Introduction
Leucocytes adhérant aux capillaires des poumons ( par exemple, marginating-pulmonaire (MP) leucocytes) 1 ont été montrées pour présenter la composition leucocytaire distincte et une activité unique par rapport aux leucocytes d'autres compartiments immunitaires (par exemple, la circulation, de la rate, la moelle osseuse) 2- 4. Par exemple, exposition MP-leucocytes plus tueuses naturelles (cellules NK) cytotoxicité contre les cellules tumorales différentes, par rapport à circulants et spléniques cellules NK, ainsi que l'ARN messager différencié (ARNm) niveaux et augmentation de la sécrétion de cytokines pro- et anti-inflammatoires. La composition des cellules est également différenciée des leucocytes circulants comme MP-leucocytes ont un rapport plus élevé de l'immunité innée / adaptative par rapport aux leucocytes circulants (50% contre 30%, respectivement). L'objectif de la méthode présentée ici est de permettre la récolte sélective de MP-leucocytes, afin d'étudier ce compartiment immunitaire important et unique (population cellulaire), et elucIDATE l'impact des diverses manipulations (par exemple, l' activation immunitaire) sur ces cellules spécifiques.
Pour comprendre l'importance de cette population unique, il est important de noter que le système immunitaire peut contrôler les cellules tumorales circulantes, des micrométastases et des maladies résiduelles par des fonctions in vivo de l' immunité à médiation cellulaire (CMI). Cette capacité est évidente malgré l'échec précédent du système immunitaire pour contrôler la tumeur primaire, et amplement étayée par des preuves in vivo chez des patients cancéreux et des modèles animaux 5. Surtout, ces résultats sont souvent incompatibles avec in vitro et ex vivo études qui rapportent que la plupart des cellules tumorales autologues sont résistantes à la cytotoxicité par la circulation des leucocytes dans des échantillons de sang chez les humains et les animaux (mesuré par les essais de cytotoxicité) 6,7. Cet écart peut être attribué à l'existence in vivo des populations leucocytaires distincts, tels que mentionnés ci lesusmentionné population leucocytaire MP, et plus particulièrement son sous - population de cellules NK activées 3. En effet, les cellules tumorales syngéniques (de MADB106), qui se sont révélés être résistants à la circulation et les leucocytes spléniques, se sont révélés être lysées par les cellules NK-MP 3,8. Ainsi, les cellules prétendument «NK» résistantes MADB106 qui produisent des métastases aux poumons de fischer344 (F344), les rats sont contrôlés par des cellules NK-MP, mais pas par circulation ou des cellules NK spléniques qui sont couramment étudiées compte tenu de leur facilité d'accès.
MP-leucocytes purifiés actifs et ne sont pas accessibles par les méthodes classiques de récolte de leucocytes dans les poumons, qui sont basés sur un broyage du tissu pulmonaire ou la dégradation biologique 9. Notre approche présente deux avantages majeurs par rapport aux approches de traitement des tissus. Tout d'abord, la méthode de perfusion récolte sélective MP-leucocytes, en les séparant des autres cellules qui proviennent du parenchyme pulmonaire interstitielle et compar broncho-alvéolairetments. En second lieu, la meilleure technique de perfusion préserve l'intégrité et le milieu physiologique de la MP-leucocytes, à la différence du broyage et le traitement biologique des approches qui endommagent les cellules, modifier leur morphologie et induisent la production et la libération de divers facteurs qui modulent l'activité immunitaire et plus particulièrement répriment NK 10 cytotoxicité.
Les poumons sont un organe cible majeure pour les métastases du cancer et pour diverses maladies infectieuses. Toutes les cellules cancéreuses circulantes et des cellules infectées passent à travers les capillaires pulmonaires où ils ont besoin de se déformer et d'interagir avec des cellules endothéliales capillaires et les leucocytes résidents. Dans ces conditions, les cellules circulantes peuvent être facilement ciblés par MP-leucocytes résidents. Il semble donc intéressant de disposer biologiquement leucocytes activés dans ce compartiment immunitaire, et il est important d'étudier cette MP-population unique dans différents milieux biologiques, expérimentaux et cliniques. Il est digne de noter que syl' activation stemic immunitaire par divers-réponse modificateurs biologiques (par exemple l' acide polyinosinique-polycytidylique (poly I: C) ou de type C CpG ODN (CpG-C ODN)) ont été montrés pour activer MP-leucocytes plus de leucocytes circulants 3, 8,11.
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Protocol
Les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par le Comité soin et l'utilisation institutionnelle des animaux (IACUC) à l'Université de Tel-Aviv.
1. Protocole Rat
- Les préparatifs
- Disposer 2 papillon 21 G aiguilles. Eventuellement, préparer 2 contondants tranchant papillon 21 G aiguilles en déposant le tranchant de l'aiguille.
- Stériliser outils chirurgicaux: 2 paires de ciseaux, une pince émoussée tranchant, hémostatique, pinces à dents tissus stérilisés par autoclave à 121 ° C pendant au moins 30 minutes sur la gravité paramètre (sec).
- Préparer du PBS héparinisé (30 unités / ml) par addition de 30 unités d'héparine par ml de tampon phosphate salin (1 x PBS). Utilisez à la température ambiante. 35 ml est le volume minimal nécessaire par animal.
- PBS héparinisé flux dans les conduites de la pompe péristaltique et les aiguilles de papillon pour éviter les bulles d'air.
- Perfusion des Poumons et Collection de MP-leucocytes
- Euthanasier l'animal par une surdose de 8% isoflurane. Confirmer l'euthanasie par la respiration de surveillance cessation.
- Lors de la cessation de la respiration, ouvrir immédiatement les cavités péritonéale et à la poitrine à l'aide des ciseaux stériles et des pinces à dents tissus. Effectuer une incision abdominale médiane le long de l'abdomen jusqu'à la pointe du sternum.
- Soulevez le sternum à l'aide de la pince, coupe prudemment la cage thoracique des deux côtés, sans perforer un organe interne ou les gros vaisseaux sanguins. Fixer un hémostatique sur le sternum, et rostrale fois la cage thoracique afin d'exposer le complexe cardiorespiratoire.
- Insérez une aiguille papillon dans le ventricule droit du cœur, et dans environ une minute recueillir le volume maximal de sang dans une seringue (~ 6 ml de 250 g animal).
- Fixer la veine cave avec un hémostatique pour éviter perfusion arrière du foie (voir Discussion).
- Tenez l'aiguille de papillon dans le ventricule droit en remplaçant la seringue contenant le sang avec le tuyau d'écoulement de la ppompe eristaltic.
- Insérer une deuxième aiguille papillon relié à une seringue de 5 ml de récolte dans le ventricule gauche, ce qui évite la pénétration du septum interventriculaire.
- Allumez la pompe péristaltique à une vitesse d'environ 5 ml / min et de recueillir doucement dans la seringue les premiers millilitres de perfusat qui sont contaminés par du sang. Continuez jusqu'à ce que la couleur perfusat vire du noir au rouge pâle. (Jeter la perfuste de sang contaminé).
- Sans arrêt de la pompe péristaltique, à remplacer rapidement la seringue de 5 ml de récolte avec une seringue 20 ml de récolte et de recueillir 20 ml de liquide de perfusion pulmonaire en utilisant une plus grande vitesse de perfusion (jusqu'à 7 ml / min). surveiller en continu le flux de perfusat dans la seringue de collecte, tout en évitant la formation de vide.
- Cesser l'écoulement de la pompe péristaltique.
- leucocytes Extraction
- Centrifuger le liquide de perfusion pendant 10 minutes à 400 x g.
- Aspirer le liquide.
- Ajouter 10 ml de PBS ou moyen, centrifuger à 400 g pendant 10 min, et aspirer le liquide. Répéter deux fois cette étape. L'utilisation de PBS ou de milieu dépend de l'utilisation conséquente de l'échantillon.
- Ajouter 20 ml de PBS ou moyen, centrifuger à 400 g pendant 10 min, et aspirer le liquide.
- Reconstituer les cellules à la concentration voulue, en fonction de l'utilisation de l' échantillon ( par FACS, la PCR, etc.).
2. Protocole de souris
- Les préparatifs
- Disposer 2 papillon 25 G aiguilles. Eventuellement, préparer 2 contondants tranchant papillon 25 G aiguilles en déposant le tranchant de l'aiguille.
- Stériliser outils chirurgicaux: 2 paires de ciseaux, une pince émoussée tranchant, hémostatique, pinces à dents tissus stérilisés par autoclave à 121 ° C pendant au moins 30 minutes sur la gravité paramètre (sec).
- Préparer du PBS héparinisé (30 unités / ml) par addition de 30 unités d'héparine par ml de solution PBS 1x. Utilisez à la température ambiante. 25 ml est le volume minimal nécessaire par animal.
- Stream PBS héparinisé dans les lignes de pompe péristaltique et les aiguilles de papillon pour éviter les bulles d'air.
- Perfusion des Poumons et Collection de MP-leucocytes
- Euthanasier l'animal par une surdose de 8% isoflurane. Confirmer l'euthanasie par la respiration de surveillance cessation.
- Lors de la cessation de la respiration, ouvrir immédiatement les cavités péritonéale et à la poitrine à l'aide des ciseaux stériles et des pinces à dents tissus. Effectuer une incision abdominale médiane le long de l'abdomen jusqu'à la pointe du sternum.
- Soulevez le sternum à l'aide de la pince, coupe prudemment la cage thoracique des deux côtés, sans perforer un organe interne ou les gros vaisseaux sanguins. Fixer un hémostatique sur le sternum, et rostrale fois la cage thoracique afin d'exposer le complexe cardiorespiratoire.
- Fixer la veine cave avec un hémostatique pour éviter perfusion arrière du foie (voir Discussion).
- Insérez une aiguille papillon reliée à la conduite d'évacuation de la pompe péristaltique dans le droit êmetricle du coeur, et une deuxième aiguille papillon relié à une seringue de 2 ml de récolte dans le ventricule gauche du cœur, avoidingpenetration du septum interventriculaire.
- Mettez la pompe à une vitesse d'environ 2 ml / min et de recueillir les premiers millilitres de perfusat de sang contaminé dans la seringue de récolte jusqu'à ce que le perfusat vire du noir au rouge pâle (Jeter la perfuste de sang contaminé).
- Sans arrêt de la pompe péristaltique, à remplacer rapidement la seringue 2 ml de récolte avec une seringue 10 ml de récolte et de recueillir 10 ml de liquide de perfusion pulmonaire en utilisant une plus grande vitesse de perfusion (jusqu'à 4 ml / min). surveiller en continu le flux de perfusat dans la seringue de collecte, tout en évitant la formation de vide.
- Cesser l'écoulement de la pompe péristaltique.
- leucocytes Extraction
- Centrifuger le liquide de perfusion pendant 10 minutes à 400 x g.
- Aspirer le liquide.
- Ajouter 10 ml de PBS ou moyen, centrifugeuse à 400g pendant 10 min, et aspirer le fluide. Répétez cette étape trois fois. L'utilisation de PBS ou de milieu dépend de l'utilisation conséquente de l'échantillon.
- Ajouter 10 ml de PBS ou moyen, centrifuger à 400 g pendant 10 min, et aspirer le liquide.
- Reconstituer les cellules à la concentration voulue, en fonction de l'utilisation de l' échantillon ( par FACS, la PCR, etc.).
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Representative Results
L'exposition MP-compartiment une composition leucocyte sous-ensemble différent par rapport aux leucocytes circulants. En utilisant une analyse de cytométrie en flux, les sous-populations leucocytaires ont été identifiés et quantifiés pour caractériser la composition à la fois en circulation et MP leucocytes. Les granulocytes et les lymphocytes ont été identifiés sur la base avant et latérales éparpillements. Dans les lymphocytes, NKRP-1 des cellules lumineuses ont été identifiées comme des cellules NK, CD3 + que les cellules T, RM1 + comme les monocytes et les lymphocytes CD4 + / CD8 + / CD25 + ont été utilisés pour T sous - populations de cellules identification. immunocytes innés, y compris les granulocytes, les monocytes et les cellules NK, constituaient 52% (± 1,52%) de la population des leucocytes MP, par rapport à 27,9% (± 0,66%) dans la circulation (p <0,05). Par contre, les sous - populations de cellules T CD4 +, y compris, les cellules CD4 + T CD8 + et de régulation (CD4 + CD25 +)les lymphocytes T, ainsi que des cellules dendritiques, présentaient des pourcentages plus faibles dans le compartiment MP par rapport à la circulation (p <0,005; n = 8). Le rendement des cellules dans le compartiment MP de cette souche constituent d'environ 3 millions de leucocytes (figure 1).
Dans les cellules NK, deux sous-populations sont évidentes, sur la base de la taille des cellules. L'utilisation d'un nuage de points de diffusion vers l'avant par NKRP-1 étiquetage, les cellules NK ont été divisés en cellules petites et grandes NK. Le compartiment MP présente un pourcentage de 3 fois plus élevé de grandes cellules NK (~ 30%) par rapport à la circulation (~ 10%), tandis que le nombre total de cellules NK est similaire (Figure 2). En outre, en utilisant la 4 h 51Cr essai de libération standard de cytotoxicité antitumorale NK contre plusieurs cellules tumorales cibles a été mesurée 8. Peu de temps, ce test évalue la quantité de 51Cr libéré par les cellules tumorales en raison de la cytotoxicité spécifique de cellules NKs. La capacité des cellules NK à partir du compartiment MP pour lyser des cellules tumorales est supérieure à circuler des cellules NK (Figure 3), comme le montre à la fois contre la MADB106 lignée de cellules syngéniques (figure 3A), et la lignée cellulaire standard YAC-1 (figure 3B) . En outre, la stimulation immunitaire par in vivo poly I: l' administration de C produit un impact plus profond sur NK cytotoxicité des cellules NK-MP que sur circulation des cellules NK lorsque la ligne de la cellule cible de MADB106 est utilisé (figure 3A).
Figure 1. Composition de leucocyte sous - ensemble différent caractérise le MP-compartiment par rapport à la circulation chez les rats F344. Dans le compartiment MP, la fraction de l'immunité innée est plus grande par rapport à son équivalent en circulation (52% contre 28%), alors que la fréquence des cellules T présentent une différence opposée (p0; 0,005; n = 8). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Augmentation du pourcentage de grosses cellules NK dans le compartiment MP par rapport à la circulation des cellules MP-NK ont montré une à trois fois plus grand pourcentage de grosses cellules NK par rapport à la circulation des cellules NK (30% contre 10%, respectivement. P < 0,05), tandis que le nombre total de cellules NK est similaire. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. supérieur NK cytotoxicité dans le compartiment MP par rapport à la circulation.(A) MADB106 cellules cibles - les cellules NK récoltées à partir du compartiment MP présentent une cytotoxicité marquée contre cette lignée cellulaire, tandis que les cellules NK en circulation ne présentent pas de cytotoxicité in vivo la stimulation immunitaire par le poly I:. C augmente la cytotoxicité des NK dans le compartiment MP, mais pas dans la circulation. (B) cellules YAC-1 cibles - les cellules NK récoltées dans le compartiment MP présentait une cytotoxicité plus élevée par rapport à la circulation des cellules NK contre cette lignée cellulaire standard. stimulation immunitaire par poly I: C augmente NK cytotoxicité à la fois le compartiment MP et la circulation. le nombre de cellules NK ont été contrôlés pour l'évaluation de la cytotoxicité. Les données sont exprimées en moyenne ± SEM. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
La méthode présentée ici permet la récolte sélective et à l'étude de la population unique de MP-leucocytes. Par rapport à la circulation des leucocytes ou splénique, la population de MP se caractérise par une composition distincte de sous - populations leucocytaires, les niveaux plus élevés d'activation, la libération ultérieure de diverses cytokines et des niveaux plus élevés d' ARNm de cytokines pro- et anti-inflammatoires 2,3. Plus précisément, nous avons montré que les cellules NK-MP sont plus cytotoxiques que les cellules NK circulatoires contre diverses cellules cibles 3,4 et expriment des niveaux plus élevés d'interféron-γ. Dans l'ensemble, nos résultats suggèrent que les leucocytes MP-NK ont une plus grande cytotoxicité que circulants cellules NK, et peut donc impliquer une signification biologique plus grande dans le contrôle des métastases par le sang et les métastases pulmonaires. Par conséquent, les leucocytes spléniques ou circulants ne devraient pas être considérés comme l'étalon-or ou de la population par défaut pour réfléchir le statut immunologique, et les études humaines qui comcouramment compter uniquement sur leucocytes circulants doivent être interprétés avec prudence. En outre, comme diverses maladies infligent spécifiquement les poumons, l'immunité doit être étudiée au sein de cet organe, et le compartiment MP doit être distinguée de l'interstitiel, parenchymateuse, et les sous-compartiments bronco-alvéolaire, est aussi bien le cas en utilisant notre approche de perfusion.
Pour assurer le succès de cette procédure, il est crucial de (i) ouvrir l'abdomen et des cavités thoraciques rapidement après l'arrêt complet de la respiration, de maintenir une pression sanguine qui permet la collecte maximale de sang cardiaque, et (ii) à ne pas un montant supplémentaire indésirable perforation du ventricule du coeur à l'aide d'aiguilles émoussées papillon tranchant. Un autre obstacle majeur est le risque de contamination du sang dans le liquide de perfusion du poumon. Comme les premiers millilitres de perfusat du poumon sont contaminés par du sang cardiaque, ils doivent être jetés comme l'a démontré. Pour parvenir à la normalisation entre les animals, le critère de commencer à recueillir le perfusat MP est basée sur la transition de couleur du rouge foncé au rouge pâle. En outre, il est recommandé de fixer la veine cave avec un hémostatique non en dents de scie, afin d' éviter la perfusion rétrograde du foie, surtout si l' on veut recueillir aussi les cellules hépatiques marginating par perfusion successive du foie. Lors de la collecte du perfusat du ventricule gauche, il est crucial de ne pas pénétrer dans le septum interventriculaire. Enfin, l'héparine dans le PBS utilisé pour la perfusion est cruciale pour déconnecter la population MP-leucocytes à partir des capillaires, et doivent donc être utilisés.
Plusieurs dysfonctionnements peuvent se produire lors de l'exécution de cette procédure, mais la plupart d'entre eux sont corrigibles. S'il y a une fuite à partir du site de pénétration de l'aiguille dans le cœur, il est suggéré de sceller le muscle cardiaque rompu à l'aide d'une pince émoussée à nez avec des pointes en dents de scie autour de l'aiguille de papillon. Si une aiguille glisse, stop la pompe péristaltique, re-insérer l'aiguille dans son site de pénétration d'origine, et redémarrer la pompe. Si le flux de collecte cesse, mettre fin à la dépression collecte, déplacer l'aiguille à l'intérieur du ventricule, et redémarrez la collection. Si l'oreillette gauche est gonflé et ne se réduit pas par un ensemble continu, réduire le débit de la pompe d'écoulement. En général, un débit péristaltique élevé peut nuire à la formation de capillaires, et les poumons peut devenir enflé.
Le procédé décrit ici permet une récolte sélective de la population leucocytaire MP dans une procédure relativement simple. Étant donné que cette population présente des caractéristiques uniques par rapport aux leucocytes d'autres compartiments immunitaires, et que cette population peut avoir une importance biologique et clinique à l'organisme, nous proposons l'utilisation de cette méthode lorsque cela est possible, en particulier lorsque l'on étudie les processus et les maladies liées pulmonaires. Il est encore impossible de savoir si les cellules MP, qui résident dans le capill du poumonaries sur les cellules de récolte, ont mûri dans les poumons, ou si elles maintiendrait leurs caractéristiques à la sortie de poumons. Comme les leucocytes d'autres compartiments peuvent ne pas refléter le profil de la population MP, et comme il est pas accessible chez les humains, nous proposons en outre l'utilisation de cette méthode pour élucider les biomarqueurs circulants spécifiques qui sont en corrélation avec les caractéristiques de MP uniques.
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Disclosures
Les auteurs ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs et ces travaux ont été soutenus par le NIH / NCI subvention # R01CA172138 (à SBE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclud Peristaltic pump | |||
| Butterfly needle | OMG | 26G | |
| Butterfly needle | OMG | 21G*3/4" | |
| Syringe | Pic solution | 1 ml | |
| Syringe | Pic solution | 2.5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 10 ml | |
| Syringe | Pic solution | 25 ml | |
| Blunted-edged forceps | |||
| Scissors | |||
| hemostat | |||
| Tissue forceps | |||
| Heparin sodium porcine mucosa (perservative free) | Sigma Aldrich |
References
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