Selektiv Høst af Marginating-pulmonale Leukocytter

Introduction

Leukocytter klæber til kapillærerne i lungerne (dvs. marginating-pulmonal (MP) leukocytter) ¹ blev vist at udvise forskellig leukocyt sammensætning og unik aktivitet sammenlignet med leukocytter fra andre immune rum (fx omsætning, milt, knoglemarv) ^{2- fire.} For eksempel, MP-leukocytter udviser højere naturlige dræber (NK) celler cytotoksicitet mod forskellige tumorceller, sammenlignet med cirkulerende og spleniske NK celler, såvel som differentieret messenger-RNA (mRNA) -niveauer og forøget sekretion af pro- og anti-inflammatoriske cytokiner. Sammensætningen af ​​celler også differentieret fra cirkulerende leukocytter som MP-leukocytter har et højere forhold mellem medfødte / adaptiv immunitet i forhold til cirkulerende leukocytter (50% vs. 30%, henholdsvis). Målet med fremgangsmåden heri præsenterede er at muliggøre selektiv høst af MP-leukocytter, for at studere dette vigtige og unikke immun rum (cellepopulation), og at elucIDATE effekten af forskellige manipulationer (f.eks immun aktivering) på disse specifikke celler.

For at forstå betydningen af denne unikke population, er det vigtigt at bemærke, at immunsystemet kan styre cirkulerende tumorceller, mikrometastaser og residual sygdom af in vivo funktioner af cellemedieret immunitet (CMI). Denne evne er indlysende trods af præcedens svigt af immunsystemet til at styre den primære tumor, og understøttet af rigelig in vivo evidens hos cancerpatienter og dyremodeller ^5. Vigtigere er, disse resultater er ofte i modstrid med in vitro og ex vivo undersøgelser, der rapporterer, at de fleste autologe tumorceller er resistente over for cytotoksicitet ved cirkulerende leukocytter i blodprøver fra mennesker og dyr (målt ved cytotoksicitetsassays) ^6,7. Denne uoverensstemmelse kan tilskrives in vivo findes særskilte leukocytpopulationer, såsom den ovenforførstnævnte MP leukocyt befolkning, og især dens delpopulation af aktiverede NK-celler ^3. Faktisk syngene tumorceller (MADB106), som viste sig at være resistente over for cirkulerende og milt leukocytter, viste sig at være lyseres ved MP-NK-celler ^3,8. Således er de angiveligt "NK-resistente 'MADB106 celler, der metastaserer til lungerne af fischer344 (F344) rotter kontrolleret af MP-NK-celler, men ikke ved at cirkulere eller milt NK-celler, som er almindeligt studerede givet deres lette adgang.

Rensede og aktive MP-leukocytter er utilgængelige gennem standard høstmetoder af leukocytter fra lungerne, som er baseret på lungevæv slibning eller biologisk nedbrydning ^9. Vores tilgang har to store fordele sammenlignet med væv forarbejdning tilgange. For det første perfusion tilgang selektivt høster MP-leukocytter, der adskiller dem fra andre celler, der stammer fra lungerne parenkymatisk, interstitiel og broncho-alveolær Compartments. For det andet perfusion teknik bedre bevarer integriteten og den fysiologiske miljø i MP-leukocytter, i modsætning til slibning og biologisk behandling nærmer sig skader celler, ændre deres morfologi, og inducere produktionen og frigivelsen af ​​forskellige faktorer, der modulerer immun aktivitet og specifikt undertrykker NK cytotoksicitet ^10.

Lungerne er en vigtig målorgan for cancermetastase og til forskellige infektionssygdomme. Alle cirkulerende maligne celler og inficerede celler passerer gennem lungekapillærerne, hvor de skal deformere og interagere med kapillære endotelceller og residente leukocytter. Under disse betingelser, kan cirkulerende celler let målrettes af hjemmehørende MP-leukocytter. Det synes derfor biologisk fordel at have aktiverede leukocytter i denne immun rum, og det er vigtigt at studere denne unikke MP-befolkningen i forskellige biologiske, eksperimentelle og kliniske omgivelser. Det er værd at bemærke, at systemic immunaktivering ved forskellige biologiske respons-modifikatorer (f.eks polyinosin-polycytidylsyre acid (poly I: C) eller type-C CpG-oligodeoxynukleotider (CpG-C ODN)) er blevet vist at aktivere MP-leukocytter mere end cirkulerende leukocytter ^{3, 8,11.}

Protocol

Procedurer, der involverer dyr fag er blevet godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) på Tel-Aviv University.

1. Rat-protokollen

1. Forberedelser
   1. Arrangere 2 butterfly 21 g nåle. Eventuelt forberede 2 stumpe kanter sommerfugl 21 G kanyler ved indgivelse af den skarpe kant af nålen.
   2. Sterilisere kirurgiske værktøjer: 2 par saks, stumpe-kantede pincet, hæmostat, tand-væv pincet steriliseret ved autoklave ved 121 ° C i mindst 30 min på (tør) indstilling tyngdekraften.
   3. Forbered hepariniseret PBS (30 enheder / ml) ved tilsætning af 30 enheder heparin pr ml phosphatpufret saltvand (1x PBS). Brug ved RT. 35 ml er den minimalt volumen nødvendige pr dyr.
   4. Stream hepariniseret PBS i den peristaltiske pumpe linjer og sommerfuglen nåle for at undgå luftbobler.
2. Perfusion af lungerne og indsamling af MP-leukocytter
   1. Aflive dyret ved en overdosis af 8% isofluran. Bekræft dødshjælp ved at overvåge vejrtrækning ophør.
   2. Ved ophør af åndedræt, straks åbne peritoneale og bryst hulrum ved hjælp af steril saks og tand-væv pincet. Udfør en midtlinje abdominal incision langs maven op til formet som et sværd proces.
   3. Løft brystbenet hjælp af pincet, forsigtigt skære brystkassen på begge sider, uden at punktere et indre organ eller store blodkar. Klem et hæmostat på brystbenet, og rostrally fold brystkassen at eksponere kardiopulmonal kompleks.
   4. Sæt en sommerfugl nål ind i højre hjertekammer af hjertet, og inden for ca. et minut indsamle den maksimale mængde af blod i en sprøjte (~ 6 ml fra en 250 g dyr).
   5. Spænd vena cava med en hæmostat at undgå baglæns perfusion af leveren (se Diskussion).
   6. Hold butterfly nål i den højre ventrikel under udskiftningen sprøjten med blodet med udstrømningsrøret af peristaltic pumpe.
   7. Indsætte en anden butterfly nål forbundet til en 5 ml høst sprøjten i den venstre ventrikel, undgå indtrængning af interventrikulære septum.
   8. Tænd den peristaltiske pumpe ved en hastighed på ca. 5 ml / min og forsigtigt indsamle ind i sprøjten de første ml perfusat, der er forurenet med blod. Fortsæt indtil perfusatet farve skifter fra mørk til lys rød. (Kassér blod-forurenede perfuste).
   9. Uden ophør af den peristaltiske pumpe, hurtigt erstatte 5 ml høst sprøjte med en 20 ml sprøjte høst og indsamle 20 ml lunge perfusat anvender en højere hastighed på perfusion (op til 7 ml / min). Løbende overvåge perfusatet flow ind i indsamling sprøjten, og samtidig undgå vakuum formation.
   10. Standse strømmen af ​​den peristaltiske pumpe.
3. leukocytter Extraction
   1. Centrifugeres perfusatet i 10 minutter ved 400 x g.
   2. Aspirere væske.
   3. Tilsæt 10 ml PBS eller medium, centrifugeres ved 400 xg i 10 min, og suge væsken. Gentag dette trin to gange. Anvendelsen af ​​PBS eller medium afhænger deraf følgende anvendelse af prøven.
   4. Der tilsættes 20 ml PBS eller medium, centrifugeres ved 400 xg i 10 min, og indsuge væsken.
   5. Rekonstituer cellerne til den ønskede koncentration, baseret på prøven brug (FACS, PCR, etc.).

2. Mouse-protokollen

1. Forberedelser
   1. Arranger 2 sommerfugl 25 G kanyler. Eventuelt forberede 2 stumpe kanter sommerfugl 25 G kanyler ved indgivelse af den skarpe kant af nålen.
   2. Sterilisere kirurgiske værktøjer: 2 par saks, stumpe-kantede pincet, hæmostat, tand-væv pincet steriliseret ved autoklave ved 121 ° C i mindst 30 min på (tør) indstilling tyngdekraften.
   3. Forbered hepariniseret PBS (30 enheder / ml) ved tilsætning af 30 enheder heparin pr ml 1x PBS-opløsning. Brug ved RT. 25 ml er den minimalt volumen nødvendige pr dyr.
   4. stream hepariniseret PBS i den peristaltiske pumpe linjer og sommerfuglen nåle for at undgå luftbobler.
2. Perfusion af lungerne og indsamling af MP-leukocytter
   1. Aflive dyret ved en overdosis af 8% isofluran. Bekræft dødshjælp ved at overvåge vejrtrækning ophør.
   2. Ved ophør af åndedræt, straks åbne peritoneale og bryst hulrum ved hjælp af steril saks og tand-væv pincet. Udfør en midtlinje abdominal incision langs maven op til formet som et sværd proces.
   3. Løft brystbenet hjælp af pincet, forsigtigt skære brystkassen på begge sider, uden at punktere et indre organ eller store blodkar. Klem et hæmostat på brystbenet, og rostrally fold brystkassen at eksponere kardiopulmonal kompleks.
   4. Spænd vena cava med en hæmostat at undgå baglæns perfusion af leveren (se Diskussion).
   5. Indsætte en butterfly nål forbundet til afgangsrøret af den peristaltiske pumpe ind i den højre ventricle af hjertet, og en anden butterfly nål forbundet til en 2 ml sprøjte høst i den venstre ventrikel af hjertet, avoidingpenetration af interventrikulære septum.
   6. Tænd pumpen til en hastighed på ca. 2 ml / min og indsamle de første ml blod-forurenet perfusat til høstning sprøjten, indtil perfusatet vender sig fra mørke til lys rød (Kassér blod-kontamineret perfuste).
   7. Uden ophør af den peristaltiske pumpe, hurtigt erstatte 2 ml høst sprøjte med en 10 ml sprøjte høst og indsamle 10 ml lunge perfusat anvender en højere hastighed på perfusion (op til 4 ml / min). Løbende overvåge perfusatet flow ind i indsamling sprøjten, og samtidig undgå vakuum formation.
   8. Standse strømmen af ​​den peristaltiske pumpe.
3. leukocytter Extraction
   1. Centrifugeres perfusatet i 10 minutter ved 400 x g.
   2. Aspirere væske.
   3. Tilsæt 10 ml PBS eller medium, centrifugeres ved 400xg i 10 min, og indsuge væsken. Gentag dette trin tre gange. Anvendelsen af ​​PBS eller medium afhænger deraf følgende anvendelse af prøven.
   4. Tilsæt 10 ml PBS eller medium, centrifugeres ved 400 xg i 10 min, og suge væsken.
   5. Rekonstituer cellerne til den ønskede koncentration, baseret på prøven brug (FACS, PCR, etc.).

Representative Results

MP-rum udviser en anden leukocyt delmængde sammensætning i forhold til cirkulerende leukocytter. Ved anvendelse af flowcytometri analyse blev leukocytsubpopulationer identificeret og kvantificeret at karakterisere sammensætningen af ​​både cirkulerende og MP leukocytter. Granulocytter og lymfocytter blev identificeret baseret på forward og side scatters. Inden lymfocytterne blev NKRP-1 ^lyse celler identificeres som NK-celler, CD3 ⁺ T-celler, RM1 ⁺ som monocytter og CD4 ⁺ / CD8 ⁺ / CD25 ⁺ blev anvendt for T celle subpopulationer identifikation. Medfødte immunocytter, herunder granulocytter, monocytter og NK-celler, udgjorde 52% (± 1,52%) af MP-leukocytter population, sammenlignet med 27,9% (± 0,66%) i kredsløbet (p <0,05). Tværtimod T cellesubpopulationer, herunder CD4 ^+, CD4 ⁺ CD8 ⁺ T-celler og regulerende (CD4 ⁺ CD25 ⁺⁾T-celler, såvel som dendritiske celler, udviste lavere procentdele i MP segmentet i forhold til kredsløbet (p <0,005, n = 8). Celleudbytte i MP rum i denne stamme udgør ca. 3 millioner leukocytter (figur 1).

Inden NK-celler, to subpopulationer er indlysende, baseret på cellestørrelse. Ved hjælp af en scatter plot af fremadrettet spredning af NKRP-1 mærkning blev NK-celler opdelt i små og store NK-celler. MP rum udviser en 3 gange højere procentdel af store NK-celler (~ 30%) i forhold til kredsløbet (~ 10%), mens det samlede antal NK-celler er ens (figur 2). Desuden bruger standard 4 timer ^51Cr frigivelsesassay blev NK anti-tumor cytotoksicitet mod flere måltumorceller målt ^8. Kort tid, dette assay vurderer mængden af ^51Cr frigivet fra tumorceller som et resultat af specifik cytotoksicitet ved NK-celles. Evnen hos NK-celler fra MP rum til at lysere tumorceller er større end cirkulerende NK-celler (figur 3), som tydeligt over for både MADB106 syngene cellelinje (figur 3A), og YAC-1 standard cellelinje (figur 3B) . Desuden immunstimulering gennem in vivo poly I: C administration giver en mere dybtgående indvirkning på NK cytotoksicitet MP-NK-celler end på cirkulerende NK-celler, når MADB106 målcellelinie anvendes (figur 3A).

Figur 1. Forskellige leukocyt delmængde sammensætning karakteriserer MP-rum i forhold til omsætning i F344 rotter. I MP rum, er den del af medfødte immunitet større sammenlignet med det tilsvarende i kredsløbet (52% vs. 28%), mens forekomsten af ​​T-celler udviser en modsat forskel (p0; 0,005; n = 8). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Øget procentdel af store NK-celler i MP segmentet i forhold til kredsløbet MP-NK-celler udviste en tre gange højere procentdel af store NK-celler sammenlignet med cirkulerende NK-celler (30% vs. 10%, henholdsvis;. P < 0,05), mens det samlede antal NK-celler er ens. klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3. Højere NK cytotoksicitet i MP rum i forhold til kredsløbet.(A) MADB106 målceller - NK-celler høstet fra MP rum udviste en markant cytotoksicitet mod denne cellelinie, mens cirkulerende NK-celler viser ingen cytotoksicitet In vivo immunstimulering ved poly I:. C øger NK cytotoksicitet i MP rum, men ikke i kredsløbet. (B) YAC-1 målceller - NK-celler høstet fra MP rum udstillet en højere cytotoksicitet i forhold til cirkulerende NK-celler mod denne standard cellelinie. Immun stimulering af poly I: C øger NK cytotoksicitet i både MP rum og cirkulationen. NK celleantal blev kontrolleret for cytotoksicitet vurdering. Data er udtrykt som gennemsnit ± SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Fremgangsmåden er præsenteret heri muliggør selektiv høst og læsning af den unikke population af MP-leukocytter. Sammenlignet med cirkulerende eller milt leukocytter, er MP befolkning kendetegnet ved en særskilt sammensætning leukocytsubpopulationer, højere aktivering niveauer højere frigivelse af forskellige cytokiner, og højere mRNA niveauer af pro- og anti-inflammatoriske cytokiner ^2,3. Specifikt har vi vist, at MP-NK-celler er mere cytotoksiske end kredsløbssygdomme NK-celler mod forskellige målceller ^3,4 og hurtig højere niveauer af interferon-γ. Samlet tyder vore resultater, at MP-NK leukocytter har større cytotoksicitet end cirkulerende NK-celler, og kan således medføre en større biologisk betydning ved styring blodbårne metastaser og lungemetastaser. Derfor bør milt eller cirkulerende leukocytter ikke betragtes som den gyldne standard eller standard befolkning til at reflektere immunologiske status, og humane undersøgelser, der combination udelukkende stole på cirkulerende leukocytter bør fortolkes med forsigtighed. Da forskellige sygdomme specifikt påfører lungerne, immunitet bør undersøges inden dette organ, og MP rummet bør skelnes fra det interstitielle, parenkym, og bronco-alveolære sub-rum, som faktisk er tilfældet ved hjælp af vores perfusion tilgang.

For at sikre succes i denne procedure, er det afgørende at (i) åbne abdominale og brystet hulrum hurtigt efter fuldstændigt ophør af åndedræt, for at opretholde et blodtryk, der muliggør maksimal cardiac blod indsamling, og (ii) at afstå fra en uønsket ekstra perforering af hjertet ventrikel ved anvendelse af stumpe kanter sommerfugl nåle. Et andet centralt hindring er den mulige forurening af blod i lungerne perfusatet. Som de første milliliter lunge perfusat er forurenet med hjerte-blod, skal de kasseres som demonstreret. For at opnå standardisering mellem animals, er kriteriet for at begynde at indsamle MP perfusat baseret på farven overgangen fra mørkerød til lys rød. Desuden anbefales det at fastspænde vena cava med en ikke-savtakket hæmostat, at undgå baglæns perfusion af leveren, især hvis man ønsker at også indsamle marginating leverceller gennem successiv perfusion af leveren. Samtidig med at indsamle perfusatet fra venstre ventrikel, er det afgørende ikke at trænge ind i interventrikulært septum. Endelig har heparin i PBS anvendes til perfusionen er afgørende for at frakoble MP-leukocytter befolkning fra kapillærerne, og derfor skal der anvendes.

Flere fejl kan opstå, når du udfører denne procedure, men de fleste af dem er correctable. Hvis der er en lækage fra indtrængning stedet af nålen ind i hjertet, foreslås det at forsegle den opbrudte hjertemuskel med et stumpt-nosed pincet med savtakkede tips omkring butterfly nål. Hvis en nål glider ud, stop peristaltikpumpen, re-indsætte nålen i sin oprindelige penetration site, og genstart pumpen. Hvis indsamlingen flow ophører, standse indsamle vakuum tryk, flytte nålen i ventrikel, og genstart samlingen. Hvis det venstre atrium er oppustet, og reduceres ikke ved en kontinuerlig indsamling, sænke strømningshastigheden af ​​pumpen. Generelt kan en høj peristaltisk strømningshastighed skade kapillær-dannelse og lungerne kan blive hævet.

Den heri beskrevne fremgangsmåde muliggør en selektiv høst af MP leukocytpopulationen på en relativt enkel procedure. I betragtning af, at denne population udviser unikke egenskaber i sammenligning med leukocytter fra andre immun rum, og at denne population kan have biologisk og klinisk betydning for organismen, foreslår vi at bruge denne metode, når det er muligt, især når de studerer pulmonale-relaterede processer og sygdomme. Det er endnu uvist, om MP celler, som bor i lungerne capillaries på celler høst, har modnet i lungerne, eller om de ville bevare deres karakteristika, når de forlader lungerne. Som leukocytter fra andre rum kan afvige profilen af ​​MP befolkning, og da det ikke er tilgængelig i mennesker, vi foreslår yderligere at udnytte denne metode til at belyse specifikke cirkulerende biomarkører, der korrelerer med de unikke MP egenskaber.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Autoclud Peristaltic pump
Butterfly needle	OMG		26G
Butterfly needle	OMG		21G*3/4"
Syringe	Pic solution		1 ml
Syringe	Pic solution		2.5 ml
Syringe	Pic solution		5 ml
Syringe	Pic solution		10 ml
Syringe	Pic solution		25 ml
Blunted-edged forceps
Scissors
hemostat
Tissue forceps
Heparin sodium porcine mucosa (perservative free)	Sigma Aldrich