Abstract
翻訳機構は、 すなわち、ポリソームまたはポリリボソームは、細胞内で最大かつ最も複雑な細胞質機械の一つです。リボソーム、mRNAを、いくつかのタンパク質非コードRNAによって形成されたポリソームは、翻訳制御が行われるプラットフォームを統合表します。リボソームは、広く研究されているがしかし、ポリソームの組織はまだ包括的に理解を欠いています。このように多くの努力がポリソーム組織と埋め込まれていてもよい翻訳制御のいずれかの新たなメカニズムを解明するために必要とされます。原子間力顕微鏡（AFM）は、ナノスケールの解像度で3D画像の取得を可能にする走査型プローブ顕微鏡の一種です。電子顕微鏡（EM）の技術に比べて、AFMの主な利点の一つは、それが染色およびプロ固定を必要とせずに近くの生理学的条件下で維持されるべきサンプルを可能に空気中で、溶液中に両方の画像の数千を取得することができるということですcedures。ここでは、マウス脳及びマイカ基板上での堆積からポリソームの正確な精製のための詳細なプロトコールが記載されています。このプロトコルは、AFMと3次元物体としての復興と空気や液体中でポリソームイメージングを可能にします。低温電子顕微鏡（クライオEM）に相補的な、提案された方法は、好都合に系統的ポリソームを分析し、それらの組織を研究するために使用することができます。
Introduction
タンパク質の合成は、細胞1,2の中で最もエネルギーを消費するプロセスです。したがって、タンパク質の存在量は、主に翻訳なく転写レベル3,4,5で制御されることではない驚くべきことです。ポリソームは、機能的なタンパク質性の読み出しへのmRNAの情報を変換する基本的な高分子成分です。ポリソームは、これまでいくつかの翻訳のコントロールが6-13を収束高分子複合体として認識されています。リボソーム構造14〜16に関する研究の数百にもかかわらず、翻訳のダイナミクスへの詳細な分子洞察やポリソームのトポロジーは、限られた関心が発生しました。その結果、ネイティブポリソームリボ核タンパク質複合体の組織や翻訳に対する潜在的な効果はまだとても曖昧な問題です。ポリソームは、潜在的にどのようなヌクレオソームとエピジェネティック制御をミラーリング、まだ不明注文し、機能的な組織を非表示にすることができますlsコマンドは、転写フィールドに表されています。実際、この魅力的な仮説の調査は、さらなる研究と新しい技術的なアプローチが必要です。この行では、構造的な技術や原子間力顕微鏡は、実り同様にヌクレオソーム17,18のために達成されたものに、遺伝子発現を制御するための新しいメカニズムを解明するために協力することができます。
リボソーム14-16の発見以来、その構造は、広範囲のタンパク質合成のベースにメカニズムの分子の説明を提供する、原核生物19,20、より最近のヒト22における酵母21とで特徴付けられています。ポリソームは、最初は、一般的な2D幾何学的な組織14を形成し 、小胞体の膜に認められました。前に述べたように、ポリソームアセンブリは、リボソーム構造などの一定の関心の対象ではなかったです。過去には、ポリソームはTRによって、本質的に研究されてきましたansmission EMベースの技術。ごく最近になって、クライオEM技術は、人間の細胞溶解物27またはセル28で、23-26 インビトロ翻訳系から精製されたポリソームの3D再構成を可能にしました。これらの技術はポリソーム23、26-28と小麦胚芽ポリソーム24内の隣接するリボソームの接触面の予備的分子の説明ではリボソームリボソーム組織に関するより多くの洗練された情報を提供しました。したがって、クライオEM断層撮影法は、分子の詳細とリボソームリボソーム相互作用の開示を可能にするが、それはデータ処理のために重い計算リソースを必要とする大規模なポスト処理及び再構成の分析によって負担されます。また、リボソームリボソーム相互作用の分子の詳細を得るために、リボソームの高解像度のマップが必要とされ、基準リボソームのこの種のは、ほんの数種のために利用可能です。重要なことは、低温電子顕微鏡断層撮影法では、無料RNAを検出することができません。 Theref鉱石は、新しい技術が完全に翻訳機構の組織を理解する必要があります。
クライオEMのほかに、AFMはまた、下等真核生物29-33と人間27にポリソームの直接画像化のための有用なツールとして採用されています。 EMと比較すると、AFMには、サンプルの固定または標識化を必要としません。また、測定は、近くの生理学的条件下で、はっきりとリボソームと裸のRNA鎖27の両方を特定するユニークな可能性を用いて行うことができます。単一ポリソームのイメージングは、広範かつ重いポスト処理及び再構成に比べて少し後処理の労力でナノ分解能で数千ものイメージを取得し、比較的迅速に行うことができるクライオEM顕微鏡で必要とされる分析。その結果、AFMデータハンドリング及び分析は、高価なワークステーションと高い演算能力を必要としません。このように、この技術は、ポリソームの形状に関する情報を収集し、形態学的特性（例えば高さ、長さと幅）、リボソーム密度、自由なRNAの存在とクライオEMよりも高いスループットでポリソーム27あたりのリボソームの数。このように、AFMはポリソーム27を描写するためにEM技術に強力かつ補完的なアプローチを示します。
ここでは、AFMが画像に適用し、マウス脳ポリソームを分析されたデータの分析に精製からの完全なパイプラインを提示します。提案されたプロトコルは、精製の問題にとAFMイメージングのために使用されているマイカ基板上のポリソームの正確な堆積に焦点を当てています。簡単にAFMコミュニティで使用される一般的なソフトウェアを用いて行うことができる従来の粒子の分析に加えて、RiboPick呼ばImageJの34プラグインは、ポリソーム27、35当たりのリボソームの数をカウントするために提示されています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
マウス組織を得るために使用される慣行は、トレント大学（イタリア）の動物の保護（OPBA）、プロトコルがないためにボディによって承認されました。 art.31政令に従って、04から2015まで、ありません。 2014分の26。全てのマウスを統合生物学センター（CIBIO）、トレント大学、イタリアのモデル生物の施設で維持しました。
注意：サンプルの任意のRNA分解を避けるためのRNaseの混入を最小限にするためにDEPC処理水を使用してすべてのバッファを準備します。
脳全体からポリソームの調製
- 脳組織収集（15分）
- 5分36 CO 2窒息と野生型マウス株C57BL / 6を安楽死させます。慎重に、頭蓋骨36から脳を解剖1.5mlチューブに組織を配置し、直ちに液体窒素中に入れてください。使用するまで-80℃で保管してください。
- 溶解液の調製（30分）
- 使用した全脳組織を粉砕液体窒素下で乳鉢と乳棒。
- 冷たいマイクロ遠心チューブに約25mgの粉末を移し、すぐにすぐに上下にピペッティング25回溶解バッファー（ 表1参照）の0.8ミリリットルを追加し、細胞を崩壊させる（粉砕組織の融解を避けるため）。
- 細胞破片をペレット化し、4℃で1分間、12,000×gでチューブを遠心。
- 新しいマイクロチューブに上清を移し、15分間氷上でチューブを保持します。
- 核とミトコンドリアをペレット化し、4℃で5分間、12,000×gでチューブを遠心。
- 新しいマイクロチューブに上清を移します。
- 6ヶ月の最大のために-80℃で上清を保存したり、すぐにそれを使用しています。
- スクロース勾配調製し、遠心分離（2時間30分）
- RNaseフリー水（ジエチル処理水（DEPC-水）または商業）ANと広範囲に洗浄超遠心管D 3％H 2 O 2 / DEPC H 2 O溶液。
- 氷の上にチューブを入れて、（スクロース溶液については表1を参照）を各チューブの底の冷たい50％ショ糖溶液の5.5ミリリットルを追加します。慎重にチューブが完全に満たされるまで、鋭い相間を維持するために、中間相に近い滞在し、ドロップすることにより、15％ショ糖溶液のドロップを追加します。チューブが完全に満たされると、気泡の形成を回避するために、ゴム栓で閉じます。
- 寒い部屋で静かに水平管を敷設し、2時間、この位置に保管してください。この時間の後、ゆっくりとバック垂直位置にチューブをまっすぐにし、氷の上に置きます。グラデーションは現在、使用される準備ができています。また、前者の従来の勾配を使用して、百分の15から50までのショ糖勾配を準備します。
- すなわち、上清をSTEで得られた（低温室で勾配の上部から慎重に1.0ミリリットルを除去し、細胞質ゾル溶解物とのドロップによりショ糖降下をオーバーレイP 1.2）。
- 慎重スイングバケットローターのバケットにチューブを下げます。超遠心機を用いて、4℃で18万×gで100分間の勾配を遠心分離します。
- 遠心分離後、勾配は安定化させるために4℃で20分間、彼らのバケットにチューブを残します。
- スクロース勾配分画（2時間）
- 慎重に超遠心ローターから1超遠心管を削除し、密度勾配分画システムのコレクタ装置にマウントします。 （ 図1上パネルを参照してください）UV / VIS検出器を用いて260 nmの吸光度を監視する1ミリリットルの画分を収集します。氷の上で集めた画分を保管してください。
- 、関心の画分の30-40μlのアリコートを準備し、使用するまで-80℃で保管する前に、氷の上に保管してください。二つ以上の凍結融解サイクルを受けたアリコートまたはショ糖画分を使用しないでください（ 図1下のパネルを参照）。
原子間力顕微鏡（3時間）2.サンプル調製
- マイカシートをはがし、テープを使用しました。
- DEPC水でマイカシートを3〜4回洗浄し、小さなペトリ皿に入れてください。その後、空気を用いて表面を乾燥させます。
- 1 mMののNiSO 4200μlでマイカをカバーし、室温で3分間インキュベートします。
- ニッケル溶液を外し、空気を用いて表面を乾燥。氷の上に雲母とペトリ皿を置くことによって4℃で将来のすべてのステップを実行してください。
- 氷の上に1.4.2で得られた一定分量を解凍し、軽く雲母のドロップにより試料滴のすべてを追加します。 100~200μlのチップを使用して、雲母の表面全体にサンプルを広げ。 3分間氷上でサンプルをインキュベートします。
- 200μlの冷緩衝液-AFM（ 表1参照）でドロップすることによりマイカシートの低下をカバーし、氷上で1時間インキュベートします。
- 液体中のイメージング
- 慎重にバッファ-AFMを削除し、マイカシート3-4時間を洗います200μlの冷緩衝液-AFMでのsが過剰ショ糖を除去しました。次いで、溶液のいくつかのマイクロリットルで覆われた雲母表面を残し、（ 表1参照）冷洗浄液でマイカシートを3回洗浄します。
- 3（画像取得）を指すように移動します。
- 空気中のイメージング
- 慎重にバッファ-AFMを削除し、過剰ショ糖を除去するために、200μlの冷緩衝液-AFMでマイカ3-4回洗浄します。そして、マイカを冷洗浄溶液で3回洗浄する（ 表1参照 ）、紙を使用して余分な水分を排出します。
- 部分的に開いたペトリ皿の上部との化学フード下で乾燥させるためにサンプルを残します。 2時間後、室温でペトリ皿と店を閉じます。彼らは何年も安定しているように2〜3時間後のサンプルを測定します。
3.画像取得（熱安定化後の画像あたり15分）
注：雲母上に固定化されたポリソームがACモードを使用して、空気中または液体中で画像化することができます。
- 両面テープを使用して、サンプルホルダーに雲母を取り付けます。
- 製造元の指示に従ってAFMステージにおけるサンプルホルダーを挿入します。可能な場合、撮像は、液体中に、時間的にポリソーム安定性を高めるためより低い温度25℃でサンプルを維持しようとします。
- ACイメージングに適したカンチレバーを選択して、チップホルダ以下のメーカーの指示にマウントします。ここでは、空気のイメージングのための2-20 N / mおよび液体イメージングのための周りに0.1 N / mの間に一定の力で使用カンチレバー。
- カンチレバー上のレーザスポットを調整し、象限検出器信号をゼロ。
- 時宜を得た駆動周波数を選択して、10から20ナノメートルの振幅でカンチレバーを駆動します。
- 先端が表面に係合するまでサンプルに近づきます。
- 2×2ミクロンのスキャン領域を選択し、少なくとも512×512ピクセルの画像を取得する（ピクセル幅<4 nm）を、ライブバックグラウンド減算モードと20〜25ナノメートルのZスケールを選択します。
- トンを点検彼は、画像範囲25から30ナノメートルの空気と25と液体中の30nmの幅で取得する際の10と15nmの間の高さによって特徴づけラウンド物体の存在を探しています。鋭利なものを可視化されるまで、設定値とフィードバックのパラメーターを調整します。背景には、いくつかの2-4 nmの高さのオブジェクト（ 図2AおよびBを参照）で、良好な試料中の比較的平坦な表示されます。
- （ポイント3.8で示されるように）画像が良く見える場合は、別のサンプル領域におけるいくつかの（少なくとも10）2×2ミクロンのスキャンを取得します。
- （任意）。必要であれば、選択されたポリソームの高解像度の画像を取得する（ 図2C参照 ）。
- AFM像の任意の傾きを除去し、効果を漂流を修正するためにソフトウェアの修正（平面減算およびライン・バイ・ライン補正アルゴリズム）を適用します。
4.データ解析（画像あたり30分）
- ImageJの中のエクスポート画像（オプション：スケールファクタを適用）preferentially 例えば 、可逆圧縮フォーマットを使用して、TIFF形式（ 図3A参照 ）。
- （ 図3Cを参照）ポリソームでリボソームをカウントする（ 図3Bを参照）、サンプルの統計的特性を計算するために（ImageJのマクロ/ツールセットのサブディレクトリにコピーする）ImageJのマクロツールセットRiboPick.ijmを使用してください。
- プログラムの初期化<読み取り画像>ツールを使用して画像をロードを開始。
- 標準ImageJの<ポイント選択>ツール（シフト+左クリックは、リボソームの複数選択を可能にする）とリボソームセンターを選択してください。 <マークリボソーム>ツールで選択されたリボソームをマークします。リボソーム座標は、カスタムテキストウィンドウに表示されます。
- ポイント4.2.2で示す手順を繰り返す同じポリソームへのより多くのリボソームを追加します。
- 第1に最後に追加されたリボソームから取り外す開始する（<最後のピックを元に戻す>ツールを使用して、誤ってマークされたリボソームを削除します212;現在のポリソーム中のみ）。
- ポリソームが完了すると、<新規ポリソーム>ツールを使用します。ポリソーム数は画像のオーバーレイとして追加されるように、テキストウィンドウが更新されます。
- リボソームを書くために、<結果を保存して閉じを>使用して、ファイル（画像のデフォルトの単位が使用されている）と、選んだリボソームおよびポリソームをまとめたPNG画像を調整します。元の画像は保存されずに閉じられています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
全マウス脳のショ糖勾配ポリソームプロファイリング
彼らの重量とサイズに合わせて巨大分子を分離ポリソームプロファイリングによって、細胞溶解物からポリソームを精製することが可能です。ポリソームプロファイリングでは、このような本例のように培養した細胞または組織から得られた細胞質溶解物は、（その沈降係数に従って40Sおよび60Sサブユニット、80Sリボソームおよびポリソームから無料でRNAを分離するために超遠心分離することにより、線形ショ糖勾配上にロードされ、処理されます図1上パネル）。 254 nmでサンプルの吸光度とフラクションコレクションは、転写物あたりのリボソームの数が異なるリボソームやポリソームに富むショ糖画分の分離を可能にします。画分を集め、AFM画像化のために等分し、-80℃で保存することができる（ 図1下のパネル）。
空気中でAFMによって観察マウス脳由来の天然ポリソームは、タイトなリボソーム相互作用を明らかにする
画像取得は、（また、タッピングモードとしても知られる）、ACモードを使用して行われます。この様式は、チップ - サンプル相互作用及び対応する剪断力が大幅に低減されているため（例えば、ポリソームなど）のソフトサンプルを撮像するために特に適しています。このように、チップと試料の両方が保持されます。 AFMイメージングは、このような測定条件、チップの種類、試料の性質等の様々な要因に依存する正確な値を使用して、高解像度のデータの取得を可能にします。この論文に記載された条件で、約4-6ナノメートルの横方向の解像度と0.1から0.2ナノメートルの垂直解像度が達成可能です。雲母上のショ糖のアリコートを堆積させた後、AFMは、単一のポリソームの記述を提供します密集したリボソーム（ 図2A、CおよびC）のクラスタとして表示されます。クロスセクション分析（ 図2D）ことにより、リボソームのピークの高さは、以前に空気乾燥27後ポリソーム中のヒトリボソームのために観察されたものと合わせて14ナノメートル程度です。ラインプロファイルによって識別されるリボソームの中心までの距離に中心を溶液37、38におけるリボソームの寸法と一致している23 nmです。
単一の画分からポリソームあたりのリボソームの数は、単分散分布を示しています
図3Aは、ショ糖勾配の画分から雲母に吸収されたサンプルを取得することによって得られる典型的なAFM像を報告します。挿入図はribosの同定に適した倍率で、単一のポリソームのデジタルズームを示していますポリソームでomes。パネルBは 、RiboPickマクロとリボソーム識別した後に同じ画像を示しています。レッド円は、（挿入図を参照）リボソームをマークし、プログレッシブ数（シアン）は、リボソームの会合は、特定のポリソームとの調整を支援するために使用されます。ポリソームあたりのリボソームの数の頻度分布は明らかに単一のピークを示し、（ パネルC、灰色のバー）（中程度の分子量のポリソーム（MMW）に対応し、 図1.、下のパネルを参照してください）画分＃10について分析しました。実験的分布は1.3リボソーム/ポリソームの標準偏差は、5.8リボソーム/ポリソームを中心としたガウス曲線（黒線）を取り付けました。
全マウス脳のショ糖勾配沈降図1.代表的吸光度プロファイル。（上層panel）Aポリソーム細胞質溶解物）[w / vの] P27マウス脳から得られ、線形スクロース勾配上にロード（15から50パーセントスクロースました。 RiboNucleoParticlesの254 nmの（RNP）での吸光度に対応する明瞭なピーク、リボソームサブユニット（40Sおよび60S）、リボソーム（80S）とポリソームを観察することが可能です。繰り返しの凍結を回避し、雲母上のAFMの堆積前のサンプルのサイクルを解凍するためには、一定分量に分割するのが便利であるリボソーム画分と異なる転写産物あたりのリボソームの数（ すなわち、低、中、高とポリソーム画分（下のパネル）の両方-molecular量ポリソーム（それぞれLMW、MMWおよびHMW、））。アリコート限り二年として-80℃で保存することができます。
MMW脳ポリのAFM像のタッピングモード原子間力顕微鏡。（A）の例により図脳ポリソームの2画像をサムス雲母に吸収された後のリニアグレースケールを使用して。背景の0から0.5 nmのグレー、0.5〜2ナノメートル、およびリボソームのための2-10 nmの黄色：（B）（A）に示されているのと同じ画像がカラースケールのための異なるZ-範囲を使用して描かれています。この場合、より良好な視覚的コントラストが低く、高Z域オブジェクトの両方について得られます。 （C）断面プロファイル（点在白線）との典型的なMMWのポリソームの倍率。 （D）（C）の断面プロファイルで定義された2つのリボソームの高さプロファイルは、14ナノメートルのリボソームの高さを示しています。この値は、以前にポリソーム27中のヒトリボソームのためにAFMで観察されたものと互換性があります。
MMW脳ポリソームでポリソームあたりのリボソームの数を数えるの図3の例。repre（A）AFM像ImageJのマクロ、RiboPickの入力をsents。 （B）手動ポリソームごとに各リボソームをピッキングした後、RiboPickは、画像内の各リボソーム（赤丸）の位置をマークします。 （C）ポリソーム当たりリボソームの取得数は、ガウス曲線を装着することができる分布としてプロットすることができます。この例において考慮ポリソームの数が9の独立した画像から得られた、164です。ガウス曲線とのフィッティングは、MMW画分（＃リボソーム/ポリソーム5.8±1.3、R 2 = 0.99）でポリソームの集団の平均値を返します。
| バッファ | 組成 | 応用 |
| 溶解バッファー | 10mMのトリス-HCl、pH7.5で | 溶解液の調製（1.1） |
| 10mMのNaClを | ||
| 10のMgCl 2 | ||
| 1％のTriton-X100 | ||
| 1％デオキシコール酸Na | ||
| 0.4 U / mlのRNase阻害剤 | ||
| 1mMのDTT | ||
| 0.2 mg / mlでシクロヘキシミド | ||
| 5 U / mlのDNアーゼI | ||
| 50％スクロース溶液 | 50％（w / v）のスクロースで | スクロース勾配製剤（1.2） |
| 100mMのNaCl | ||
| 10のMgCl 2 | ||
| 10 mMトリス/ HClをpHが7.5 | ||
| 15％ショ糖溶液 | 15％（w / v）のスクロースで | スクロース勾配製剤（1.2） |
| 100mMのNaCl | ||
| 10のMgCl 2 | ||
| 10 mMトリス/ HClをpHが7.5 | ||
| ニッケル溶液 | 1 mMののNiSO 4 | AFMのためのサンプル調製（2） |
| バッファ-AFM | 100mMのNaCl | AFMのためのサンプル調製（2） |
| 10のMgCl 2 | ||
| 100μg/ mlのシクロヘキシミド | ||
| 10mMのヘペス | ||
| 3％（w / v）のスクロースをpH = 7.4 | ||
| 洗浄液 | DEPC - 水 | AFMのためのサンプル調製（2） |
| 100μg/ mlのシクロヘキシミド | ||
表1バッファ。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DNAの構造は転写およびクロマチンの組織化は、遺伝子発現の転写制御の我々の理解を進めたようなプロセスを記述するために最も重要であることが証明されたように、真実の理解を向上させるためにポリソームの組織構造を分析することが不可欠です翻訳とその調節の。
記載されたプロトコルを用いて、穏やかに平坦な表面上に固定化されたポリソームの最適密度は、AFM画像化に適したが得られます。好都合に調製したサンプルでこれらの条件を使用して、毎時約50ポリソームは、さらなる分析および特徴付けのための準備ができて取得することができます。また、室温で保存された乾燥した試料を、一年以上後のイメージングに適していることが証明されています。
成功した私たちのプロトコルでポリソーム画像を得るために、いくつかの重要なステップがあります：適切dissectio直後に瞬間凍結された組織を使用しますnおよびRNA分解を最小限に抑えるために-80℃で保存しました。 mRNAからリボソーム解離を避けるために、シクロヘキシミドおよびRNase阻害剤を含む溶解緩衝液を使用します。雲母上のサンプル堆積中に氷の上のすべてのインキュベーションを実行します。そして、広範囲にシクロヘキシミドの存在下でのバッファおよびRNaseを含まない水で雲母上のサンプルを洗浄するために、空気のAFMイメージングのためのサンプルを準備するとき。最後の点は特に重要です。画像は約右の高さを滑らかな表面を含んでいるように見えますが、100〜1000 nmの広い場合は、これが不十分洗浄した試料（多くの場合、リボソーム/ポリソームはまだかすかな、埋め込みオブジェクトとして観察することができる）を明確に示しています。この問題を解決する方法は、洗浄手順を繰り返すことであるが、これは、通常、すでに乾燥した試料上の問題を軽減しません。この場合、新たなアリコートで再び開始する価値があります。
AFMの解像度を考えると、ポリソームを研究するため、この方法は、STRUCを解決することはできませんポリソーム中のリボソームのインターフェイスのtural詳細。実際には、AFMは、効果的かつ堅牢な技術を表す、-EMを凍結するポリソームの数千を取得し、分析するために、より良いポリソームの全体的なリボソーム組織を理解し、相補し、単純なアプローチです。重要なことに、このプロトコルは、RNA 27と互換性のあるフィラメントを識別する固有の利点を有します。この全く同じ手順では、任意の生体組織または細胞株から得られた任意のポリソームサンプルのために使用することができます。より重要なことは、正常な最近ラウリアおよび共同研究者35によって示されるように、 インビトロ翻訳系を用いて転写固有の情報を取得するために使用することができます。この方法論は、ポリソーム形成または異なる細胞または組織の条件下でポリソーム組織の変化の動態の理解を得るために、いくつかの実験のために道を開きます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cycloheximide | Sigma | 01810 | Prepararation of lysate |
| DNAseI | Thermo Scientific | 89836 | Prepararation of lysate |
| RiboLock RNAse Inhibitor | Life technologies | EO-0381 | Prepararation of lysate |
| DEPC | Sigma | 40718 | Prepararation of lysate |
| Triton X100 | Sigma | T8532 | Prepararation of lysate |
| DTT | Sigma | 43815 | Prepararation of lysate |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | Prepararation of lysate |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | Prepararation of lysate |
| Sucrose | Sigma | S5016 | Sucrose gradient preparation |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima LE-80K | Sucrose gradient centrifugation |
| Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | SW 41 Ti | Sucrose gradient centrifugation |
| Polyallomer tube | Beckman Coulter | 331372 | Sucrose gradient centrifugation |
| Density Gradient Fractionation System | Teledyne Isco | 67-9000-176 | Sucrose gradient fractionation |
| AFM | Asylum Research | Cypher | Polysome visualization |
References
- Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells. Biochem J. 312, 163-167 (1995).
- Russell, J. B., Cook, G. M. Energetics of bacterial growth: balance of anabolic and catabolic reactions. Microbiol Rev. 59 (1), 48-62 (1995).
- Vogel, C., et al. Sequence signatures and mRNA concentration can explain two-thirds of protein abundance variation in a human cell line. Mol Syst Biol. 6, 400 (2010).
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
- Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13, 220 (2012).
- Kondrashov, N., et al. Ribosome-mediated specificity in Hox mRNA translation and vertebrate tissue patterning. Cell. 145 (3), 383-397 (2011).
- Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2, 277-298 (2011).
- Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
- Pircher, A., et al. An mRNA-derived noncoding RNA targets and regulates the ribosome. Mol Cell. 54 (1), 147-155 (2014).
- Simms, C. L., et al. An active role for the ribosome in determining the fate of oxidized mRNA. Cell Rep. 9 (4), 1256-1264 (2014).
- Kraushar, M. L., et al. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (36), E3815-E3824 (2014).
- van Heesch, S., et al. Extensive localization of long noncoding RNAs to the cytosol and mono- and polyribosomal complexes. Genome Biol. 15 (1), R6 (2014).
- Preissler, S., et al. Not4-dependent translational repression is important for cellular protein homeostasis in yeast. EMBO J. 34 (14), 1905-1924 (2015).
- Palade, G. E. A small particulate component of the cytoplasm. J Biophys Biochem Cytol. 1 (1), 59-68 (1955).
- McQuillen, K., Roberts, R. B., Britten, R. J. Synthesis of nascent protein by ribosomes in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 45 (9), 1437-1447 (1959).
- Wettstein, F. O., Staehelin, T., Noll, H. Ribosomal aggregate engaged in protein synthesis: characterization of the ergosome. Nature. 2 (197), 430-435 (1963).
- Dimitriadis, E. K., et al. Tetrameric organization of vertebrate centromeric nucleosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20317-20322 (2010).
- Allen, M. J., et al. Atomic force microscope measurements of nucleosome cores assembled along defined DNA sequences. Biochemistry. 32 (33), 8390-8396 (1993).
- Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P., Steitz, T. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution. Science. 289 (5481), 905-920 (2000).
- Schluenzen, F., et al. Structure of functionally activated small ribosomal subunit at 3.3 Å resolution. Cell. 102 (5), 615-623 (2000).
- Ben-Shem, A., et al. The structure of the eukaryotic ribosome at 3.0 Å resolution. Science. 334 (6062), 1524-1529 (2011).
- Anger, A. M., et al. Structures of the human and Drosophila 80S ribosome. Nature. 497 (7447), 80-85 (2013).
- Brandt, F., et al. The native 3D organization of bacterial polysomes. Cell. 136, 261-271 (2009).
- Myasnikov, A. G., et al. The molecular structure of the left-handed supra-molecular helix of eukaryotic polyribosomes. Nat. Commun. 5, 5294 (2014).
- Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. Formation of circular polyribosomes on eukaryotic mRNA without cap-structure and poly(A)-tail: a cryo electron tomography study. Nucleic Acids Res. 42 (14), 9461-9469 (2014).
- Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. Conformation transitions of eukaryotic polyribosomes during multi-round translation. Nucleic Acids Res. 43 (1), 618-628 (2015).
- Viero, G., et al. Three distinct ribosome assemblies modulated by translation are the building blocks of polysomes. J Cell Biol. 208 (5), 581-596 (2015).
- Brandt, F., Carlson, L. -A., Hartl, F. U., Baumeister, W., Grünewald, K. The three-dimensional organization of polyribosomes in intact human cells. Mol. Cell. 39, 560-569 (2010).
- Wu, X., Liu, W. Y., Xu, L., Li, M. Topography of ribosomes and initiation complexes from rat liver as revealed by atomic force microscopy. Biol Chem. 378 (5), 363-372 (1997).
- Yoshida, T., Wakiyama, M., Yazaki, K., Miura, K. Transmission electron and atomic force microscopic observation of polysomes on carbon-coated grids prepared by surface spreading. J. Electron Microsc (Tokyo). 46 (6), 503-506 (1997).
- Mikamo, E. C., et al. Native polysomes of Saccharomyces cerevisiae in liquid solution observed by atomic force microscopy. J. Struct. Biol. 151, 106-110 (2005).
- Mikamo-Satoh, E. A., et al. Profiling of gene-dependent translational progress in cellfree protein synthesis by real-space imaging. Anal. Biochem. 394, 275-280 (2009).
- Bernabò, P., et al. Studying translational control in non-model stressed organisms by polysomal profiling. J. Insect Physiol. 76, 30-35 (2015).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. IH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Lauria, F., et al. RiboAbacus: a model trained on polyribosome images predicts ribosome density and translational efficiency from mammalian transcriptomes. Nucleic Acids Res. , (2015).
- Al Omran, A. J., et al. Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain. J Vis Exp. (100), e52853 (2015).
- Warner, J. R., Rich, A., Hall, C. E. Electron microscope studies of ribosomal clusters synthesizing hemoglobin. Science. 138, 1399-1403 (1962).
- Yazaki, K., Yoshida, T., Wakiyama, M., Miura, K. Polysomes of eukaryotic cells observed by electron microscopy. J. Electron Microsc (Tokyo). 49, 663-668 (2000).
