Introduction
Leukocyten zu den Kapillaren der Lunge anhaftenden (dh marginating-Lungen (MP) Leukozyten) 1 gezeigt wurden verschiedene Leukozyten - Zusammensetzung und einzigartige Aktivität aufweisen , verglichen mit Leukozyten von anderen Immun Kompartimente (zB Zirkulations, Milz, Knochenmark) 2- 4. Zum Beispiel, MP-Leukozyten zeigen eine höhere natürliche Killerzellen (NK) Zytotoxizität gegen verschiedene Tumorzellen, im Vergleich zu zirkulierenden und splenic NK-Zellen, sowie differenzierte Boten-RNA (mRNA) Ebenen und erhöhte Sekretion von pro- und anti-inflammatorischen Zytokinen. Die Zusammensetzung von Zellen ist auch aus der zirkulierenden Leukozyten unterschieden als MP-Leukozyten ein höheres Verhältnis von angeborenen / adaptive Immunität gegenüber zirkulierende Leukozyten (50% vs. 30%, jeweils). Das Ziel des hier vorgestellte Methode selektive Ernte von MP-Leukozyten zu ermöglichen, um diese wichtige und einzigartige Immunfach (Zellpopulation) zu untersuchen und zu eluciDate die Auswirkungen verschiedener Manipulationen (beispielsweise Immunaktivierung) auf diesen spezifischen Zellen.
Um die Bedeutung dieser einzigartigen Bevölkerung zu verstehen, ist es wichtig zu beachten , dass das Immunsystem steuern kann zirkulierenden Tumorzellen, Mikrometastasen und Resterkrankung durch in - vivo - Funktionen der zellvermittelten Immunität (CMI). Diese Fähigkeit ist offensichtlich trotz der Präzedenzfall Versagen des Immunsystems , den Primärtumor zu steuern und durch reichlich in vivo Nachweis von Krebspatienten und Tiermodellen 5 unterstützt. Wichtig ist , dass diese Ergebnisse oft nicht mit in vitro und ex vivo - Studien, die berichten , dass die meisten autologe Tumorzellen - Zytotoxizität durch zirkulierende Leukozyten in Blutproben von Menschen und Tieren (gemessen durch Zytotoxizitätsassays) resistent sind 6,7. Diese Diskrepanz kann auf die in vivo Existenz verschiedener Leukozyten - Populationen, wie der zuvor zurückzuführengenannten MP Leukozytenpopulation und seine Subpopulation von aktivierten NK - Zellen spezifisch 3. Tatsächlich syngene Tumorzellen (MADB106), das Zirkulieren und splenic Leukozyten resistent erwiesen worden waren, wurden durch MP-NK - Zellen werden lysiert 3,8 gezeigt. Somit werden die angeblich "NK-resistente 'MADB106 Zellen, die Lungen von fischer344 (F344) -Ratten metastasieren von MP-NK-Zellen kontrolliert, aber nicht durch zirkulierende oder splenic NK-Zellen, die gewöhnlich ihre leichte Zugänglichkeit gegeben sucht.
Gereinigte und aktive MP-Leukozyten sind nicht zugänglich über die Standard - Ernteverfahren von Leukozyten aus den Lungen, die auf das Lungengewebe Schleifen oder biologischen Abbau 9 basieren. Unser Ansatz hat zwei wesentliche Vorteile im Vergleich zu Gewebeverarbeitung Ansätze. Zunächst erntet die Perfusion Ansatz selektiv MP-Leukozyten, um sie von anderen Zellen zu trennen, die von der Lunge parenchymal, interstitielle stammen, und bronchoalveoläre compartments. Zweitens besser ist die Perfusion Technik bewahrt die Integrität und das physiologische Milieu von MP-Leukozyten, im Gegensatz zum Schleifen und biologische Verarbeitung Ansätze, die Zellen schädigen, ihre Morphologie zu verändern, und die Produktion und Freisetzung von verschiedenen Faktoren induzieren, die Immunaktivität modulieren und speziell NK unterdrücken Zytotoxizität 10.
Die Lungen sind eine wichtige Zielorgan für Krebsmetastasen und für verschiedene Infektionskrankheiten. Alle zirkulierenden malignen Zellen und infizierten Zellen gehen durch die Lungenkapillaren, wo sie benötigen, mit Endothelzellen und resident Leukozyten zu verformen und zu interagieren. Unter diesen Bedingungen können zirkulierenden Zellen leicht durch resident MP-Leukozyten ausgerichtet sein. Es scheint also von Vorteil, biologisch aktivierten Leukozyten in diesem Immunraum zu haben, und es ist wichtig, diese einzigartige MP-Population in verschiedenen biologischen, experimentellen und klinischen Einstellungen zu studieren. Es ist erwähnenswert, dass sy zu beachtenstemic Immunaktivierung durch verschiedene biologische-response-modifiers (zB Polyinosin-Polycytidylsäure (Poly I: C) oder Typ-C CpG - Oligodesoxynukleotide (CpG-C - ODN)) wurden MP-Leukozyten mehr als zirkulierende Leukozyten 3 gezeigt , zu aktivieren , 8,11.
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Protocol
Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der Universität Tel Aviv genehmigt.
1. Rat Protokoll
- Die Vorbereitungen
- Vereinbaren 2 Schmetterling 21 G Nadeln. Optional vorbereiten 2 stumpfkantige Schmetterling 21 G Nadeln durch die scharfe Kante der Nadel Einreichung.
- Sterilisieren chirurgische Instrumente: 2 Paar Scheren, abgestumpft kantigen Zange, hemostat, Zahngewebe durch Autoklaven bei 121 ° C sterilisiert Zange für mindestens 30 min auf die Schwerkraft (trocken) Einstellung.
- Bereiten heparinisiertem PBS (30 units / ml) durch Zugabe von 30 Einheiten Heparin pro ml phosphatgepufferter Salzlösung (1x PBS) -Lösung. Verwenden Sie bei RT. 35 ml ist das Minimalvolumen pro Tier benötigt.
- Streamen heparinisiertem PBS in die peristaltische Pumpe Leitungen und den Schmetterling Nadeln Luftblasen zu vermeiden.
- Perfusion der Lunge und der Sammlung von MP-Leukozyten
- Euthanize das Tier durch eine Überdosis von 8% Isofluran. Bestätigen Sie die Euthanasie durch Überwachung der Atmung Aufhören.
- Nach Absetzen der Atmung zu öffnen, sofort die Peritonealdialyse und Brust Hohlräume unter Verwendung der sterilen Schere und Zahngewebe Pinzette. Führen Sie eine Mittellinie Bauchschnitt entlang der Bauch zum Xiphoidbasis auf.
- Heben Sie das Brustbein mit der Pinzette vorsichtig den Brustkorb auf beiden Seiten schneiden, ohne inneren Organen oder große Blutgefäße Punktierung. Klemmen Sie einen hemostat auf dem Brustbein und rostral den Brustkorb falten Sie die Herz-Lungen-Komplex zu belichten.
- Legen Sie eine Schmetterlingsnadel in den rechten Ventrikel des Herzens, und innerhalb von etwa einer Minute sammeln, um die maximale Menge an Blut in eine Spritze (~ 6 ml von einem 250 g Tier).
- Klemmen Sie die Hohlvene mit einer hemostat rückwärts Perfusion der Leber zu vermeiden (siehe Diskussion).
- Halten Sie die Butterfly-Nadel innerhalb des rechten Ventrikels, während die Spritze ersetzt das Blut mit dem Ablaufrohr des p enthält,eristaltic Pumpe.
- Legen Sie eine zweite Butterfly-Nadel in eine 5 ml Ernte Spritze in den linken Ventrikel verbunden ist, das Eindringen der Scheidewand zu vermeiden.
- Schalten Sie die peristaltische Pumpe bei einer Geschwindigkeit von etwa 5 ml / min und schonend sammelt in die Spritze die ersten ml Perfusat, die mit Blut kontaminiert sind. Fortfahren, bis das Perfusat Farbe von dunkel färbt sich rot bis hellrot. (Entsorgen Sie das Blut kontaminierte perfuste).
- Ohne Einstellung der peristaltischen Pumpe ersetzen schnell die 5 ml Ernte Spritze mit einer 20 ml Spritze und Ernte sammeln 20 ml Lungen Perfusat eine höhere Geschwindigkeit der Perfusion verwendet wird (bis zu 7 ml / min). Kontinuierlich überwacht die Perfusat Strom in die Sammel Spritze, während Vakuumbildung zu vermeiden.
- Cease den Fluss der Schlauchpumpe.
- Leukozyten-Extraktion
- Zentrifugieren Sie die Perfusat für 10 Minuten bei 400 × g.
- Saugen Sie das Fluid.
- 10 ml PBS oder Medium, Zentrifuge bei 400 × g für 10 min, und die Flüssigkeit anzusaugen. Zweimal wiederholen Sie diesen Schritt. Die Verwendung von PBS oder Medium hängt von der konsequente Einsatz der Probe.
- 20 ml PBS oder Medium, Zentrifuge bei 400 × g für 10 min, und die Flüssigkeit anzusaugen.
- Rekonstituieren der Zellen auf die gewünschte Konzentration, bezogen auf die Probenverwendungs (FACS, PCR, etc.).
2. Maus-Protokoll
- Die Vorbereitungen
- Vereinbaren 2 Schmetterling 25 G Nadeln. Optional vorbereiten 2 stumpfkantige Schmetterling 25 G Nadeln durch die scharfe Kante der Nadel Einreichung.
- Sterilisieren chirurgische Instrumente: 2 Paar Scheren, abgestumpft kantigen Zange, hemostat, Zahngewebe durch Autoklaven bei 121 ° C sterilisiert Zange für mindestens 30 min auf die Schwerkraft (trocken) Einstellung.
- Bereiten heparinisiertem PBS (30 units / ml) durch Zugabe von 30 Einheiten Heparin pro ml 1x PBS-Lösung. Verwenden Sie bei RT. 25 ml ist das Minimalvolumen pro Tier benötigt.
- strePBS in die peristaltische Pumpe Leitungen und den Schmetterling Nadeln am heparinisiert Luftblasen zu vermeiden.
- Perfusion der Lunge und der Sammlung von MP-Leukozyten
- Euthanize das Tier durch eine Überdosis von 8% Isofluran. Bestätigen Sie die Euthanasie durch Überwachung der Atmung Aufhören.
- Nach Absetzen der Atmung zu öffnen, sofort die Peritonealdialyse und Brust Hohlräume unter Verwendung der sterilen Schere und Zahngewebe Pinzette. Führen Sie eine Mittellinie Bauchschnitt entlang der Bauch zum Xiphoidbasis auf.
- Heben Sie das Brustbein mit der Pinzette vorsichtig den Brustkorb auf beiden Seiten schneiden, ohne inneren Organen oder große Blutgefäße Punktierung. Klemmen Sie einen hemostat auf dem Brustbein und rostral den Brustkorb falten Sie die Herz-Lungen-Komplex zu belichten.
- Klemmen Sie die Hohlvene mit einer hemostat rückwärts Perfusion der Leber zu vermeiden (siehe Diskussion).
- Legen Sie eine Schmetterlingsnadel an das Auslaufrohr der Schlauchpumpe in die richtige ven verbundentricle des Herzens, und eine zweite Schmetterlingsnadel in ein 2 ml Ernte Spritze in den linken Ventrikel des Herzens verbunden ist, avoidingpenetration des interventrikulären Septums.
- Schalten Sie die Pumpe mit einer Geschwindigkeit von etwa 2 ml / min und sammeln die ersten Milliliter Blut verunreinigten Perfusat in die Ernte Spritze, bis das Perfusat aus dunkel färbt sich rot bis blass (Entsorgen Sie das Blut kontaminierte perfuste).
- Ohne Einstellung der peristaltischen Pumpe ersetzen schnell die 2 ml Ernte Spritze mit einer 10 ml Spritze und Ernte sammeln 10 ml Lungen Perfusat eine höhere Geschwindigkeit der Perfusion verwendet wird (bis zu 4 ml / min). Kontinuierlich überwacht die Perfusat Strom in die Sammel Spritze, während Vakuumbildung zu vermeiden.
- Cease den Fluss der Schlauchpumpe.
- Leukozyten-Extraktion
- Zentrifugieren Sie die Perfusat für 10 Minuten bei 400 × g.
- Saugen Sie das Fluid.
- 10 ml PBS oder Medium, Zentrifuge bei 400xg für 10 min, und die Flüssigkeit anzusaugen. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal. Die Verwendung von PBS oder Medium hängt von der konsequente Einsatz der Probe.
- 10 ml PBS oder Medium, Zentrifuge bei 400 × g für 10 min, und die Flüssigkeit anzusaugen.
- Rekonstituieren der Zellen auf die gewünschte Konzentration, bezogen auf die Probenverwendungs (FACS, PCR, etc.).
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Representative Results
Der MP-Fach weisen eine unterschiedliche Leukozyten-Subset Zusammensetzung im Vergleich zu Leukozyten zirkulieren. Verwendung von Durchflußzytometrie-Analyse wurden Leukozyten-Subpopulationen identifiziert und die Zusammensetzung von sowohl zirkulierenden Leukozyten und MP zu charakterisieren quantifiziert. Granulozyten und Lymphozyten wurden basierend auf Vorwärts- und Seitenstreuungen identifiziert. Innerhalb der Lymphozyten wurden NKRP-1 helle Zellen NK - Zellen, CD3 + T - Zellen als, RM1 + Monozyten identifiziert und CD4 + / CD8 + / CD25 + wurden zur T - Zell - Subpopulationen Identifizierung verwendet. Angeborene Immunozyten, einschließlich Granulozyten, Monozyten und NK-Zellen bildeten 52% (± 1,52%) der MP-Leukozyten Population, im Vergleich zu 27,9% (± 0,66%) in den Kreislauf (p <0,05). Gegenteil, die T - Zell - Subpopulationen, einschließlich CD4 +, CD4 + CD8 + T - Zellen und regulatorische (CD4 + CD25 +)T-Zellen, sowie dendritische Zellen, zeigten niedrigere Prozentsätze in den MP Raum gegenüber dem Kreislauf (p <0,005; n = 8). Zellausbeute im MP Fach dieses Stammes bilden von etwa 3 Millionen Leukozyten (Abbildung 1).
In NK-Zellen sind zwei Subpopulationen evident, basierend auf Zellgröße. Mit einem Streudiagramm von Vorwärtsstreuung durch NKRP-1 Markierung wurden NK-Zellen unterteilt in kleine und große NK-Zellen. Der MP Fach weist eine 3-fach höheren Prozentsatz an großen NK - Zellen (~ 30%) im Vergleich zum Kreislauf (~ 10%), während die Gesamtzahl von NK - Zellen ähnlich ist (Abbildung 2). Außerdem wurde 8 gemessen , um den Standard - 4 Stunden 51 Cr - Freisetzungs - Assay, NK anti-Tumor - Zytotoxizität gegen mehrere Zieltumorzellen verwendet wird . Kurz, dieser Test die Menge an 51 Cr aus Tumorzellen als Ergebnis der spezifischen Zytotoxizität durch NK - Zellen freigesetzt beurteilts. Die Fähigkeit von NK - Zellen aus dem MP Kompartiment Tumorzellen zu lysieren größer als NK - Zellen zirkulierende (Figur 3), wie offensichtlich gegen die beiden MADB106 syngenen Zelllinie (3A), und die YAC-1 - Standard - Zelllinie (3B) . Darüber hinaus habe ich die Immunstimulation durch in - vivo - Poly: produziert C - Administration eine profunde Auswirkung auf NK Zytotoxizität von MP-NK - Zellen als auf NK - Zellen zirkuliert , wenn MADB106 Zielzelllinie verwendet wird (3A).
Abbildung 1. Verschiedene Leukozyten - Subset Zusammensetzung charakterisiert das MP-Fach im Vergleich zur Zirkulation in F344 Ratten. Im Abteil MP wird die Fraktion der angeborenen Immunität größer im Vergleich zu den entsprechenden Betrag in den Kreislauf (52% vs. 28%), während die Häufigkeit von T-Zellen, eine entgegengesetzte Abweichung aufweisen (p0; 0,005; n = 8). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. erhöhten Prozentsatz von großen NK - Zellen in der MP Fach gegenüber dem Zirkulations MP-NK - Zellen zeigte eine dreifach höhere Prozentsatz an großen NK - Zellen im Vergleich zu zirkulierenden NK - Zellen (30% vs. 10%, respectively;. P < 0,05), während die Gesamtzahl der NK - Zellen ähnlich ist. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Höhere NK Zytotoxizität im MP Fach im Vergleich zu den Kreislauf.(A) MADB106 Zielzellen - NK - Zellen aus dem MP Raum geerntet zeigte eine deutliche Zytotoxizität gegen diese Zelllinie, während zirkulierenden NK - Zellen keine Zytotoxizität zeigen In - vivo - Immunstimulation durch Poly I:. C erhöht NK Zytotoxizität im Abteil MP, aber nicht in den Kreislauf. (B) YAC-1 - Zielzellen - NK - Zellen aus dem MP Raum geerntet zeigten eine höhere Zytotoxizität gegenüber NK - Zellen gegen diese Standard - Zelllinie im Umlauf. Immunstimulation durch Poly I: C erhöht NK Zytotoxizität sowohl im MP Fach und den Kreislauf. NK-Zellzahlen wurden auf Cytotoxizität Beurteilung gesteuert. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Das vorgestellte Verfahren ermöglicht hier die selektive Ernte und das Studium der einzigartigen Population von MP-Leukozyten. Im Vergleich zum Zirkulieren oder splenic Leukozyten wird die MP Population durch eine bestimmte Zusammensetzung der Leukozyten - Subpopulationen gekennzeichnet, höhere Aktivierungsstufen, höhere Freisetzung verschiedener Cytokine, und höhere mRNA - Spiegel von pro- und anti-inflammatorischen Zytokinen 2,3. Insbesondere haben wir gezeigt , dass die MP-NK - Zellen cytotoxischer als Kreislauf NK - Zellen gegen verschiedene Zielzellen 3,4, und eine höhere Interferon-γ exprimieren. Insgesamt Unsere Ergebnisse legen nahe, dass MP-NK Leukozyten eine grßere Zytotoxizität als NK Zellen zirkuliert, und somit eine größere biologische Bedeutung bei der Kontrolle der hämatogenen Metastasierung und Lungenmetastasen bedeuten kann. Daher sollte Milz- oder zirkulierenden Leukozyten nicht als Goldstandard oder Standard-Population zum Reflektieren immunologischen Status und Studien am Menschen in Betracht gezogen werden, dass commonly verlassen sich ausschließlich auf Leukozyten zirkulierenden sollten vorsichtig interpretiert werden. Außerdem ist, wie verschiedene Krankheiten speziell auf die Lunge verursachen, sollte Immunität innerhalb dieses Organs untersucht werden, und der MP Fach sollte von der interstitiellen, parenchymal und Bronco-alveolar Unterfächer, wie in der Tat zu unterscheiden ist der Fall Perfusionsmodell Ansatz.
Um den Erfolg dieses Verfahrens zu gewährleisten, ist es von entscheidender Bedeutung, um (i) öffnen Sie die Bauch- und Brusthöhlen schnell nach der vollständigen Einstellung der Atmung, einen Blutdruck aufrecht zu erhalten, die maximale Herz Blutentnahme ermöglicht, und (ii) Abstand zu nehmen von einer unerwünschten zusätzlichen Perforation der Herzkammer durch die Verwendung von stumpfkantige Schmetterlingsnadeln. Ein weiteres wesentliches Hindernis ist die mögliche Kontamination des Blutes in der Lunge Perfusat. Als die ersten Milliliter Lunge Perfusat mit Herzblut kontaminiert sind, sollten sie als nachgewiesen werden verworfen. Um das zu erreichen Standardisierung zwischen aniMals, das Kriterium von dunkelrot auf dem Farbübergang zu beginnen, die MP Perfusat sammeln basierend rot bis hellrot. Außerdem wird empfohlen , die vena cava mit einer nicht-gezahnte hemostat festzuklemmen, rückwärts Perfusion der Leber zu vermeiden, besonders wenn man Leberzellen durch sukzessive Perfusion der Leber auch zu sammeln wünscht marginating. Während das Perfusat aus dem linken Ventrikel zu sammeln, ist es entscheidend, nicht der interventrikulären Septum zu durchdringen. Zuletzt wird das Heparin in PBS für die Perfusion verwendet entscheidend für die MP-Leukozyten Population aus den Kapillaren zu trennen und damit zu verwenden.
Mehrere Störungen auftreten können, wenn dieses Verfahren durchführen, aber die meisten von ihnen sind korrigierbar. Wenn es eine Leckage von der Einstichstelle der Nadel in das Herz ist, wird vorgeschlagen, die geplatzten Herzmuskel mit einem stumpfen Nase Zange mit geriffelten Spitzen rund um die Butterfly-Nadel zu versiegeln. Wenn eine Nadel rutschige, stop die peristaltische Pumpe, wieder einsetzen, die Nadel in seine ursprüngliche Einstichstelle, und die Pumpe neu zu starten. Wenn Sammlung Fluss stoppt, stoppen den Sammelunterdruck, um die Nadel innerhalb des Ventrikels verlagern, und die Sammlung neu zu starten. Wenn der linke Vorhof aufgeblasen wird, und nicht durch eine kontinuierliche Sammlung verringert die Strömungsrate der Pumpe zu senken. Im Allgemeinen ist eine hohe peristaltische Strömungsgeschwindigkeit der Kapillare Bildung schaden kann, und die Lunge kann anschwellen.
Das beschriebene Verfahren ermöglicht hier eine selektive Ernte der MP Leukozytenpopulation in einem relativ einfachen Verfahren. Da diese Population einzigartigen Eigenschaften im Vergleich zu Leukozyten aus anderen Immun Abteile aufweist, und dass diese Bevölkerung kann die biologische und klinische Bedeutung für den Organismus, schlagen wir die Anwendung dieser Methode, wenn möglich, vor allem, wenn Lungenbezogenen Prozesse und Krankheiten zu studieren. Es ist noch nicht bekannt, ob MP-Zellen, die in der Lunge befinden capillWidder auf Zellen Ernten wurden in der Lunge gereift, oder ob sie ihre Eigenschaften beim Verlassen der Lunge aufrechterhalten würde. Wie Leukozyten aus anderen Fächern reflektieren möglicherweise nicht das Profil der MP Bevölkerung, und da es nicht zugänglich für den Menschen ist, schlagen wir vor weiteren Verwendung dieser Methode bestimmte zirkulierende Biomarker zu erläutern, die mit den einzigartigen Eigenschaften MP korrelieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren und diese Arbeit wurden von NIH / NCI Zuschuss # R01CA172138 (auf SBE) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclud Peristaltic pump | |||
| Butterfly needle | OMG | 26G | |
| Butterfly needle | OMG | 21G*3/4" | |
| Syringe | Pic solution | 1 ml | |
| Syringe | Pic solution | 2.5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 10 ml | |
| Syringe | Pic solution | 25 ml | |
| Blunted-edged forceps | |||
| Scissors | |||
| hemostat | |||
| Tissue forceps | |||
| Heparin sodium porcine mucosa (perservative free) | Sigma Aldrich |
References
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