Introduction
肺の毛細血管（ すなわち 、marginating肺（MP）白血球）1は、他の免疫の区画（ 例えば 、循環、脾臓、骨髄）からの白血球に比べて明確な白血球の組成とユニークな活性を示すことが示された、2-に付着した白血球4。例えば、循環および脾臓NK細胞、並びに分化したメッセンジャーRNA（mRNA）レベルおよびプロおよび抗炎症性サイトカインの分泌増加と比較して、種々の腫瘍細胞に対するMP-白血球展示高いナチュラルキラー（NK）細胞の細胞毒性。 MP-白血球は循環白血球（50％対それぞれ、30％）と比較して、先天性/適応免疫の高い比を有するように、細胞の組成物はまた、循環白血球から区別されます。本明細書に提示された方法の目標は、この重要かつユニークな免疫コンパートメント（細胞集団）を研究するために、およびelucに、MP-白血球の選択的ハーベスティングを可能にすることですこれらの特定の細胞上の各種操作（ 例えば 、免疫活性化）の影響をIDATE。
このユニークな集団の意義を理解するために、免疫系の細胞性免疫（CMI）のインビボでの機能を介して腫瘍細胞、微小転移、および残留疾患、循環制御することができることに留意することが重要です。この能力は、原発腫瘍を制御するために、免疫系の先行障害が発生しても明らかであり、かつ癌患者および動物モデル5 in vivoでの証拠で十分でサポートされています。重要なことには、これらの知見は、多くの場合、インビトロと矛盾しており、ほとんどの自己腫瘍細胞（細胞傷害性アッセイによって測定される）は、ヒトおよび動物から血液試料中の白血球を循環させることにより細胞毒性に抵抗性であることを報告エクスビボ研究6,7。この不一致は、前述のように異なる白血球集団のin vivoでの存在に起因し得ます前記MPの白血球集団、および活性化NK細胞3の特にその亜集団。実際に、循環および脾臓白血球に対して耐性であることが見出された同系腫瘍細胞（MADB106）は、MP-NK細胞3,8によって溶解されることが示されました。したがって、fischer344（F344）ラットの肺に転移容疑「NK抵抗性」MADB106細胞ではなく、循環または一般アクセスの容易さを与えられた研究された脾臓NK細胞によってMP-NK細胞により制御されます。
精製された、アクティブMP-白血球は肺組織の研削または生物学的分解9に基づいており、肺からの白血球の標準的な収穫方法、を介してアクセスできません。我々のアプローチは、組織処理の手法と比較して、2つの主要な利点を有します。まず、灌流アプローチは、選択的に肺実質、間質、および気管支肺胞比較例に由来する他の細胞からそれらを分離、MP-白血球を収穫しますtments。第二に、潅流技術は、より良い研削および生物学的処理が損傷細胞は、その形態を変化させることをアプローチとは異なり、完全性およびMP-白血球の生理的環境を維持し、生産および免疫活性を調節し、特にNKを抑制する様々な因子の放出を誘発します細胞毒性10。
肺は、癌転移のためにと、さまざまな感染症の主要な標的器官です。すべての循環悪性細胞と感染した細胞は、それらが変形し、毛細血管内皮細胞と常駐白血球と対話する必要が肺毛細血管を通過します。これらの条件下では、循環細胞は、容易に常駐MP-白血球によって標的化することができます。従って、この免疫コンパートメントに白血球を活性化しているように、生物学的に有利なようで、別の、生物学的実験、及び臨床現場では、このユニークなMP-人口を検討することが重要です。そのSYを注意する価値があります様々な生物学的応答調整剤によってstemic免疫活性化（ 例えば 、ポリイノシン-ポリシチジル酸（ポリI：C）またはC型CpGオリゴデオキシヌクレオチド（CPG-C ODNは））より白血球3を循環させるよりもMP-白血球を活性化することが示されています、 8,11。
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Protocol
動物を対象とする手順は、テルアビブ大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されています。
1.ラットプロトコル
- 準備
- 2バタフライ21 G針を配置します。必要に応じて、針の鋭いエッジを提出することにより、2鈍いエッジの蝶21 G針を準備します。
- 重力（ドライ）設定で少なくとも30分間、121℃でオートクレーブにより滅菌はさみの2ペア、平滑化エッジの鉗子、止血鉗子、歯組織鉗子：手術器具を滅菌します。
- リン酸緩衝生理食塩水（1×PBS）溶液1mlあたりヘパリン30単位を添加することにより、ヘパリン化PBS（30単位/ ml）を調製します。 RTで使用してください。 35ミリリットルは、動物ごとに必要な最小量です。
- 気泡を回避するために、蠕動ポンプラインバタフライ針にヘパリン化PBSを流します。
- MP-白血球の肺およびコレクションの灌流
- 8％のイソフルランの過剰投与により動物を安楽死させます。呼吸停止を監視することによって安楽死を確認してください。
- 呼吸が停止すると、すぐに滅菌はさみや歯組織鉗子を使用して、腹膜や胸の空洞を開きます。剣状突起に腹部に沿って正中腹部切開を行います。
- あらゆる臓器や大血管を穿刺することなく、慎重に両側の肋骨を切断、ピンセットを用いて胸骨を持ち上げます。胸骨上の止血剤をクランプし、吻側心肺複合体を露出させるために胸郭を折ります。
- 心臓の右心室に翼状針を挿入し、約分以内（〜250グラムの動物から6ミリリットル）をシリンジに血液の最大量を収集します。
- （ 説明を参照）は、肝臓の後方灌流を回避するために、止血剤と大静脈をクランプします。
- Pの流出管に血液を含む注射器を交換しながら、右心室の中に蝶の針を保持しますeristalticポンプ。
- 心室中隔の浸透を回避し、左心室に5ミリリットルの収穫シリンジに接続された第二の翼状針を挿入します。
- 約5ミリリットル/分の速度で蠕動ポンプの電源を入れ、ゆっくりとシリンジに血液で汚染された灌流液の最初のミリリットルを集めます。灌流液の色が淡赤色暗からなるまで続けます。 （血液汚染perfusteを捨てます）。
- 蠕動ポンプの停止することなく、速やかに20ミリリットル収穫シリンジで5ミリリットルの収穫シリンジを交換し、灌流の高速（最大7 ml /分）を用いた肺灌流液の20ミリリットルを集めます。真空形成を回避しながら継続的に、収集シリンジへの灌流液の流れを監視します。
- 蠕動ポンプの流れを止めます。
- 白血球の抽出
- 400×gで10分間の灌流液を遠心。
- 流体を吸引します。
- 、10 mlのPBSまたは培地を追加し、10分間400×gで遠心分離し、液体を吸引除去します。二回、この手順を繰り返します。 PBSまたは培地の使用は、サンプルの結果としての用途に依存します。
- 10分間400×gで20ミリリットルPBSまたは培地、遠心分離機を追加し、流体を吸引。
- 使用例（FACS、PCR、 等 ）に基づいて、所望の濃度に細胞を再構成します。
2.マウスプロトコル
- 準備
- 2バタフライ25 G針を配置します。必要に応じて、針の鋭いエッジを提出することにより、2鈍いエッジの蝶25 Gの針を準備します。
- 重力（ドライ）設定で少なくとも30分間、121℃でオートクレーブにより滅菌はさみの2ペア、平滑化エッジの鉗子、止血鉗子、歯組織鉗子：手術器具を滅菌します。
- 1×PBS溶液1ml当たりヘパリンの30ユニットを追加することにより、ヘパリン化PBS（30単位/ ml）を準備します。 RTで使用してください。 25ミリリットルは、動物ごとに必要な最小量です。
- STRE気泡を回避するために、蠕動ポンプラインバタフライ針にPBSをヘパリン化しています。
- MP-白血球の肺およびコレクションの灌流
- 8％のイソフルランの過剰投与により動物を安楽死させます。呼吸停止を監視することによって安楽死を確認してください。
- 呼吸が停止すると、すぐに滅菌はさみや歯組織鉗子を使用して、腹膜や胸の空洞を開きます。剣状突起に腹部に沿って正中腹部切開を行います。
- あらゆる臓器や大血管を穿刺することなく、慎重に両側の肋骨を切断、ピンセットを用いて胸骨を持ち上げます。胸骨上の止血剤をクランプし、吻側心肺複合体を露出させるために胸郭を折ります。
- （説明を参照）は、肝臓の後方灌流を回避するために、止血剤と大静脈をクランプします。
- 右ヴェンに蠕動ポンプの流出管に接続された翼状針を挿入心のtricle、および心臓の左心室、心室中隔のavoidingpenetrationに2ミリリットルの収穫シリンジに接続された第二の翼状針。
- 約2ミリリットル/分の速度にポンプの電源をオンにし、灌流液は淡赤色暗からなるまで（血液汚染perfusteを捨てる）収穫シリンジに血液で汚染された灌流液の最初のミリリットルを集めます。
- 蠕動ポンプの停止することなく、速やかに10ミリリットル収穫シリンジを用いて2ミリリットルの収穫シリンジを交換し、灌流の高速（最大4 ml /分）を用いた肺灌流の10ミリリットルを集めます。真空形成を回避しながら継続的に、収集シリンジへの灌流液の流れを監視します。
- 蠕動ポンプの流れを止めます。
- 白血球の抽出
- 400×gで10分間の灌流液を遠心。
- 流体を吸引します。
- 400で10 mlのPBSまたは培地、遠心分離機を追加10分間XG、および流体を吸引。この手順を3回繰り返します。 PBSまたは培地の使用は、サンプルの結果としての用途に依存します。
- 、10 mlのPBSまたは培地を追加し、10分間400×gで遠心分離し、液体を吸引除去します。
- 使用例（FACS、PCR、 等 ）に基づいて、所望の濃度に細胞を再構成します。
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Representative Results
MP-コンパートメント展示循環白血球に比べて異なる白血球サブセット組成物。フローサイトメトリー分析を用いて、白血球の亜集団が同定され、両方の循環及びMP白血球の組成を特徴付けるために定量化しました。顆粒球およびリンパ球は、前方および側方散乱体に基づいて同定しました。リンパ内、NKRP-1 明るい細胞は、NK細胞、単球のようなT細胞のようなCD3 +、RM1 +、及びCD4 + / CD8 + / CD25として同定された+ T細胞亜集団の同定のために使用しました。顆粒球、単球、およびNK細胞を含む先天性免疫は、血液循環（P <0.05）27.9％（0.66±％）と比較して、MP-白血球集団の52％（±1.52％）を構成します。逆に、CD4 +、CD4 + CD8 + T細胞、および調節（CD4 + CD25 +）を含むT細胞亜集団、T細胞、ならびに樹状細胞は、循環系に比べてMP区画に低い割合を示した（p <0.005、N = 8）。この株のMP区画における細胞収量は約3百万の白血球（ 図1）から構成されています。
NK細胞内で二つの亜集団は、細胞の大きさに基づいて、明らかです。 NKRP-1標識によって前方散乱の散布図を使用して、NK細胞は、大小NK細胞に分けました。 NK細胞の総数は、（ 図2）に類似であるMPの区画は、循環（〜10％）と比較して大きいNK細胞（〜30％）の3倍より高い割合を示します。また、標準的な4時間の51 Cr放出アッセイを使用して、いくつかの標的腫瘍細胞に対するNK抗腫瘍細胞毒性は8で測定した。まもなく、このアッセイは、NK細胞による特異的細胞傷害性の結果として、腫瘍細胞から放出された51 Crの量を評価秒。腫瘍細胞を溶解するためのMPの区画からのNK細胞の能力は、両方MADB106同系細胞株（ 図3A）に対する明らかなように、NK細胞（ 図3）、およびYAC-1標準細胞株（ 図3B）を循環よりも大きいです。加えて、免疫刺激インビボ介してポリI：Cの投与はMADB106の標的細胞株は、（ 図3A）を使用した場合、NK細胞の循環よりもMP-NK細胞のNK細胞毒性のより深い影響を生成します。
図1.異なる白血球サブセット組成物は、F344ラットにおける循環と比較して、MP-コンパートメントを特徴付けます 。 T細胞の有病率は、逆の差（pを示しながらMP区画において、先天性免疫の一部は、循環中のその等価物（52％対28％）に比べて大きくなっています0; 0.005; n = 8）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2は、循環に比べてMP区画に大きなNK細胞の割合を増加 MP-NK細胞は、それぞれNK細胞（30％対10％が、循環に比べて大きいNK細胞の3倍より高い割合を示し; p < 0.05）、NK細胞の総数は似ている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
循環に比べてMPコンパートメント3.高いNK細胞毒性を図。（A）MADB106標的細胞-循環NK細胞は細胞毒性を示さないながらMP区画から採取したNK細胞は、この細胞系に対して顕著な細胞毒性を示したインビボ免疫刺激ポリによってI：CはMPコンパートメント内NK細胞毒性を増加ではなく循環インチ（B）YAC-1標的細胞を- MP区画から採取NK細胞は、この標準細胞株に対するNK細胞の循環と比較して高い細胞毒性を示しました。ポリによる免疫刺激は、I：CはMPコンパートメントと循環の両方におけるNK細胞毒性を増加させます。 NK細胞数は、細胞毒性の評価のために調整しました。データは、平均±SEMとして表されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
本明細書に提示された方法は、MP-白血球のユニークな人口の選択的ハーベスティングと勉強を可能にします。循環または脾臓の白血球に比べて、MP集団は、白血球の亜集団の別個の組成物は、より高い活性化レベル、種々のサイトカインのより高い放出、ならびにプロおよび抗炎症性サイトカイン2,3の高いmRNAレベルによって特徴づけられます。具体的には、MP-NK細胞は、様々な標的細胞3,4-に対して循環NK細胞よりも細胞傷害性であり、及びインターフェロンγのより高いレベルで発現することが示されています。全体として、我々の結果は、MP-NKの白血球が血液媒介転移および肺転移を制御する上でより大きな生物学的意義を意味するものであり、したがって、NK細胞を循環し、より高い細胞毒性を有することを示唆しています。したがって、脾臓または循環白血球が金本位制や免疫学的状態を反映するためのデフォルトの人口、およびヒトでの研究と考えるべきではないというコムmonlyは慎重に解釈されるべきである循環白血球のみに依存しています。また、様々な疾患は、特に肺を与えるように、免疫がこの器官内に研究されるべきであり、実際に私たちの灌流アプローチを用いた場合であるとして、MPのコンパートメントは、間質、実質、およびブロンコ肺胞サブ区画から区別されるべきです。
この手順の成功を保証するために、それは、（i）、急速に呼吸の完全な停止、次の腹部と胸部の空洞を開き、最大心臓採血を可能に血圧を維持するために、及び（ii）は、望ましくない追加控えることに不可欠です鈍いエッジの蝶の針を使用することにより、心室の穿孔。もう一つの重要な障害は肺灌流液内の血液の潜在的な汚染です。肺灌流液の最初のミリリットルを心臓の血液で汚染されているように示されているように、彼らは破棄されるべきです。肛門の間の標準化を達成するために、MALS、MPの灌流液の収集を開始するための基準は淡赤色する暗赤色の色の移行に基づいています。加えて、1はまた、肝臓の連続灌流を介して肝細胞をmarginating収集したい場合は特に、肝臓の後方灌流を回避するために、非鋸歯状止血剤で大静脈をクランプすることをお勧めします。左心室から灌流液を収集しながら、心室中隔を貫通していない非常に重要です。最後に、PBS中のヘパリンは、毛細血管からMP-白血球集団を切断するために重要であるため、使用しなければならない灌流のために使用されます。
この手順を実行すると、いくつかの誤動作が発生することがありますが、それらのほとんどは修正可能です。心臓への針の穿通部位からの漏れがある場合、バタフライ針を取り囲む鋸歯状の先端を有する鈍い鼻鉗子を使用して破裂心筋を密封することが提案されています。針は、STOを抜け出す場合P蠕動ポンプ、元の侵入部位に針を再挿入し、ポンプを再起動してください。収集の流れが停止した場合、収集、真空圧を停止心室内針を再配置し、コレクションを再起動してください。左心房が膨張され、そして連続的な収集によって還元されていない場合、ポンプの流量を下げます。一般的に、高い蠕動流量は、毛細管形成を損なうことがあり、肺を膨潤なることがあります。
本明細書に記載の方法は、比較的簡単な手順でMPの白血球集団の選択的ハーベスティングを可能にします。与えられたこの集団は、他の免疫区画からの白血球と比較して固有の特性を示し、そしてこの集団は、生物への生物学的および臨床的重要性を有し得ることがことが可能な場合、我々は、肺関連プロセス及び疾患を研究する場合は特に、この方法を使用することを提案します。これは、肺capillに常駐MP細胞、かどうかはまだ不明です牡羊座は、細胞の収穫時に、肺に成熟している、またはそれらが肺を離れる時に、その特性を維持するかどうか。他の区画からの白血球はMP人口のプロファイルが反映されないことがあり、それは人間ではアクセスできませんように、我々はさらにユニークなMP特性と相関する特定の循環バイオマーカーを解明するために、この方法を利用示唆しているよう。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者とこの作品は、NIH / NCI助成金＃（SBE）はR01CA172138によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclud Peristaltic pump | |||
| Butterfly needle | OMG | 26G | |
| Butterfly needle | OMG | 21G*3/4" | |
| Syringe | Pic solution | 1 ml | |
| Syringe | Pic solution | 2.5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 10 ml | |
| Syringe | Pic solution | 25 ml | |
| Blunted-edged forceps | |||
| Scissors | |||
| hemostat | |||
| Tissue forceps | |||
| Heparin sodium porcine mucosa (perservative free) | Sigma Aldrich |
References
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