Introduction
Лейкоциты , прилипшие к капиллярам легких (т.е. marginating-легочная (МП) лейкоциты) 1 было показано, проявляют отчетливую состав лейкоцитов и уникальной активностью по сравнению с лейкоцитами из других иммунных отсеков (например, циркуляционной, селезенку, костный мозг) 2- 4. Например, МР-лейкоциты проявляют более высокую природные клетки-киллеры (NK) клетки, цитотоксичность в отношении различных опухолевых клеток, по сравнению с циркулирующими и селезеночной NK-клеток, а также дифференцированы информационной РНК (мРНК уровней) и повышенной секрецией про- и противовоспалительных цитокинов. Состав клеток также отличается от циркулирующих лейкоцитов, как MP-лейкоциты имеют более высокое отношение врожденной / адаптивного иммунитета по сравнению с циркулирующими лейкоцитами (50% против 30%, соответственно). Цель метода, изложенного в настоящем документе, для того, чтобы селективного сбора урожая МП-лейкоциты, чтобы изучить эту важную и уникальную иммунную отделение (популяцией клеток) и elucIDATE влияние различных манипуляций (например, активация иммунной системы ) на этих специфических клеток.
Для того, чтобы понять значение этого уникального населения, важно отметить , что иммунная система может контролировать циркулирующих опухолевых клеток, микрометастазов и остаточной болезни с помощью функций в естественных условиях клеточного иммунитета (CMI). Эта способность проявляется , несмотря на провал прецедент иммунной системы для контроля первичной опухоли, и поддерживается в естественных условиях достаточно доказательств , у онкологических больных и животных моделях 5. Важно отметить, что эти результаты часто несовместимы с ин витро и исследований исключая виво, которые сообщают о том , что большинство аутогенные опухолевые клетки устойчивы к цитотоксичности путем циркулирующих лейкоцитов в образцах крови от человека и животных (измеряется цитотоксичность) 6,7. Это несоответствие может быть связано с наличием в естественных условиях различных популяций лейкоцитов, таких как AFOREМП вышеупомянутый лейкоцитарной населения, и в частности , ее субпопуляции активированных клеток NK 3. Действительно, сингенных опухолевые клетки (MADB106), которые были найдены , чтобы быть устойчивым к циркулирующим и селезеночной лейкоцитах, было показано , что лизировать клетками МП-NK 3,8. Таким образом, как утверждается, «NK-устойчивые" MADB106 клетки, которые метастазируют в легкие fischer344 (F344) крыс контролируются клетками MP-NK, но не за счет циркуляции или селезеночных клеток NK, которые обычно изучали с учетом их легкость доступа.
Очищенные и активные MP-лейкоциты недоступны через стандартные методы уборки лейкоцитов из легких, которые основаны на измельчении легочной ткани или биологической деградации 9. Наш подход имеет два основных преимущества по сравнению с подходами к обработке тканей. Во-первых, перфузия подход выборочно собирает MP-лейкоциты, отделяя их от других клеток, которые происходят из паренхимы легких, интерстициальная и бронхо-альвеолярной COMPARtments. Во-вторых, метод перфузии лучше сохраняет целостность и физиологическую среду МП-лейкоциты, в отличие от измельчения и биологической обработки подходов, которые повреждают клетки, изменяют их морфологию, и индуцируют выработку и выделение различных факторов, которые модулируют иммунную активность и, в частности подавляют NK цитотоксичность 10.
Легкие являются основным органом-мишенью для метастазирования рака и различных инфекционных заболеваний. Все циркулирующие злокачественные клетки и инфицированные клетки проходят через капилляры легких, где они должны деформироваться и взаимодействовать с капиллярных эндотелиальных клеток и лейкоцитов резидентов. В этих условиях, циркулирующие клетки могут быть легко мишенью резидентных MP-лейкоцитах. Таким образом, представляется биологически выгодно иметь активированные лейкоциты в этом иммунном отсеке, и важно, чтобы изучить этот уникальный MP-население в различных биологических, экспериментальных и клинических условиях. Стоит отметить, что SYstemic активация иммунной системы с помощью различных биологических-реакция модификаторов (например, полиинозиновая-полицитидиловая кислоты (поли I: С) или С-типа CpG олигодезоксинуклеотиды (CPG-С ODN)) было показано , чтобы активировать MP-лейкоциты более циркулирующих лейкоцитах 3, 8,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Процедуры с участием субъектов животных были одобрены по уходу и использованию комитета Institutional Animal (IACUC) в Тель-Авивском университете по.
1. Крыса протокола
- Препараты
- Устройте 2 бабочки 21 G иглы. Необязательно готовить 2 с тупыми краями бабочка 21 G иглы путем подачи острый край иглы.
- Стерилизовать хирургических инструментов: 2 пары ножниц, притупляются обрезные щипцов, кровоостанавливающего, пинцет зубной ткани, стерилизованные в автоклаве при температуре 121 ° С в течение по меньшей мере 30 мин на тяжести (сухой) настройки.
- Подготовка гепарином PBS (30 ед / мл), добавлением 30 единиц гепарина на мл раствора фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) 1x. Используйте при комнатной температуре. 35 мл является минимальный объем требуется на одно животное.
- Поток гепарином PBS в перистальтических линии насоса и иглы бабочки, чтобы избежать воздушных пузырей.
- Перфузия Легких и коллекции МП-лейкоциты
- Усыпить животное передозировкой 8% изофлуран, Подтвердить эвтаназию путем мониторинга дыхания прекращения.
- После прекращения дыхания, немедленно откройте брюшины и грудной полости, используя стерильные ножницы и пинцет зубной ткани. Выполните по средней линии живота разрез вдоль живота до мечевидного отростка.
- Поднимите грудину с помощью пинцета, осторожно разрезания грудной клетки с обеих сторон, не прокалывая любого внутреннего органа или крупных кровеносных сосудов. Зажмите кровоостанавливающего на грудину, и ростральным сложить грудную клетку, чтобы выставить комплекс сердечно-легочной.
- Вставьте бабочку иглу в правый желудочек сердца, и в течение примерно одной минуты собрать максимальный объем крови в шприц (~ 6 мл из 250 г животного).
- Зажмите полую вену с кровоостанавливающего , чтобы избежать обратной перфузию печени (см Обсуждение).
- Держите бабочка иглу в правый желудочек при замене шприц, содержащий кровь с выпускной трубкой из рeristaltic насос.
- Вставьте вторую бабочку иглу, соединенную с уборочной шприцем 5 мл в левый желудочек, избегая проникновения межжелудочковой перегородки.
- Включите шланговый насос со скоростью около 5 мл / мин и осторожно собирают в шприц первые миллилитров перфузату, загрязненных кровью. Продолжайте, пока перфузат цвет не станет от темного до светло-красного. (Выбросите крови зараженных perfuste).
- Без прекращения перистальтического насоса, быстро заменить 5 мл уборочное шприц с 20 мл шприцом уборочной и собирают 20 мл перфузата легких с использованием более высокую скорость перфузии (до 7 мл / мин). Постоянно контролировать поток перфузату в сборном шприц, во избежание образования вакуума.
- Прекратить подачу перистальтического насоса.
- Лейкоциты Добыча
- Центрифуга перфузата в течение 10 мин при 400 × г.
- Аспирируйте жидкость.
- Добавьте 10 мл PBS или средой, центрифугируют при 400 х г в течение 10 мин, и отсасывает жидкость. Повторите этот шаг дважды. Использование PBS или среды зависит от последующего использования образца.
- Добавьте 20 мл PBS или средой, центрифугируют при 400 х г в течение 10 мин, и отсасывает жидкость.
- Развести клетки до нужной концентрации, основанные на использовании образца (FACS, ПЦР и т.д.).
2. Протокол Mouse
- Препараты
- Устройте 2 бабочки 25 G иглы. Необязательно готовить 2 с тупыми краями бабочка 25 G иглы путем подачи острый край иглы.
- Стерилизовать хирургических инструментов: 2 пары ножниц, притупляются обрезные щипцов, кровоостанавливающего, пинцет зубной ткани, стерилизованные в автоклаве при температуре 121 ° С в течение по меньшей мере 30 мин на тяжести (сухой) настройки.
- Подготовка гепарином PBS (30 ед / мл), добавлением 30 единиц гепарина на мл раствора 1X PBS. Используйте при комнатной температуре. 25 мл является минимальный объем требуется на одно животное.
- Streя гепарином PBS в перистальтических линии насоса и иглы бабочки, чтобы избежать воздушных пузырей.
- Перфузия Легких и коллекции МП-лейкоциты
- Усыпить животное передозировкой 8% изофлуран. Подтвердить эвтаназию путем мониторинга дыхания прекращения.
- После прекращения дыхания, немедленно откройте брюшины и грудной полости, используя стерильные ножницы и пинцет зубной ткани. Выполните по средней линии живота разрез вдоль живота до мечевидного отростка.
- Поднимите грудину с помощью пинцета, осторожно разрезания грудной клетки с обеих сторон, не прокалывая любого внутреннего органа или крупных кровеносных сосудов. Зажмите кровоостанавливающего на грудину, и ростральным сложить грудную клетку, чтобы выставить комплекс сердечно-легочной.
- Зажмите полую вену с кровоостанавливающего, чтобы избежать обратной перфузию печени (см Обсуждение).
- Вставьте бабочку иглу, соединенную с выпускной трубкой перистальтического насоса в правый Достtricle сердца, а вторая бабочка игла соединена с уборочной шприца 2 мл в левый желудочек сердца, avoidingpenetration межжелудочковой перегородки.
- Включите насос до скорости около 2 мл / мин и собирают первые миллилитров крови загрязненных перфузату в уборочной шприца, пока не получается Перфузат от темного до светло-красного (Утилизировать загрязненные кровью perfuste).
- Без прекращения перистальтического насоса, быстро заменить 2 мл уборочное шприц с 10 мл шприцом уборочной и собирают 10 мл перфузата легких с использованием более высокую скорость перфузии (до 4 мл / мин). Постоянно контролировать поток перфузату в сборном шприц, во избежание образования вакуума.
- Прекратить подачу перистальтического насоса.
- Лейкоциты Добыча
- Центрифуга перфузата в течение 10 мин при 400 × г.
- Аспирируйте жидкость.
- Добавьте 10 мл PBS или среду, центрифуге при 400XG в течение 10 мин, и отсасывает жидкость. Повторите этот шаг три раза. Использование PBS или среды зависит от последующего использования образца.
- Добавьте 10 мл PBS или средой, центрифугируют при 400 х г в течение 10 мин, и отсасывает жидкость.
- Развести клетки до нужной концентрации, основанные на использовании образца (FACS, ПЦР и т.д.).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MP-купе обладают различной лейкоцитарной подмножеством состав по сравнению с циркулирующим лейкоциты. С помощью проточной цитометрии анализа субпопуляций лейкоцитов были идентифицированы и количественно охарактеризовать состав и циркулирующих и лейкоцитах МП. Гранулоциты и лимфоциты были определены на основе прямых и боковых рассеивателей. В - лимфоцитов, NKRP-1 светлые клетки были идентифицированы как клетки NK, CD3 + , как Т - клетки, RM1 + как моноцитов и CD4 + / CD8 + / CD25 + были использованы для идентификации Т клеток субпопуляции. Врожденные иммуноцитов, в том числе гранулоцитов, моноцитов и NK-клеток, составила 52% (± 1,52%) МП-лейкоциты населения, по сравнению с 27,9% (± 0,66%) в циркуляции (р <0,05). В противоположность этому , T клеточные субпопуляции, в том числе CD4 +, CD4 + , CD8 + Т - клеток, а также регуляторным (CD4 + CD25 +)Т-клетки, а также дендритные клетки, выставлены более низкий процент в отсеке MP по сравнению с циркуляцией (р <0,005; n = 8). Выход клеток в МП отделении этого штамма составляют около 3 млн лейкоцитов (Рисунок 1).
Внутри клеток NK, две субпопуляции очевидны, в зависимости от размера ячейки. Используя график рассеяния рассеяния вперед по NKRP-1 маркировки, клетки NK были разделены на малые и большие клетки NK. Отделение МП обладает 3-кратный более высокий процент крупных клеток NK (~ 30%) по сравнению с оборотом (~ 10%), в то время как общее количество клеток NK аналогично (Рисунок 2). Кроме того, с использованием стандартного 4 ч 51 анализа высвобождения Cr, NK противоопухолевый цитотоксичность против нескольких опухолевых клеток - мишеней измеряли 8. Вскоре, этот анализ оценивает количество 51 Cr высвобождается из опухолевых клеток в результате специфического цитотоксичность NK клеткиs. Способность клеток NK из отсека MP лизировать опухолевые клетки больше , чем циркулирующих NK - клеток (фиг.3), как видно в отношении как MADB106 сингенная клеточной линии (рисунок 3 , а ), и стандартная клеточная линия YAC-1 (фигура 3В) , Кроме того, стимуляция иммунной системы с помощью в естественных условиях поли I: введение C производит более глубокое воздействие на NK - цитотоксичности клеток MP-NK , чем на циркулирующих клеток NK , когда целевая MADB106 клеточная линия используется (рисунок 3а).
Рисунок 1. Различные лейкоциты подмножество композиция характеризует MP-купе по сравнению с циркуляцией у крыс F344. В отделении МП, доля врожденного иммунитета больше по сравнению с его эквивалентом в обращении (52% против 28%), в то время как преобладание Т-клеток демонстрируют противоположную разность (р0; 0,005; п = 8). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Увеличение доли крупных клеток NK в отсеке MP по сравнению с циркуляцией MP-NK - клетки выставлены в три раза более высокий процент крупных клеток NK по сравнению с циркулирующих НК - клеток (30% против 10%, соответственно;. Р < 0,05), в то время как общее количество клеток NK аналогично. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Более высокая NK цитотоксичность в отделении МП по сравнению с циркуляцией.(A) MADB106 клетки - мишени - NK - клетки , полученные из отделения МП демонстрировали заметное цитотоксичность против этой клеточной линии, в то время как циркулирующие клетки NK не проявляют цитотоксичность В естественных условиях стимуляции иммунной поли I:. С увеличивает NK цитотоксичность в отсеке МП, но не в обращении. (B) МЦ-1 клетки - мишени - NK - клетки , полученные из отделения МП демонстрировали более высокую цитотоксичность по сравнению с циркулирующими клетками NK против этой стандартной клеточной линии. Иммуностимуляцию поли I: C увеличивает NK цитотоксичность как в отсеке МП и обращение. числа NK клеток контролировали для оценки цитотоксичности. Данные выражены в виде среднего значения ± SEM. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод, представленный здесь, позволяет выборочный сбор урожая и изучение уникальной популяции МП-лейкоцитами. По сравнению с циркулирующим или селезеночной лейкоцитах, население МП характеризуется отчетливым составом субпопуляций лейкоцитов, более высокие уровни активации, более высокий высвобождение различных цитокинов, а также более высокие уровни мРНК про- и противовоспалительных цитокинов 2,3. В частности, мы показали , что МР-NK - клетки являются более токсичным , чем кровеносной NK клеток против различных клеток - мишеней , 3,4, и экспрессируют более высокие уровни интерферона-гамма. В целом, наши результаты свидетельствуют о том, что MP-NK лейкоциты обладают большей цитотоксичностью, чем циркулирующие клетки NK, и, таким образом, может означать большее биологическое значение в контроле над переносимыми с кровью метастаз и метастазами в легких. Поэтому, селезеночных или циркулирующие лейкоциты не следует рассматривать в качестве золотого стандарта или населения по умолчанию для отражения иммунологический статус и человека исследований, комMoNLy полагаться только на циркулирующие лейкоциты следует интерпретировать с осторожностью. К тому же, как и различные заболевания, в частности, нанести легкие, иммунитет должен быть изучен в рамках этого органа, а также отсек МП следует отличать от интерстициального, паренхимы и BRONCO-альвеолярная субкомпартменты, как, впрочем, и в случае с помощью нашего перфузионного подход.
Для того, чтобы обеспечить успех этой процедуры, крайне важно (I) открыть брюшной полости и полости грудной клетки быстро после полной остановки дыхания, чтобы поддерживать кровяное давление, которое позволяет максимально сердечный сбор крови, и (б) воздерживаться от нежелательного дополнительного перфорация желудочка сердца за счет использования тупыми краями иглы бабочки. Еще одним ключевым препятствием является потенциальное загрязнение крови в пределах перфузату легких. Поскольку первые миллилитров перфузату легких загрязнены сердечной крови, они должны быть отброшены, как показано. Для обеспечения стандартизации между аниMals, критерий, чтобы начать сбор перфузата MP основана на переходе цвета от темно-красного до бледно-красного цвета. Кроме того, рекомендуется , чтобы зажать полую вену с не зубчатым кровоостанавливающего, чтобы избежать обратного перфузию печени, особенно если желательно также собирать marginating клетки печени путем последовательного перфузии печени. При сборе перфузата из левого желудочка, крайне важно, чтобы не проникнуть в межжелудочковой перегородке. Последнее, гепарин в PBS используется для перфузией имеет решающее значение для отключения MP-лейкоцитов населения от капилляров, и, следовательно, должны быть использованы.
Некоторые неисправности могут возникнуть при выполнении этой процедуры, но большинство из них являются исправимо. Если есть утечка от места проникновения иглы в сердце, предлагается, чтобы запечатать ломанного сердечную мышцу при помощи тупого носом щипцов с зубчатыми наконечниками, окружающих бабочка иглы. Если игла выскальзывает, STOр перистальтический насос, повторно вставить иглу в ее прежнем месте проникновения, и перезапустить насос. Если сбор поток прекращается, остановить сбор давление вакуума, переместить иглу в желудочке, и перезапустить коллекцию. Если левое предсердие надувают, и не уменьшается при непрерывном сборе, снизить расход насоса. В целом, высокий уровень перистальтический поток может нанести вред образованию капилляров, и легкие могут стать опухли.
Описанный в настоящем документе способ позволяет селективное заготовкой лейкоцитарной населения МП в относительно простой процедурой. Учитывая, что эта популяция обладает уникальными характеристиками по сравнению с лейкоцитами из других иммунных отсеков, и что эта популяция может иметь биологическое и клиническое значение для организма, мы предлагаем использовать этот метод, когда это возможно, особенно при изучении процессов и заболеваний легких, связанных с. Пока еще неизвестно, будет ли клетки МП, которые проживают в capill легкихAries при уборке клеток, созрели в легких, или будут ли они сохранять свои характеристики при выходе из легких. В лейкоцитах из других отсеков могут не отражать профиль населения МП, и, как это не доступно в организме человека, мы также предлагаем, используя этот метод, чтобы выяснить конкретные циркуляционные биомаркеров, которые коррелируют с уникальными характеристиками МП.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы и эта работа была поддержана NIH / NCI грант № R01CA172138 (для SBE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclud Peristaltic pump | |||
| Butterfly needle | OMG | 26G | |
| Butterfly needle | OMG | 21G*3/4" | |
| Syringe | Pic solution | 1 ml | |
| Syringe | Pic solution | 2.5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 10 ml | |
| Syringe | Pic solution | 25 ml | |
| Blunted-edged forceps | |||
| Scissors | |||
| hemostat | |||
| Tissue forceps | |||
| Heparin sodium porcine mucosa (perservative free) | Sigma Aldrich |
References
- Kuebler, W. M., Goetz, A. E.
- Benish, M., et al. The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics. Immunol Res. 58, 28-39 (2014).
- Melamed, R., et al. The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells. J Immunother. 33, 16-29 (2010).
- Shakhar, G., et al. Amelioration of operation-induced suppression of marginating pulmonary NK activity using poly IC: a potential approach to reduce postoperative metastasis. Ann Surg Oncol. 14, 841-852 (2007).
- Smyth, M. J., Godfrey, D. I., Trapani, J. A. A fresh look at tumor immunosurveillance and immunotherapy. Nat Immunol. 2, 293-299 (2001).
- Talmadge, J. E., Meyers, K. M., Prieur, D. J., Starkey, J. R. Role of NK cells in tumour growth and metastasis in beige mice. Nature. 284, 622-624 (1980).
- Grimm, E. A., Mazumder, A., Zhang, H. Z., Rosenberg, S. A. Lymphokine-activated killer cell phenomenon. Lysis of natural killer-resistant fresh solid tumor cells by interleukin 2-activated autologous human peripheral blood lymphocytes. J Exp Med. 155, 1823-1841 (1982).
- Melamed, R., et al. Marginating pulmonary-NK activity and resistance to experimental tumor metastasis: suppression by surgery and the prophylactic use of a beta-adrenergic antagonist and a prostaglandin synthesis inhibitor. Brain Behav Immun. 19, 114-126 (2005).
- O'Dea, K. P., et al. Lung-marginated monocytes modulate pulmonary microvascular injury during early endotoxemia. Am J Respir Crit Care Med. 172, 1119-1127 (2005).
- Sorski, L., Melamed, R., Ben-Eliyahu, A unique role for marginating-pulmonary and marginating-hepatic NK cells in cancer anti-metastatic surveillance and in immunotherapy. Annual Meeting of the Psychoneuroimmunology Research Society, Philadelphia, USA.(2014, , (2014).
- Levi, B., et al. Continuous stress disrupts immunostimulatory effects of IL-12). Brain Behav Immun. 25, 727-735 (2011).
