymale Zirkulation in beiden physiologischen und pathologischen Bedingungen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial Cerebrospinal Fluid | |||
| NaCl | Fisher Scientific | S-640 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217 | |
| MgCl Anhydrous | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G2870 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Isolation/Cannulation | |||
| Stereo Microscope | Olympus | SZX7 | |
| Super Fine Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Wiretrol 50 μl | VWR Scientific | 5-000-1050 | |
| 0.2 μm Sterile Syringe Filter | VWR Scientific | 28145-477 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Dark Green Nylon Thread | Living Systems Instrumentation | THR-G | |
| Linear Alignment Single Vessel Chamber | Living Systems Instrumentation | CH-1-LIN | |
| Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
| Video Dimension Analyzer | Living Systems Instrumentation | VDA-10 | |
| Four Channel Recorder with LabScribe 3 Recording and Analysis Software | Living Systems Instrumentation | DAQ-IWORX-404 | |
| Heating Unit | Warner Instruments | 64-0102 | |
| Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B | |
References
- Dunn, K. M., Nelson, M. T. Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 306, H1-H14 (2014).
- Iadecola, C. Neurovascular regulation in the normal brain and in Alzheimer's disease. Nat Rev Neurosci. 5, 347-360 (2004).
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