Introduction
폐의 모세 혈관 (즉, marginating - 폐 (MP) 백혈구) (1) 다른 면역 구획 (예를 들어, 순환, 비장, 골수)에서 백혈구에 비해 뚜렷한 백혈구의 구성과 독특한 활성을 나타내는 것으로 나타났다 2-에 부착 백혈구 4. 예를 들어, 순환 및 비장 NK 세포뿐만 아니라, 분화 된 전령 RNA (mRNA의) 레벨 및 프로와 항 염증성 사이토 카인의 분비 증가에 비해 다양한 종양 세포에 대하여 MP-백혈구 전시보다 천연 킬러 (NK) 세포 독성. MP-백혈구 순환 백혈구 (50 % 대에 각각 30 %)에 비해 본래 / 적응 면역의 높은 비율을 가지고있는 세포의 조성물은 순환하는 백혈구와 구별된다. 여기에 제시된 방법의 목적은, MP-백혈구의 선택적 수확을 가능하게이 중요하고 독특한 면역 구획 (세포 인구)을 연구하기 위해, 그리고 eluc하는 것입니다이러한 특정 세포에 대한 각종 조작 (예를 들면, 면역 활성)의 효과를 IDATE.
이 독특한 인구의 의미를 이해하기 위해서는, 면역 시스템 세포 매개 면역 (CMI)의 생체 내 기능을 통해 종양 세포, 미세 전이 및 잔여 질병을 순환 제어 할 수 있다는 것이 중요하다. 이 능력은 원발 종양을 제어하는 면역계의 선행 장애에도 불구하고 명확하며, 암 환자 및 동물 모델에서 생체 내 5 충분한 증거에 의해 지원된다. 중요한 것은, 이러한 연구 결과는 6,7가 (세포 독성 분석에 의해 측정) 종종 시험 관내 대부분의자가 종양 세포는 인간과 동물에서 혈액 샘플에서 백혈구를 순환시켜 세포 독성에 내성이보고 생체 연구와 일치한다. 이 차이는 같은 상술과 같은 별개의 백혈구 인구의 생체 내 존재에 기인 할 수있다상술 한 MP 백혈구 인구 및 활성화 NK 세포 (3) 구체적으로는 모집단. 실제로, 순환 및 비장 백혈구에 강한 것으로 밝혀졌다 동계 종양 세포 (MADB106)은, MP-NK 세포 -3,8- 의해 용해되는 것으로 도시 하였다. 따라서 fischer344 (F344) 쥐의 폐에 전이 의심 'NK 내성'MADB106 세포 아니라 순환 또는 일반적 접근 용이성을 부여 다룬다 비장 NK 세포에서 MP-NK 세포에 의해 제어된다.
정제 및 활성 MP-백혈구는 폐 조직의 분쇄 또는 생물학적 분해 (9)를 기반으로 폐에서 백혈구의 표준 수확 방법을 통해 액세스 할 수 없습니다. 우리의 접근 방식은 조직 처리 방법에 비해 두 가지 이점이있다. 먼저, 관류 방법은 선택적으로 다른 폐 실질 간질 세포에서 유래 한 기관지 폐포 비교 예에서 그들을 분리 MP-백혈구 수확tments. 둘째, 더 관류 기술은 분쇄 및 생물학적 처리와 달리 무결성 및 MP-백혈구의 생리적 환경을 유지하는 것은 손상 세포는 그들의 형태를 변경하고, 제조 및 면역 활성을 조절 특히 NK을 억제하는 다양한 인자의 방출을 유도하는 것으로 접근 세포 독성 10.
폐 암 전이 및 각종 감염성 질환의 주요 표적 장기입니다. 모든 순환 악성 세포와 감염된 세포는 변형 및 모세 혈관 내피 세포 및 주민 백혈구와 상호 작용하는 데 필요한 폐 모세 혈관을 통해 전달합니다. 이러한 조건 하에서, 세포의 순환을 용이하게 상주 MP-백혈구 타겟팅 할 수있다. 그것은 따라서이 면역 구획 활성화 백혈구을 가지고 생물학적으로 유리한 것, 그리고 서로 다른 생물학적 실험, 임상 설정에서이 독특한 MP-인구를 연구하는 것이 중요하다. 그 한건데주의하는 가치가있다다양한 생물학적 반응 - 수정하여 stemic 면역 활성화 (예를 들어, polyinosinic-polycytidylic 산 (폴리는 I : C) 또는 유형-C의 CpG 올리고 데 옥시 뉴클레오티드 (의 CpG-C ODN)를), 순환 백혈구 3보다 MP-백혈구 더 활성화하는 것으로 나타났다 8,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
동물 주제와 관련된 절차 텔 아비브 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 쥐 프로토콜
- 준비
- 2 나비 21 G 바늘을 정렬합니다. 선택적으로, 바늘의 날카로운 가장자리를 제출하여이 무딘 칼날 나비 21 G 바늘을 준비합니다.
- 중력 (건조) 설정에 적어도 30 분 동안 121 ° C에서 오토 클레이브 멸균 가위 이쌍, 무딘 칼날 집게, 지혈, 치아 조직 겸자 : 수술 도구를 소독.
- 인산염 완충 식염수 (1X PBS) 용액 1 ㎖ 당 30 단위의 헤파린을 첨가하여 PBS 헤파린 (30 유니트 / ㎖)을 준비한다. RT에서 사용합니다. 35 ml의 동물에 따라 필요한 최소한의 볼륨입니다.
- 공기 방울을 방지하기 위해 연동 펌프 라인과 나비 바늘로 헤파린 PBS 스트림.
- MP-백혈구의 폐와 컬렉션의 관류
- 8 %의 이소 플루 란의 과다 복용으로 동물을 안락사. 모니터링 호흡 정지에 의한 안락사를 확인합니다.
- 호흡 중단시 즉시 멸균 가위와 치아 조직 집게를 사용하여 복강와 가슴 충치를 엽니 다. 칼 모양의 과정 복부까지 따라 중간 선 복부 절개를 수행합니다.
- 내부 장기 또는 큰 혈관을 천공하지 않고, 조심스럽게 양쪽의 갈비뼈를 절단 집게를 사용하여 흉골을 들어 올립니다. 흉골에 지혈을 클램프 및 rostrally 심폐 복잡한을 노출 흉곽을 접습니다.
- 심장의 우심실에 나비 바늘을 삽입하고 약 분 이내에 (~ 250g 동물 6 ml)에 주사기로 혈액의 최대 볼륨을 수집합니다.
- 간 (토론 참조)의 후방 관류을 피하기 위해 지혈과 대정맥을 클램프.
- (P)의 유출 관으로 혈액을 함유하는 주사기를 교체하는 동안 우심실 내의 버터 플라이 니들 홀드eristaltic 펌프.
- 심실 중격의 침투를 방지 좌심실에 5 ml의 수확 주사기에 연결된 제 2 나비 바늘을 삽입합니다.
- 약 5 ml / 분의 속도로 연동 펌프의 전원을 켜고 조심스럽게 주사기로 혈액으로 오염 관류의 첫 번째 밀리리터를 수집합니다. 관류 색상이 빨간색으로 옅은 어둠에서 꺼질 때까지 계속합니다. (혈액 오염 perfuste 폐기).
- 연동 펌프의 중단없이 빠른 속도로 20 ml의 수확 주사기와 5 ml의 수확 주사기를 교체하고 관류의 더 높은 속도 (최대 7 ml / 분)를 사용하는 폐 관류 20 ㎖를 수집합니다. 진공 형성을 방지하면서 지속적으로 수집 주사기에 관류 흐름을 모니터링한다.
- 연동 펌프의 흐름을 중단.
- 백혈구 추출
- 400 × g에서 10 분간 원심 분리하여 관류 액.
- 유체를 대기음.
- 10 분 동안 400 XG에 10 ml의 PBS 또는 매체, 원심 분리기를 추가하고 유체를 대기음. 두 번이 단계를 반복합니다. PBS 또는 배지의 사용은 시료의 결과적인 사용에 의존한다.
- 10 분 동안 400 XG에 20 ml의 PBS 또는 매체, 원심 분리기를 추가하고 유체를 대기음.
- 시료 사용량 (FACS, PCR 등)에 기초하여, 원하는 농도로 세포를 재구성.
2. 마우스 프로토콜
- 준비
- 2 나비 25 G 바늘을 정렬합니다. 선택적으로, 바늘의 날카로운 가장자리를 제출하여이 무딘 칼날 나비 25 G 바늘을 준비합니다.
- 중력 (건조) 설정에 적어도 30 분 동안 121 ° C에서 오토 클레이브 멸균 가위 이쌍, 무딘 칼날 집게, 지혈, 치아 조직 겸자 : 수술 도구를 소독.
- 1X PBS 용액 1 ㎖ 당 30 단위의 헤파린을 첨가하여 PBS 헤파린 (30 유니트 / ㎖)을 준비한다. RT에서 사용합니다. 25 ml의 동물에 따라 필요한 최소한의 볼륨입니다.
- 헤어 구조 강화공기 방울을 방지하기 위해 연동 펌프 라인과 나비 바늘로 PBS 헤파린을하고있다.
- MP-백혈구의 폐와 컬렉션의 관류
- 8 %의 이소 플루 란의 과다 복용으로 동물을 안락사. 모니터링 호흡 정지에 의한 안락사를 확인합니다.
- 호흡 중단시 즉시 멸균 가위와 치아 조직 집게를 사용하여 복강와 가슴 충치를 엽니 다. 칼 모양의 과정 복부까지 따라 중간 선 복부 절개를 수행합니다.
- 내부 장기 또는 큰 혈관을 천공하지 않고, 조심스럽게 양쪽의 갈비뼈를 절단 집게를 사용하여 흉골을 들어 올립니다. 흉골에 지혈을 클램프 및 rostrally 심폐 복잡한을 노출 흉곽을 접습니다.
- 간 (토론 참조)의 후방 관류을 피하기 위해 지혈과 대정맥을 클램프.
- 오른쪽 VEN으로 연동 펌프의 유출 관에 연결되는 버터 플라이 니들을 삽입마음의 tricle하고, 심장, 심실 중격의 avoidingpenetration의 좌심실에 2 ml의 수확 주사기에 연결된 제 2 나비 바늘.
- 약 2 ml / 분의 속도로 펌프를 켜고 관류가 (혈액 오염 perfuste 폐기) 빨간색 옅은 어둠에서 꺼질 때까지 수확 주사기로 혈액 오염 관류의 첫 번째 밀리리터를 수집합니다.
- 연동 펌프의 중단없이 빠른 속도로 10 ml의 수확 주사기 2 ml의 수확 주사기를 교체하고 관류의 더 높은 속도 (최대 4 ml / 분)를 사용하는 폐 관류 10 ㎖를 수집합니다. 진공 형성을 방지하면서 지속적으로 수집 주사기에 관류 흐름을 모니터링한다.
- 연동 펌프의 흐름을 중단.
- 백혈구 추출
- 400 × g에서 10 분간 원심 분리하여 관류 액.
- 유체를 대기음.
- 400에 10 ml의 PBS 또는 매체, 원심 분리기 추가10 분간 XG 및 유체를 흡인. 이 단계를 세 번 반복합니다. PBS 또는 배지의 사용은 시료의 결과적인 사용에 의존한다.
- 10 분 동안 400 XG에 10 ml의 PBS 또는 매체, 원심 분리기를 추가하고 유체를 대기음.
- 시료 사용량 (FACS, PCR 등)에 기초하여, 원하는 농도로 세포를 재구성.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MP-구획 전시 다른 백혈구 하위 집합 조성물은 백혈구 순환 비교. 유세포 분석을 이용하여, 백혈구 개체군 식별 모두 순환 및 MP 백혈구의 조성물의 특징을 정량화 하였다. 과립구와 림프구는 전방 및 측면 산란을 기반으로 확인되었다. 림프구 내 NKRP-1 세포는 밝은 NK 세포, 단핵구와 같은 T 세포로서 CD3 +, RM1 + 및 CD4 + / CD8 + / CD25로 확인 하였다 + T 세포 개체군의 식별을 위해 사용되었다. 과립구, 단핵구 및 NK 세포를 포함하여 면역 세포가 선천적으로, 순환 (p <0.05), 27.9 % (± 0.66 %)에 비해, MP-백혈구 인구의 52 % (± 1.52 %)를 구성. 반대로, CD4 +, CD4 + CD8 + T 세포 및 규정 (CD4 + CD25 +)을 포함하는 T 세포의 아 집단,T 세포,뿐만 아니라 수상 세포는 순환 비교 MP 구획 낮은 비율을 나타내었다 (p <0.005, N = 8). 이 균주의 MP 실에서 세포 수율은 약 3 백만 백혈구 (그림 1)으로 구성한다.
NK 세포 내 두 개체군은 셀 크기에 기초하여 명백하다. NKRP-1 표시하여 앞으로 분산의 산포도를 사용하여, NK 세포는 크고 작은 NK 세포로 나누었다. NK 세포의 총 수 (도 2)와 유사한 반면 MP 구획은 순환 (~ 10 %)에 비해 큰 NK 세포 (~ 30 %)의 3 배 높은 비율을 나타낸다. 또한, 표준 4 시간 51 CR 방출 분석을 이용하여, 여러 표적 종양 세포에 NK 항암 세포 독성 8을 측정 하였다. 곧,이 분석은 NK 세포에 의한 비 독성의 결과로서 종양 세포로부터 방출 (51)의 Cr 량을 평가에스. 종양 세포를 용균하는 MP 구획에서 NK 세포의 능력은 NK 세포를 (도 3), 모두 MADB106 동계 세포주 (도 3A)에 대한 명백한 바와 같이 순환보다 크고, YAC-1 표준 세포주 (도 3b) . 또한, 생체 내에서 폴리 통해 면역 자극 I는 : C 행정부 MADB106 목표 세포주 (도 3a)을 사용하는 경우 NK 세포 순환보다 MP-NK 세포의 NK 세포 독성에 더 큰 영향을 생성한다.
그림 1. 다른 백혈구 집합 조성물 F344 래트 순환 비교 MP 격벽 특징. T 세포의 빈도는 반대측의 차이를 나타내는 반면 MP 구획, 선천성 면역의 분획 (p, 순환 (52 % 대 28 %)에 상당에 크게 비교되는0; 0.005; N = 8). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2는 순환 비교 MP 구획 큰 NK 세포의 비율을 증가 MP-NK 세포 전시 3 배 각각 NK 세포 순환에 비해 큰 NK 세포의 높은 비율 (30 % 대 10 %;. p < NK 세포의 총 수는 유사하다 동안 0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
순환에 비해 MP 함 3. 높은 NK 세포 독성 그림.(A) MADB106 표적 세포 - MP 구획에서 수확 NK 세포가이 세포주에 대한 현저한 세포 독성을 나타내, 순환 NK 세포가 세포 독성을 보여주지 상태에서 생체 폴리에 의한 면역 자극 내가 :. C는 MP 실에서 NK 세포 독성을 증가하지만 순환. (B) 목표 YAC-1 세포 - MP 구획에서 수확 NK 세포는이 표준 세포주에 대해 NK 세포 순환에 비해 더 높은 세포 독성을 나타내었다. 폴리에 의한 면역 자극은 내가 : C는 MP 함과 순환 모두에서 NK 세포 독성을 증가시킨다. NK 세포의 수는 세포 독성 평가를 조절 하였다. 데이터는 SEM ± 평균으로 표현된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
본 명세서에있어서, 상기 선택적 수확을 가능 MP-백혈구 고유 인구 공부. 순환 또는 비장 백혈구에 비해 MP 인구 백혈구 개체군의 고유 조성물 높은 활성 수준, 다양한 사이토 카인의 높은 릴리스 및 프로와 항 염증성 사이토 카인 2,3- 높은 mRNA 수준을 특징으로한다. 구체적으로, 우리는 MP-NK 세포는 다양한 표적 세포에 대해 3,4- 순환 NK 세포보다 더 독성이 있고, 인터페론 γ 높은 수준의 발현을 보여 주었다. 전반적으로, 우리의 결과는 MP-NK 백혈구는 혈액을 매개로 전이 및 폐 전이를 조절하는데 더 큰 생물학적 중요성을 의미 할 수있다, 따라서 NK 세포를 순환하고,보다 더 큰 세포 독성을 가지고하는 것이 좋습니다. 따라서, 비장 또는 순환 백혈구가 골드 표준 또는 면역 상태를 반영하기위한 기본 인구, 인간 연구로 간주해서는 안 그 닷컴monly는 조심스럽게 해석되어야 백혈구 순환에 전적으로 의존하고 있습니다. 각종 질병 특이 폐 준다 더욱이, 면역력이 기관 내 연구되어야하며, MP 실이 삽입, 실질 및 야생마 치조 서브 구획 구별되어야로서 실제로 우리 관류 방식을 사용하는 경우이다.
이 절차의 성공을 보장하기 위해, (I) 급격히 호흡 완전히 중단 다음 복부와 가슴 공동을 열고 최대 심장 채혈을 가능하게 혈압을 유지하고, (ⅱ)가 바람직하지 않은 부가 자제에 중요 무딘 칼날 나비 바늘의 사용을 통해 심장 심실의 천공. 또 다른 주요 장애물은 폐 관류 내에서 혈액의 오염 가능성이다. 폐 관류의 첫 번째 밀리리터가 심장 혈액 오염으로 입증 된 바와 같이, 그들은 폐기해야합니다. ANI 간의 표준화를 달성하기 위해,MALS, MP의 관류 수집을 시작하는 기준은 빨간색 옅은 어둠 빨간색의 색상 전환을 기반으로합니다. 또한, 하나는 간 연속 관류 통해 간 세포를 수집하고자 marginating 특히 간 역방향 관류를 피하기 위해, 비 - 톱니 지혈과 대정맥 클램프 것을 권장한다. 좌심실로부터 관류 액을 회수 동안, 심실 중격을 관통하지 중요하다. 마지막으로, PBS에 헤파린은 관류에 사용하면 모세 혈관에서 MP-백혈구 인구를 분리하기 위해 매우 중요합니다, 따라서 사용되어야합니다.
이 절차를 수행 할 때 여러 불량이 발생할 수 있지만, 그 대부분이 정정된다. 중심부에 니들의 관통 부위에서 누설이있는 경우, 버터 플라이 니들 주변 톱니 팁 무딘 집게를 사용하여 코 파열 심근를 밀봉하도록 제안된다. 바늘, STO를 미끄러 져 경우페이지 연동 펌프, 다시 삽입 원래 침투 사이트에 바늘을, 펌프를 다시 시작합니다. 컬렉션의 흐름이 중단되면, 수집 진공 압력을 중단 뇌실 내 바늘을 재배치하고, 컬렉션을 다시 시작합니다. 좌심방이 팽창되고, 연속적인 수집에 의해 감소되지 않는 경우, 펌프의 유량을 낮추고. 일반적으로, 높은 연동 유량 모세관 형성을 해칠 수 있고, 폐 팽윤 될 수있다.
본원에 기재된 방법은 비교적 간단한 절차 MP 백혈구 집단의 선택을 수확 할 수있다. 이 인구는 다른 면역 구획에서 백혈구에 비해 고유 한 특성을 나타내고, 특히 폐 관련 프로세스 및 질병을 연구 할 때 가능한 경우,이 인구가 유기체의 생물학적 및 임상 적 의의를 가질 수있다, 우리는이 방법의 사용을 제안 감안할. 그것은 폐 capill에있는 MP 세포 여부를 아직 알 수없는양자리는 세포 수확에, 폐 성숙, 또는 폐를 떠나시 자신의 특성을 유지할지 여부. 다른 구획에서 백혈구로 MP 인구의 프로필을 반영하고, 인간에 액세스 할 수 없습니다, 우리는 더 독특한 MP 특성과 상관 관계 특정 순환 바이오 마커를 규명하기 위해이 방법을 사용하는 것이 좋습니다하지 않을 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
저자이 작품은 NIH / NCI 부여 # (SBE에) R01CA172138에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclud Peristaltic pump | |||
| Butterfly needle | OMG | 26G | |
| Butterfly needle | OMG | 21G*3/4" | |
| Syringe | Pic solution | 1 ml | |
| Syringe | Pic solution | 2.5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 10 ml | |
| Syringe | Pic solution | 25 ml | |
| Blunted-edged forceps | |||
| Scissors | |||
| hemostat | |||
| Tissue forceps | |||
| Heparin sodium porcine mucosa (perservative free) | Sigma Aldrich |
References
- Kuebler, W. M., Goetz, A. E. The marginated pool. Eur Surg Res. 34, 92-100 (2002).
- Benish, M., et al. The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics. Immunol Res. 58, 28-39 (2014).
- Melamed, R., et al. The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells. J Immunother. 33, 16-29 (2010).
- Shakhar, G., et al. Amelioration of operation-induced suppression of marginating pulmonary NK activity using poly IC: a potential approach to reduce postoperative metastasis. Ann Surg Oncol. 14, 841-852 (2007).
- Smyth, M. J., Godfrey, D. I., Trapani, J. A. A fresh look at tumor immunosurveillance and immunotherapy. Nat Immunol. 2, 293-299 (2001).
- Talmadge, J. E., Meyers, K. M., Prieur, D. J., Starkey, J. R. Role of NK cells in tumour growth and metastasis in beige mice. Nature. 284, 622-624 (1980).
- Grimm, E. A., Mazumder, A., Zhang, H. Z., Rosenberg, S. A. Lymphokine-activated killer cell phenomenon. Lysis of natural killer-resistant fresh solid tumor cells by interleukin 2-activated autologous human peripheral blood lymphocytes. J Exp Med. 155, 1823-1841 (1982).
- Melamed, R., et al. Marginating pulmonary-NK activity and resistance to experimental tumor metastasis: suppression by surgery and the prophylactic use of a beta-adrenergic antagonist and a prostaglandin synthesis inhibitor. Brain Behav Immun. 19, 114-126 (2005).
- O'Dea, K. P., et al. Lung-marginated monocytes modulate pulmonary microvascular injury during early endotoxemia. Am J Respir Crit Care Med. 172, 1119-1127 (2005).
- Sorski, L., Melamed, R., Ben-Eliyahu, A unique role for marginating-pulmonary and marginating-hepatic NK cells in cancer anti-metastatic surveillance and in immunotherapy. Annual Meeting of the Psychoneuroimmunology Research Society, Philadelphia, USA.(2014, , (2014).
- Levi, B., et al. Continuous stress disrupts immunostimulatory effects of IL-12). Brain Behav Immun. 25, 727-735 (2011).
