Selektiv Høsting av Marginating-lunge Leukocytter

Introduction

Leukocytter fester seg til kapillærene i lungene (dvs. marginating-lunge (MP) leukocytter) ¹ ble vises til å vise tydelig leukocytt sammensetning og unike aktivitet sammenlignet med leukocytter fra andre immun avdelinger (f.eks sirkulasjon, milt, benmarg) ^{2- 4.} For eksempel, MP-leukocytter oppviser høyere naturlige killer (NK) celler cytotoksisitet mot forskjellige tumorceller, sammenlignet med sirkulerende og milt NK-celler, så vel som differensiert budbringer RNA (mRNA) nivåer og økt utskillelse av pro- og anti-inflammatoriske cytokiner. Sammensetningen av celler er også differensieres fra sirkulerende leukocytter som MP-leukocytter har et høyere forhold av medfødt / adaptiv immunitet i forhold til sirkulerende leukocytter (50% vs 30%, respektivt). Målet med fremgangsmåten presentert heri er å muliggjøre selektiv høsting av MP-leukocytter, for å studere dette viktig og unikt immun kammer (cellepopulasjon), og for å elucIDATE effekten av ulike manipulasjoner (f.eks immunaktiverings) på disse spesifikke celler.

For å forstå betydningen av dette unike befolkning, er det viktig å være oppmerksom på at immunsystemet kan kontrollere sirkulerende tumorceller, mikrometastaser, og restsykdom ved in vivo funksjoner av cellemediert immunitet (CMI). Denne evnen er klart til tross for den presedens svikt i immunsystemet til å kontrollere den primære tumor, og støttet av god in vivo bevis i kreftpasienter og dyremodeller ^5. Viktigere, disse funnene er ofte uforenlig med in vitro og ex vivo studier som rapporterer at de fleste autologe tumorceller er motstandsdyktig mot cytotoksisitet av sirkulerende leukocytter i blodprøver fra mennesker og dyr (målt ved cytotoksisitetsassayer) ^6,7. Dette avviket kan tilskrives in vivo eksistensen av distinkte leukocyttpopulasjonene, slik som den tidligerenevnte MP leukocytter befolkningen, og spesielt dens undergruppe av aktiverte NK-celler ^3. Faktisk, syngeniske tumorceller (MADB106), som ble funnet å være motstandsdyktig mot sirkulerende leukocytter og milt, ble vist å bli lysert av MP-NK-celler ^3,8. Således er angivelig 'NK-resistente "MADB106 celler som metastaserer til lungene av fischer344 (F344) rotter styres av MP-NK-celler, men ikke ved å sirkulere eller milt NK-celler, som vanligvis studerte gitt sitt enkel tilgang.

Rensede og aktive MP-leukocytter ikke er tilgjengelige gjennom standardmetoder høsting av leukocytter fra lungene, som er basert på lungevev sliping eller biologisk nedbrytning ^9. Vår tilnærming har to viktige fordeler sammenlignet med vev prosesserings tilnærminger. Først perfusjon tilnærming selektivt høster MP-leukocytter, skille dem fra andre celler som kommer fra lungene parenkymatøs, interstitiell og bronkoøsofageal alveolar komparativereksjonene. For det andre, perfusjon teknikken bedre bevarer integriteten og den fysiologiske miljøet i MP-leukocytter, i motsetning til sliping og biologisk behandling tilnærminger som kan skade celler, endre deres morfologi, og indusere produksjon og frigjøring av ulike faktorer som modulerer immunaktivitet og spesielt undertrykke NK cytotoksisitet ^10.

Lungene er en viktig målorgan for kreftmetastaser og for forskjellige infeksjonssykdommer. Alle sirkulerende ondartede celler og infiserte celler passerer gjennom lungekapillærene, der de trenger å deformere og samhandle med kapillære endotelceller og bosatt leukocytter. Under disse forholdene, kan sirkulerende celler lett bli målrettet av fastboende MP-leukocytter. Det virker dermed biologisk fordel å ha aktiverte leukocytter i denne immunrommet, og det er viktig å studere dette unike MP-befolkningen i ulike biologiske, eksperimentelle og kliniske settinger. Det er verd å merke seg at systemic aktivering av immunsystemet ved hjelp av forskjellige biologisk-respons-modifiserende midler (for eksempel polyinosinic-polycytidylic syre (poly I: C) eller type-C CpG-oligodeoksynukleotider (CpG-C ODN)) har vist seg å aktivere MP-leukocytter mer enn sirkulerende leukocytter ^{3, 8,11.}

Protocol

Prosedyrer som involverer dyr fag har blitt godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Tel-Aviv University.

1. Rat Protocol

1. Forberedelser
   1. Ordne 2 butterfly 21 G nåler. Eventuelt forberede 2 butte kanter butterfly 21 G kanyler ved å sende den skarpe kanten av nålen.
   2. Steril kirurgiske verktøy: 2 par saks, avstumpet kanter tang, pinsetten, tann-vev tang sterilisert av autoklav ved 121 ° C i minst 30 min på gravitasjon (tørr) innstilling.
   3. Forbered heparinisert PBS (30 enheter / ml) ved tilsetning av 30 enheter heparin per ml fosfatbufret saltoppløsning (1 x PBS) løsning. Bruk ved RT. 35 ml er minimalt volum som trengs per dyr.
   4. Stream heparinisert PBS inn i peristaltiske pumpe linjer og sommerfugl nåler for å unngå luftbobler.
2. Perfusjon av lungene og innsamling av MP-leukocytter
   1. Avlive dyret med en overdose av 8% isofluran. Bekreft dødshjelp ved å overvåke pustestans.
   2. Ved opphør av åndedrett, umiddelbart åpne peritoneal og bryst hulrom ved hjelp av steril saks og tann vev tang. Utfør en midtlinjen abdominal snitt langs buken opp til xiphoid prosessen.
   3. Løft sternum ved hjelp av tang, forsiktig skjæring brystkassen på begge sider, uten å punktere en hvilken som helst indre organ eller store blodkar. Spenn pinsetten på sternum, og rostrally brette brystkassen for å avdekke hjerte-komplekset.
   4. Sette inn en sommerfugl kanyle inn i høyre ventrikkel i hjertet, og i løpet av ca. et minutt samle den maksimale volumet av blod inn i en sprøyte (~ 6 ml fra et 250 g dyr).
   5. Klem vena cava med pinsetten for å unngå baklengs perfusjon av leveren (se diskusjon).
   6. Hold sommerfuglnål i høyre ventrikkel mens erstatte sprøyten inneholdende blod med utløpsrøret av peristaltic pumpe.
   7. Sett inn en annen sommerfugl nål koblet til en 5 ml høsting sprøyte inn i venstre hjertekammer, unngå inntrengning av interventricular septum.
   8. Slå på den peristaltiske pumpe ved en hastighet på omtrent 5 ml / min og forsiktig samler inn i sprøyten de første milliliter perfusatet som er forurenset med blod. Fortsett til perfusatet fargen blir fra mørk til lys rød. (Kast blod-forurenset perfuste).
   9. Uten opphør av den peristaltiske pumpe, raskt erstatte 5 ml høsting sprøyte med en 20 ml sprøyte høsting og samle 20 ml lunge perfusatet anvende en høyere hastighet av perfusjon (opp til 7 ml / min). Kontinuerlig overvåke perfusatet strømmen inn i samlesprøyten, og samtidig unngå vakuumdannelse.
   10. Slutt strømmen av den peristaltiske pumpe.
3. leukocytter Extraction
   1. Sentrifuger perfusatet i 10 minutter ved 400 x g.
   2. Aspirer væsken.
   3. Tilsett 10 ml PBS eller medium, sentrifuger ved 400 xg i 10 min, og suge fluidet. Gjenta dette trinnet to ganger. Bruken av PBS eller medium avhenger av den derav følgende bruk av prøven.
   4. Tilsett 20 ml PBS eller medium, sentrifuger ved 400 xg i 10 min, og suge fluidet.
   5. Rekonstituer cellene til den ønskede konsentrasjon, basert på prøven bruk (FACS, PCR, etc.).

2. Mouse Protocol

1. Forberedelser
   1. Ordne 2 butterfly 25 G nåler. Eventuelt forberede 2 butte kanter butterfly 25 G kanyler ved å sende den skarpe kanten av nålen.
   2. Steril kirurgiske verktøy: 2 par saks, avstumpet kanter tang, pinsetten, tann-vev tang sterilisert av autoklav ved 121 ° C i minst 30 min på gravitasjon (tørr) innstilling.
   3. Forbered heparinisert PBS (30 enheter / ml) ved tilsetning av 30 enheter heparin per ml av 1 x PBS-oppløsning. Bruk ved RT. 25 ml er minimalt volum som trengs per dyr.
   4. streer heparinisert PBS inn i peristaltiske pumpe linjer og sommerfugl nåler for å unngå luftbobler.
2. Perfusjon av lungene og innsamling av MP-leukocytter
   1. Avlive dyret med en overdose av 8% isofluran. Bekreft dødshjelp ved å overvåke pustestans.
   2. Ved opphør av åndedrett, umiddelbart åpne peritoneal og bryst hulrom ved hjelp av steril saks og tann vev tang. Utfør en midtlinjen abdominal snitt langs buken opp til xiphoid prosessen.
   3. Løft sternum ved hjelp av tang, forsiktig skjæring brystkassen på begge sider, uten å punktere en hvilken som helst indre organ eller store blodkar. Spenn pinsetten på sternum, og rostrally brette brystkassen for å avdekke hjerte-komplekset.
   4. Klem vena cava med pinsetten for å unngå baklengs perfusjon av leveren (se diskusjon).
   5. Sette inn en sommerfugl nål som er koblet til utløpsrøret av den peristaltiske pumpe inn i den høyre ventricle av hjertet, og en andre sommerfugl nål koblet til en 2 ml sprøyte høsting i den venstre ventrikkel i hjertet, avoidingpenetration av interventricular septum.
   6. Slå på pumpen til en hastighet på tilnærmet 2 ml / min, og samle de første milliliter blod-forurenset perfusatet inn i høste sprøyten til perfusatet svinger fra mørk til lys rød (Kast den blod-forurensede perfuste).
   7. Uten opphør av den peristaltiske pumpe, hurtig erstatte det 2 ml høsting sprøyte med en 10 ml sprøyte høsting og samle 10 ml lunge perfusatet anvende en høyere hastighet av perfusjon (opp til 4 ml / min). Kontinuerlig overvåke perfusatet strømmen inn i samlesprøyten, og samtidig unngå vakuumdannelse.
   8. Slutt strømmen av den peristaltiske pumpe.
3. leukocytter Extraction
   1. Sentrifuger perfusatet i 10 minutter ved 400 x g.
   2. Aspirer væsken.
   3. Tilsett 10 ml PBS eller medium, sentrifuger ved 400xg i 10 min, og suge fluidet. Gjenta dette trinnet tre ganger. Bruken av PBS eller medium avhenger av den derav følgende bruk av prøven.
   4. Tilsett 10 ml PBS eller medium, sentrifuger ved 400 xg i 10 min, og suge fluidet.
   5. Rekonstituer cellene til den ønskede konsentrasjon, basert på prøven bruk (FACS, PCR, etc.).

Representative Results

MP-kupé utstillingen en annen leukocytt undergruppe sammensetning i forhold til sirkulerende leukocytter. Ved hjelp av flowcytometri analyse, ble leukocytter subpopulasjoner identifisert og kvantifisert å karakterisere sammensetningen av både sirkulerende og MP leukocytter. Granulocytter og lymfocytter ble identifisert basert på termin og side sprer. Innenfor lymfocytter, ble ^{NKRP-1-lyse-celler} er identifisert som NK-celler, som CD3 ⁺ T-celler, RM1 ⁺ som monocytter og CD4 ⁺ / CD8 ⁺ / CD25 ⁺ ble anvendt for T-celle-subpopulasjoner identifikasjon. Medfødte immunocytter, inkludert granulocytter, monocytter og NK-celler, utgjorde 52% (± 1,52%) av den MP-leukocytter befolkning, sammenlignet med 27,9% (± 0,66%) i sirkulasjonen (p <0,05). Tvert imot, de T-celle subpopulasjoner, inkludert CD4 ^+, CD4 ⁺ CD8 ⁺ T-celler, og regulatoriske (CD4 ⁺ CD25 ⁺⁾T-celler, så vel som dendrittiske celler, oppviste lavere prosenter i MP kammeret i forhold til sirkulasjons (p <0,005, n = 8). Celle utbytte i universalrommet av denne stammen utgjør fra ca 3 millioner leukocytter (figur 1).

Innenfor NK-celler, to subpopulasjoner er åpenbare på grunnlag av cellestørrelse. Ved hjelp av et punktplott av fremover scatter av NKRP-en merking, ble NK-celler delt inn i små og store NK-celler. MP kammeret oppviser et 3-ganger høyere prosentandel av store NK-celler (~ 30%) i forhold til sirkulasjons (~ 10%), mens det totale antall NK-celler er lik (figur 2). Dessuten, ved hjelp av standard fire timers ^51Cr frigivelse assay, NK anti-tumor cytotoksisitet mot flere mål-tumorceller ble målt ^8. Kort tid, dette assay vurderer mengden ^51Cr frigitt fra tumorceller som et resultat av spesifikk cytotoksisitet av NK-celles. Evnen til NK-celler fra universal kammeret for å lysere tumorceller, er større enn sirkulerende NK-celler (figur 3), slik det fremgår mot både den MADB106 syngenisk cellelinje (figur 3A), og YAC-1-standard cellelinje (figur 3B) . I tillegg, immunstimulering gjennom in vivo poly I: C administrering frembringer en mer dyptgripende innflytelse på NK-cytotoksisitet av MP-NK-celler enn på sirkulerende NK-celler når MADB106 mål-cellelinje blir anvendt (figur 3A).

Figur 1. Ulike leukocytter undergruppe sammensetning karakteriserer MP-avdeling i forhold til sirkulasjon i F344 rotter. I MP rommet, er fraksjonen av medfødt immunitet større sammenlignet med tilsvarende i sirkulasjonen (52% vs. 28%), mens forekomsten av T-celler som oppviser en motsatt forskjell (p0; 0,005; n = 8). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Økt andel av store NK-celler i MP kammeret i forhold til sirkulasjons MP-NK-celler viste en tre ganger høyere prosentandel av store NK-celler sammenlignet med sirkulerende NK-celler (30% vs. 10%, henholdsvis. P < 0,05), mens det totale antall NK-celler er lik. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. Høyere NK cytotoksisitet i MP rommet i forhold til sirkulasjon.(A) MADB106 målceller - NK-celler høstet fra MP rommet viste en markant cytotoksisitet mot denne cellelinjen, mens sirkulerende NK-celler viser ingen cytotoksisitet In vivo immunstimulering av poly I:. C øker NK cytotoksisitet i MP rommet, men ikke i sirkulasjon. (B) YAC-en målceller - NK-celler høstet fra MP rommet utstilt en høyere cytotoksisitet mot sirkulerende NK-celler mot denne standarden cellelinje. Immune stimulering av poly I: C øker NK-cytotoksisitet i både MP rommet og sirkulasjon. NK celle tall ble kontrollert for cytotoksisitet vurdering. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Fremgangsmåten som presenteres her muliggjør den selektive høsting og studere av den unike populasjon av MP-leukocytter. Sammenlignet med sirkulerende eller milt-leukocytter, er MP populasjonen kjennetegnet ved en tydelig sammensetning av leukocytt-subpopulasjoner, høyere aktiveringsnivå, høyere frigivelse av forskjellige cytokiner, og høyere mRNA-nivåer av pro- og anti-inflammatoriske cytokiner ^2,3. Nærmere bestemt har vi vist at MP-NK-celler er mer cytotoksisk enn sirkulasjons NK-celler, mot forskjellige målceller ^3,4, og uttrykker høyere nivåer av interferon-γ. Totalt sett, våre resultater tyder på at MP-NK leukocytter har større cytotoksisitet enn sirkulerende NK-celler, og dermed kan innebære en større biologisk betydning i å kontrollere blodbårne metastaser og lungemetastaser. Derfor milt eller sirkulerende leukocytter bør ikke anses som gullstandard eller standard befolkningen for refleksjon immunologiske status, og studier på mennesker som comvanligvis ble stole utelukkende på sirkulerende leukocytter bør tolkes med forsiktighet. Videre, ettersom ulike sykdommer spesielt påføre lungene, immunitet bør studeres innenfor dette organet, og MP rommet bør skilles fra interstitiell, parenkymatøs, og Bronco-alveolar underrommene, er som faktisk er tilfelle ved bruk av vår perfusjon tilnærming.

For å sikre suksess for denne prosedyren, er det avgjørende å (i) åpne buk og bryst hulrom raskt etter fullstendig opphør av åndedrett, for å opprettholde et blodtrykk som gjør at maksimal hjerteblodprøvetaking, og (ii) å avstå fra en uønsket tilleggs perforering av hjertet ventrikkel gjennom bruk av butte kanter butterfly nåler. En annen sentral hindring er den mulige kontaminering av blod i lungene perfusatet. Som de første milliliter lunge perfusate er forurenset med hjerteblod, bør de kastes som demonstrert. For å oppnå standardisering mellom animals, er kriteriet for å begynne å samle MP perfusatet basert på fargen overgang fra mørk rød til lys rød. I tillegg anbefales det å klemme fast vena cava med en ikke-taggete hemostat, for å unngå bakover perfusjon av leveren, særlig hvis en ønsker å samle også marginating leverceller gjennom suksessiv perfusjon av leveren. Mens samle perfusatet fra venstre ventrikkel, er det avgjørende ikke å trenge gjennom interventricular septum. Endelig, heparin i PBS anvendt for perfusjon er avgjørende for frakobling av MP-leukocytter populasjon fra kapillærene, og derfor må det brukes.

Flere feil kan oppstå når du utfører denne prosedyren, men de fleste av dem er korrigerbar. Hvis det er en lekkasje fra penetrering stedet av nålen inn i hjertet, er det foreslått å forsegle den knuste hjertemuskelen ved hjelp av en butt-nosed tang med taggete tips rundt butterfly nål. Hvis en nål glipper ut, stop den peristaltiske pumpen, sett inn nålen i sin opprinnelige penetrasjon området, og start pumpen. Hvis samling flyt opphører, stoppe innsamling vakuum press, flytte nålen i ventrikkel, og start samlingen. Hvis den venstre atrium er oppblåst, og blir ikke redusert av en sammenhengende samling, senke strømningshastigheten for pumpen. Generelt kan en høy strømningshastighet peristaltisk skade kapillaren formasjonen, og lungene kan bli svellet.

Fremgangsmåten som her er beskrevet muliggjør en selektiv høsting av MP leukocytt-populasjonen i en forholdsvis enkel prosedyre. Gitt at denne populasjonen oppviser unike egenskaper i forhold til leukocytter fra andre immun kamre, og at denne gruppen kan ha biologisk og klinisk betydning for organismen, foreslår bruken av denne fremgangsmåten når det er mulig, spesielt når man vil studere pulmonale-relaterte prosesser og sykdommer. Det er ennå ikke kjent om MP celler, som bor i lungen capillværen på celler høsting, har modnet i lungene, eller om de vil beholde sine egenskaper når du forlater lungene. Som leukocytter fra andre kamre kan ikke gjenspeile profilen av MP befolkning, og som det ikke er tilgjengelig hos mennesker, vi foreslår videre å benytte denne fremgangsmåte for å belyse spesielle sirkulerende biomarkører som korrelerer med de unike egenskapene MP.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Autoclud Peristaltic pump
Butterfly needle	OMG		26G
Butterfly needle	OMG		21G*3/4"
Syringe	Pic solution		1 ml
Syringe	Pic solution		2.5 ml
Syringe	Pic solution		5 ml
Syringe	Pic solution		10 ml
Syringe	Pic solution		25 ml
Blunted-edged forceps
Scissors
hemostat
Tissue forceps
Heparin sodium porcine mucosa (perservative free)	Sigma Aldrich