Introduction
Leukocyten zich te houden aan de haarvaten van de longen (dat wil zeggen, marginating-pulmonaire (MP) leukocyten) 1 werd aangetoond dat verschillende leukocyten samenstelling en unieke activiteit vertonen in vergelijking met leukocyten uit andere immune compartimenten (bv, circulatie, milt, beenmerg) 2- 4. Bijvoorbeeld, MP-leukocyten vertonen hogere natural killer (NK) cellen cytotoxiciteit tegen verschillende tumorcellen, in vergelijking met circulerende en milt NK-cellen, evenals gedifferentieerde messenger RNA (mRNA) niveaus en verhoogde uitscheiding van pro- en anti-inflammatoire cytokines. De samenstelling van cellen is ook onderscheiden van circulerende leukocyten als MP-leukocyten een hogere verhouding van aangeboren / adaptieve immuniteit in vergelijking met circulerende leukocyten (50% vs. 30%, respectievelijk). Het doel van de werkwijze die hierin wordt selectief oogsten van MP-leukocyten activeren om deze belangrijke en unieke immuuncompartiment (celpopulatie) bestuderen en elucIDATE de impact van verschillende manipulaties (bijvoorbeeld activering van het immuunsysteem) op deze specifieke cellen.
De betekenis van deze unieke populatie begrijpen, is het belangrijk op te merken dat het immuunsysteem regelen circulerende tumorcellen, micrometastasen en residuele ziekte door in vivo functies van celgemedieerde immuniteit (CMI). Dit vermogen blijkt ondanks het precedent falen van het immuunsysteem om de primaire tumor te controleren, en ondersteund door ruime in vivo bewijs kankerpatiënten en diermodellen 5. Belangrijk, deze bevindingen vaak inconsistent met in vitro en ex vivo studies die aangeven dat de meeste autologe tumorcellen resistent tegen cytotoxiciteit van circulerende leukocyten in bloedmonsters van mensen en dieren (gemeten cytotoxiciteit assays) 6,7. Dit verschil kan worden toegeschreven aan de in vivo aanwezigheid van verschillende leukocyt populaties, zoals de hiervoorgenoemde MP leukocytpopulatie en specifiek de subpopulatie van geactiveerde NK-cellen 3. Inderdaad, syngene tumorcellen (MADB106), die bleken resistent tegen circulerende leukocyten en milt zijn, bleken worden gelyseerd door MP-NK-cellen 3,8. Zo is de zogenaamd "NK-resistente 'MADB106 cellen die uitzaaien naar de longen van fischer344 (F344) ratten worden gecontroleerd door MP-NK-cellen, maar niet door het circuleren of milt NK-cellen, die gewoonlijk worden bestudeerd vanwege hun gemakkelijke toegang.
Gezuiverde en actieve MP-leukocyten zijn toegankelijk via de standaard oogstmethodes leukocyten uit de longen, die gebaseerd zijn op longweefsel vermalen of biologische afbraak 9. Onze aanpak heeft twee belangrijke voordelen ten opzichte van weefselverwerking benaderingen. Ten eerste, de perfusie aanpak oogst selectief MP-leukocyten, die hen scheidt van andere cellen die afkomstig zijn van de long parenchymale, interstitiële en broncho-alveolaire compartments. Ten tweede, de perfusie techniek beter behoudt de integriteit en de fysiologische milieu van MP-leukocyten, in tegenstelling tot het malen en biologische verwerking benaderingen die cellen beschadigen, verandering van hun morfologie, en induceren de productie en afgifte van verschillende factoren die het immuunsysteem moduleren en specifiek onderdrukken NK 10 cytotoxiciteit.
De longen zijn een belangrijk doelorgaan voor kanker metastase en verschillende infectieziekten. Alle circulerende maligne cellen en geïnfecteerde cellen passeren de longen haarvaten, waar ze moeten vervormen en interactie met capillaire endotheelcellen en resident leukocyten. Onder deze omstandigheden kunnen circulerende cellen gemakkelijk worden gericht op resident MP-leukocyten. Het lijkt derhalve gunstig biologisch geactiveerde leukocyten in deze immuuncompartiment, en het is belangrijk om deze unieke MP-populatie studie in verschillende biologische, experimentele en klinische settings. Het is het waard om op te merken dat systemic immune activering door verschillende biologische-respons-modificatoren (bijvoorbeeld polyinosinic-polycytidylic acid (poly I: C) Soort-C CpG oligonucleotiden (CpG-C ODN)) is aangetoond dat MP-leukocyten meer dan circulerende leukocyten 3 activeren 8,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedures waarbij proefdieren zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van Tel-Aviv University.
1. Protocol Rat
- voorbereidingen
- Schik 2 vlinder 21 G naalden. Eventueel, voor te bereiden 2-botte kanten vlinder 21 G naalden door het indienen van de scherpe rand van de naald.
- Steriliseren chirurgische instrumenten: 2 scharen, forceps afgestompte randen, hemostaat, tand-weefsel forceps gesteriliseerd door autoclaaf bij 121 ° C gedurende ten minste 30 min de zwaartekracht (droog) instelling.
- Bereid PBS met heparine (30 eenheden / ml) door toevoeging van 30 eenheden heparine per ml met fosfaat gebufferde zoutoplossing (1x PBS) oplossing. Gebruik bij RT. 35 ml is de minimaal benodigde volume per dier.
- Streamen gehepariniseerde PBS in de peristaltische pomp lijnen en de vlinder naalden om luchtbellen te voorkomen.
- Perfusie van de longen en het verzamelen van MP-leukocyten
- Euthanaseren het dier door een overdosis van 8% isofluraan. Bevestig euthanasie door bewaking ademhaling stoppen.
- Na stopzetting van de ademhaling, onmiddellijk openen de peritoneale en borstholte met behulp van de steriele schaar en tand-tissue tang. Voer een middenlijn abdominale incisie langs de buik naar de processus xiphoideus.
- Til het borstbeen met behulp van de tang, voorzichtig het snijden van de ribbenkast aan beide zijden, zonder aanprikken van een inwendig orgaan of grote bloedvaten. Klem een hemostaat op het borstbeen en rostraal vouw de ribbenkast naar de cardiopulmonale complex bloot te leggen.
- Plaats een vlindernaald in de rechter ventrikel van het hart en binnen ongeveer een minuut verzamelen van de maximale hoeveelheid bloed in een spuit (~ 6 ml van een 250 g dier).
- Klem de vena cava met een hemostaat achteruit perfusie van de lever (zie bespreking) voorkomen.
- Houd de vlinder naald binnen de rechter ventrikel, terwijl het vervangen van de spuit met het bloed met de uitstroom pijp van de peristaltic pomp.
- Plaats een tweede vlinder naald aangesloten op een 5 ml oogsten spuit in de linker ventrikel, het vermijden van de penetratie van het septum interventriculare.
- Schakel de peristaltische pomp met een snelheid van ongeveer 5 ml / min en voorzichtig verzamelen in de spuit de eerste milliliters perfusievloeistof die zijn verontreinigd met bloed. Ga door tot het perfusaat kleur verandert van donker tot licht rood. (Gooi de met bloed verontreinigde perfuste).
- Zonder stopzetten van de peristaltische pomp, snel vervangen 5 ml oogsten spuit met een 20 ml spuit oogsten en laat 20 ml long perfusaat gebruik van een hogere snelheid van perfusie (tot 7 ml / min). Permanent toezicht op het perfusaat stroom in het verzamelen spuit, terwijl het vermijden van de vorming van vacuüm.
- Stoppen van de stroom van de peristaltische pomp.
- leukocyten Extraction
- Centrifugeer de perfusaat gedurende 10 min bij 400 xg.
- Zuig het medium.
- Voeg 10 ml PBS of medium, centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min, en zuig de vloeistof. Herhaal deze stap twee keer. Het gebruik van PBS of medium afhankelijk van het consequente gebruik van het monster.
- Voeg 20 ml PBS of medium, centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min, en zuig de vloeistof.
- Reconstitueren de cellen tot de gewenste concentratie, gebaseerd op de samplegebruik (FACS, PCR, etc.).
2. Mouse Protocol
- voorbereidingen
- Schik 2 vlinder 25 G naalden. Eventueel, voor te bereiden 2-botte kanten vlinder 25 G naalden door het indienen van de scherpe rand van de naald.
- Steriliseren chirurgische instrumenten: 2 scharen, forceps afgestompte randen, hemostaat, tand-weefsel forceps gesteriliseerd door autoclaaf bij 121 ° C gedurende ten minste 30 min de zwaartekracht (droog) instelling.
- Bereid PBS met heparine (30 eenheden / ml) door toevoeging van 30 eenheden heparine per ml 1x PBS oplossing. Gebruik bij RT. 25 ml is de minimaal benodigde volume per dier.
- Streben gehepariniseerde PBS in de peristaltische pomp lijnen en de vlinder naalden om luchtbellen te voorkomen.
- Perfusie van de longen en het verzamelen van MP-leukocyten
- Euthanaseren het dier door een overdosis van 8% isofluraan. Bevestig euthanasie door bewaking ademhaling stoppen.
- Na stopzetting van de ademhaling, onmiddellijk openen de peritoneale en borstholte met behulp van de steriele schaar en tand-tissue tang. Voer een middenlijn abdominale incisie langs de buik naar de processus xiphoideus.
- Til het borstbeen met behulp van de tang, voorzichtig het snijden van de ribbenkast aan beide zijden, zonder aanprikken van een inwendig orgaan of grote bloedvaten. Klem een hemostaat op het borstbeen en rostraal vouw de ribbenkast naar de cardiopulmonale complex bloot te leggen.
- Klem de vena cava met een hemostaat achteruit perfusie van de lever (zie bespreking) voorkomen.
- Plaats een vlindernaald verbonden met de uitstroompijp van de peristaltische pomp naar rechts ventricle van het hart, en een tweede vlinder naald aangesloten op een 2 ml oogsten spuit in de linker ventrikel van het hart, avoidingpenetration van de interventriculare septum.
- Schakel de pomp op een snelheid van ongeveer 2 ml / minuut; de eerste milliliters bloed besmet perfusaat in de oogst spuit totdat het perfusaat wordt van donker tot licht rood (Gooi het bloed verontreinigde perfuste).
- Zonder stopzetten van de peristaltische pomp, snel vervangen 2 ml oogsten spuit met een 10 ml injectiespuit oogsten en laat 10 ml long perfusaat gebruik van een hogere snelheid van perfusie (tot 4 ml / min). Permanent toezicht op het perfusaat stroom in het verzamelen spuit, terwijl het vermijden van de vorming van vacuüm.
- Stoppen van de stroom van de peristaltische pomp.
- leukocyten Extraction
- Centrifugeer de perfusaat gedurende 10 min bij 400 xg.
- Zuig het medium.
- Voeg 10 ml PBS of medium, centrifuge bij 400xg gedurende 10 min, en zuig de vloeistof. Herhaal deze stap drie keer. Het gebruik van PBS of medium afhankelijk van het consequente gebruik van het monster.
- Voeg 10 ml PBS of medium, centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min, en zuig de vloeistof.
- Reconstitueren de cellen tot de gewenste concentratie, gebaseerd op de samplegebruik (FACS, PCR, etc.).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De MP-compartiment vertonen een andere leukocyten deelverzameling samenstelling ten opzichte van circulerende leukocyten. Gebruikt flowcytometrie analyse werden leukocytsubpopulaties geïdentificeerd en gekwantificeerd aan de samenstelling van zowel circulerende leukocyten en MP karakteriseren. Granulocyten en lymfocyten werden geïdentificeerd op basis van voorwaartse en zijwaartse verstrooit. Binnen de lymfocyten werden NKRP-1 heldere cellen geïdentificeerd als NK-cellen CD3 + zoals T-cellen, monocyten RM1 + en CD4 + / CD8 + / CD25 + werden gebruikt voor T-cel subpopulaties identificatie. Aangeboren immunocyten, zoals granulocyten, monocyten en NK-cellen, vormden 52% (± 1,52%) van de MP-leukocyten populatie, in vergelijking met 27,9% (± 0,66%) in de circulatie (p <0,05). Integendeel, de T-cel subpopulaties, waaronder CD4 +, CD4 + CD8 + T-cellen en regulerende (CD4 + CD25 +)T-cellen en dendritische cellen, vertoonden lagere percentages in de MP compartiment ten opzichte van de omloop (p <0,005; n = 8). Celopbrengst in de MP compartiment van deze stam vormt van ongeveer 3 miljoen leukocyten (Figuur 1).
In NK cellen, twee subpopulaties zijn duidelijk gebaseerd op celgrootte. Met behulp van een scatter plot van voorwaartse verstrooiing door NKRP-1 labeling, werden NK-cellen verdeeld in kleine en grote NK-cellen. De MP compartiment vertoont een 3-voudig hoger percentage grote NK-cellen (~ 30%) ten opzichte van de omloop (~ 10%), terwijl het totale aantal NK cellen vergelijkbaar (figuur 2). Bovendien, met de standaard 4 uur 51Cr afgifte assay NK anti-tumor cytotoxiciteit tegen verschillende doelwit tumorcellen werd gemeten 8. Kort, deze test beoordeelt de hoeveelheid 51Cr afgegeven uit tumorcellen als gevolg van specifieke cytotoxiciteit door NK-cellens. Het vermogen van NK cellen uit de MP compartiment tumorcellen lyseren groter dan circulerende NK cellen (figuur 3), zoals duidelijk tegen zowel de MADB106 syngene cellijn (Figuur 3A) en de YAC-1 standaard cellijn (Figuur 3B) . Bovendien, het immuunsysteem stimuleren door middel van in-vivo-poly I: C administratie zorgt voor een meer diepgaande invloed op NK cytotoxiciteit van MP-NK-cellen dan op circulerende NK-cellen bij MADB106 doel cellijn wordt gebruikt (figuur 3A).
Figuur 1. De verschillende leukocyten deelverzameling samenstelling is kenmerkend voor de MP-compartiment in vergelijking met de circulatie in F344 ratten. In de MP compartiment, is de fractie van aangeboren immuniteit groter dan bij het equivalent in de circulatie (52% vs. 28%), terwijl de prevalentie van T-cellen vertonen een tegengestelde verschil (p0, 0,005; n = 8). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Verhoogde percentage grote NK-cellen in de MP compartiment ten opzichte van de circulatie MP-NK-cellen vertoonden een drievoudig hoger percentage grote NK-cellen in vergelijking met circulerende NK cellen (30% vs. 10%, respectievelijk. P < 0,05), terwijl het totale aantal NK-cellen is vergelijkbaar. klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Hogere NK cytotoxiciteit in de MP compartiment ten opzichte van de circulatie.(A) MADB106 doelcellen - NK-cellen geoogst uit de MP compartiment vertoonden een duidelijke cytotoxiciteit tegen deze cellijn, terwijl circulerende NK-cellen vertonen geen cytotoxiciteit In vivo immuun stimulatie door poly I:. C verhoogt NK cytotoxiciteit in de MP compartiment, maar niet in de circulatie. (B) YAC-1 doelcellen - NK-cellen geoogst uit de MP compartiment vertoonde een hogere cytotoxiciteit in vergelijking met circulerende NK cellen tegen deze norm cellijn. Immuunstimulatie door poly I: C verhoogt NK cytotoxiciteit in zowel de MP compartiment en de bloedsomloop. NK-cel aantallen werden gecontroleerd op cytotoxiciteit beoordeling. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De werkwijze die hierin gepresenteerde maakt het selectief oogsten en het bestuderen van de unieke populatie van MP-leukocyten. Vergeleken met circulerende leukocyten of milt, de MP populatie karakteristiek met bijzondere samenstelling van leukocytsubpopulaties, hogere activeringsniveaus, hogere afgifte van verscheidene cytokinen en hogere mRNA niveaus van pro- en anti-inflammatoire cytokines 2,3. Specifiek hebben we aangetoond dat MP-NK-cellen zijn cytotoxischer dan bloedsomloop NK cellen tegen verschillende doelwitcellen 3,4 en een automatische hogere niveaus van interferon-γ. Overall, onze resultaten suggereren dat MP-NK leukocyten een grotere cytotoxiciteit dan circulerende NK cellen, en kan dus een grotere biologische betekenis beheersen door bloed overgebrachte metastasen longmetastasen impliceren. Daarom moet milt of circulerende leukocyten niet worden beschouwd als de gouden standaard of default populatie voor het reflecteren immunologische status en menselijke studies die comgaans alleen vertrouwen op circulerende leukocyten moet voorzichtig worden geïnterpreteerd. Zoals verschillende ziekten specifiek toebrengen de longen, immuniteit worden bestudeerd in dit orgaan en de MP compartiment moet worden onderscheiden van de interstitiële, parenchymale en wild-alveolaire deelcompartimenten, zoals ook het geval is met behulp van onze benadering perfusie.
Om het succes van deze procedure te waarborgen, is het cruciaal om (i) open de buik- en borstholte snel na volledige stopzetting van de ademhaling, een bloeddruk maximale cardiale bloedinzameling maakt te behouden en (ii) hij een ongewenste bijkomende perforatie van de hartkamer door middel van stompe randen vlinder naalden. Een ander belangrijk obstakel is de mogelijke besmetting van het bloed in de longen perfusaat. Als eerste milliliters long perfusievloeistof zijn verontreinigd met cardiale bloed, moeten ze worden weggegooid als aangetoond. Om standaardisatie tussen ani bereikenmals, het criterium gaan verzamelen de MP perfusaat is gebaseerd op de kleurovergang van donkerrood tot lichtrood. Bovendien wordt aanbevolen om de vena cava te klemmen met een niet-getande hemostaat achterwaartse perfusie van de lever voorkomen, vooral wanneer men wenst te verzamelen ook marginating levercellen door opeenvolgende perfusie van de lever. Bereikt, waarbij het perfusaat in de linker hartkamer, is het cruciaal het septum niet doordringen. Ten slotte heparine in PBS voor de perfusie is cruciaal voor het loskoppelen van de MP-leukocyten populatie van de haarvaten, en moet worden gebruikt.
Verschillende storingen kunnen optreden bij het uitvoeren van deze procedure, maar de meeste van hen zijn te corrigeren. Als er een lekkage uit de penetratie plaats van de naald in het hart, wordt voorgesteld om de gescheurde hartspier af te dichten met behulp van een stompe neus tang met gekartelde tips rond de vlinder naald. Als een naald glipt uit, stop de peristaltische pomp, re-steek de naald in zijn oorspronkelijke penetratie site, en de pomp opnieuw te starten. Als collectie stroming ophoudt, stopzetting van het verzamelen van onderdruk, verplaats de naald binnen de ventrikel, en de collectie opnieuw te starten. Als het linker atrium wordt opgeblazen en wordt niet verminderd door een continue verzameling, lager de stroomsnelheid van de pomp. In het algemeen kan een hoge peristaltische debiet de vorming capillaire schaden, en de longen kan opzwellen.
De hierin beschreven werkwijze maakt een selectief oogsten van de MP leukocytpopulatie in een relatief eenvoudige procedure. Aangezien deze populatie vertoont unieke eigenschappen in vergelijking met leukocyten uit andere immune compartimenten, en dat deze populatie biologische en klinische belang voor het organisme zijn, stellen we het gebruik van deze werkwijze waar mogelijk, vooral bij het bestuderen-pulmonaire processen en ziekten. Het is nog niet bekend of MP cellen, die in de longen capill verblijvenaries op cellen oogsten, gerijpt in de longen, of dat ze hun kenmerken bij het verlaten van de longen zou handhaven. Zoals leukocyten uit andere compartimenten mag het profiel van de MP bevolking weerspiegelen, en aangezien het niet toegankelijk bij mensen suggereren verder we gebruik van deze methode om specifieke circulerende biomarkers die correleren met de unieke eigenschappen MP helderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs en dit werk werd ondersteund door NIH / NCI subsidie # R01CA172138 (tot SBE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclud Peristaltic pump | |||
| Butterfly needle | OMG | 26G | |
| Butterfly needle | OMG | 21G*3/4" | |
| Syringe | Pic solution | 1 ml | |
| Syringe | Pic solution | 2.5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 10 ml | |
| Syringe | Pic solution | 25 ml | |
| Blunted-edged forceps | |||
| Scissors | |||
| hemostat | |||
| Tissue forceps | |||
| Heparin sodium porcine mucosa (perservative free) | Sigma Aldrich |
References
- Kuebler, W. M., Goetz, A. E.
- Benish, M., et al. The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics. Immunol Res. 58, 28-39 (2014).
- Melamed, R., et al. The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells. J Immunother. 33, 16-29 (2010).
- Shakhar, G., et al. Amelioration of operation-induced suppression of marginating pulmonary NK activity using poly IC: a potential approach to reduce postoperative metastasis. Ann Surg Oncol. 14, 841-852 (2007).
- Smyth, M. J., Godfrey, D. I., Trapani, J. A. A fresh look at tumor immunosurveillance and immunotherapy. Nat Immunol. 2, 293-299 (2001).
- Talmadge, J. E., Meyers, K. M., Prieur, D. J., Starkey, J. R. Role of NK cells in tumour growth and metastasis in beige mice. Nature. 284, 622-624 (1980).
- Grimm, E. A., Mazumder, A., Zhang, H. Z., Rosenberg, S. A. Lymphokine-activated killer cell phenomenon. Lysis of natural killer-resistant fresh solid tumor cells by interleukin 2-activated autologous human peripheral blood lymphocytes. J Exp Med. 155, 1823-1841 (1982).
- Melamed, R., et al. Marginating pulmonary-NK activity and resistance to experimental tumor metastasis: suppression by surgery and the prophylactic use of a beta-adrenergic antagonist and a prostaglandin synthesis inhibitor. Brain Behav Immun. 19, 114-126 (2005).
- O'Dea, K. P., et al. Lung-marginated monocytes modulate pulmonary microvascular injury during early endotoxemia. Am J Respir Crit Care Med. 172, 1119-1127 (2005).
- Sorski, L., Melamed, R., Ben-Eliyahu, A unique role for marginating-pulmonary and marginating-hepatic NK cells in cancer anti-metastatic surveillance and in immunotherapy. Annual Meeting of the Psychoneuroimmunology Research Society, Philadelphia, USA.(2014, , (2014).
- Levi, B., et al. Continuous stress disrupts immunostimulatory effects of IL-12). Brain Behav Immun. 25, 727-735 (2011).
