Acoustofluidic enheter bruker ultrasoniske bølger innenfor microfluidic kanaler for å manipulere, konsentrere seg og isolere suspendert micro og nanoscopic enheter. Denne protokollen beskriver fremstillingen og bruken av en slik enhet som støtter bulk akustiske stående bølger for å fokusere partiklene i en sentral strømlinje uten hjelp av kappe fluider.
Acoustophoresis refererer til forskyvning av opphengte gjenstander som reaksjon på retningskrefter fra lydenergi. Gitt at de opphengte gjenstandene må være mindre enn den innfallende bølgelengden til lyden og bredden av fluidtekniske kanaler er typisk titalls til flere hundre mikrometer i diameter; acoustofluidic anordninger vanligvis bruker ultrasoniske bølger som genereres fra en piezoelektrisk transduser pulserende ved høye frekvenser (i megahertz-området ). Ved karakteristiske frekvenser som er avhengige av geometrien av anordningen, er det mulig å indusere dannelsen av stående bølger som kan fokusere partikler langs ønskede fluidstrømlinjene innenfor en massestrømning. Her beskriver vi en fremgangsmåte for fabrikasjon av acoustophoretic enheter fra vanlige materialer og rene rom utstyr. Vi viser representative resultater for fokuseringen av partikler med positive eller negative kontrast akustiske faktorer, som beveger seg mot trykk noder eller antinodes av de stående bølger, respectivEly. Disse enhetene har enorm praktisk verktøy for nøyaktig posisjonering stort antall mikroskopiske enheter (f.eks celler) i stasjonær eller strømmende væsker for applikasjoner som spenner fra cytometri montering.
Acoustofluidic enheter brukes til å utøve retnings krefter på mikroskopiske enheter (f.eks, partikler eller celler) for sin konsentrasjon, justering, montering, fødsel eller separasjon i hvilende væsker eller laminat flowstreams. 1 Innenfor dette brede klasse av enheter, kan kreftene genereres fra bulk akustiske stående bølger, overflate akustiske stående bølger (SSAWs) 2 eller akustisk vandrebølgene. 3 Mens vi fokuserer på fabrikasjon og drift av enheter som støtter bulk akustiske stående bølger, enheter som støtter SSAWs har fått mye oppmerksomhet den siste tiden på grunn av deres evne til nettopp å manipulere celler langs flatene 4 og hurtig sortere celler i kontinuerlige strømningskanaler. 5 enheter bærebulk akustiske, stående bølger, imidlertid, omarrangere partikler basert på de mekaniske vibrasjonene fra veggene i anordningen som genereres av en piezoelektrisk transduser, som eksiterer de stående bølger i mikrofluidhulrom på geometrisk definerte resonans frekvenser. Dette gir potensiale for å generere høyere trykk amplituder i forhold til SSAW enheter, og dermed hurtigere acoustophoretic transport av mikroskopiske enheter. 6
Disse stående bølger består av en rommessig periodisk sett av trykk noder og antinodes, som er fast i stilling når trykket oscillerer i tid. Partikler svare på de stående bølger ved å migrere til trykk noder eller antinodes, avhengig av de mekaniske egenskapene til partiklene i forhold til fluidet, og som er beskrevet av den akustiske steilhetsfaktor:
hvor variablene ρ og β representerer densitet og kompressibilitet og indeksene p og ƒ representerer suspendert gjenstand (f.eks, partikkel eller celle) og fluidet, respektivt.7 Enheter som innehar en positiv akustisk steilhetsfaktor (dvs. ɸ> 0) migrere til det trykk noden (s); mens, enheter som besitter en negativ akustisk kontrast faktor (dvs. ɸ <0) migrere til trykk antinodes. 7 Mens flertallet av syntetiske materialer (f.eks isopor perler) og celler utvise positiv akustisk kontrast, elastiske partikler laget av silikonbasert materialer, 8 fettmolekyler 9 eller andre sterkt elastiske bestanddeler oppviser negativ akustisk kontrast i vann. Elastomere partikler i acoustofluidic anordninger kan anvendes for å isolere små molekyler 10 og som middel til å begrense syntetiske partikler 11 eller celler 12 for det formål å diskriminere sortering. 13
Acoustofluidic enheter er vanligvis laget av standard materialer (f.eks silisium og glass) som har tilstrekkelig stivhet til support en akustisk stående bølge. I mange acoustofluidic enheter (inkludert innretningen vist heri), er de mekaniske bølger konstruert for å resonere ved den laveste harmoniske modus, som består av en halv-bølgelengde stående bølge som strekker seg over bredden av microchannel. Denne konfigurasjonen har en trykk node i midten av kanalen og trykk antinodes langs omkretsen av kanalen. Det har vist seg tidligere at disse systemene kan brukes til chip-baserte applikasjoner Cytometry 14-16 og applikasjoner som strekker seg fra overlapping av cellene til konsentrasjonen av celler. 17,18
Vi beskriver prosessen med fabrikasjon, metoder for bruk og representative yteevnen til en acoustofluidic enhet som støtter bulk akustiske stående bølger. Denne enheten krever en fotolitografi skritt, en etsning trinn og en fikseringstrinn til permanent binde et glass "lokk" til den etset silisium substrat. Vi merker oss at andre acoustofluidic enheter som støtter bulk akustiske, stående bølger kan være fremstilt av glass eller kvarts kapillærer bundet til piezoelektriske transdusere, som er beskrevet tidligere. 19,20 Silisium-baserte enheter tilbyr fordelene med robusthet og kontroll over strømningskanalen geometri, som til sammen tillater mange typer behandling for prøver inneholdende suspensjoner av partikler og celler. Enhetene er gjenbrukforutsatt at de er skikkelig rengjort mellom hver bruk (dvs. ved å spyle enheten med buffere og vaskemidler).
Acoustophoresis tilbyr en enkel og rask metode for å arrangere nøyaktig mikroskopiske enheter innenfor fluidmikrokanaler uten behov for å kappe fluider som brukes i hydrodynamiske fokuserings tilnærminger. 24 Disse anordninger gir flere fordeler i forhold til andre metoder for partikkel eller celle manipulasjon (f.eks magnetophoresis, 25,26 dielectrophoresis 27 eller treghets tvinge 28) på grunn av deres evne til å behandle enheter uten høy magnetisk følsomhet, elektriske polarizabilities eller en snever størrelses dispersitet. Videre kan fokuserings noder av en akustisk standbølge være plassert langt fra kilden for eksitasjon, noe som ikke er mulig ved statiske magnetiske eller elektriske felt som per Earnshaw teorem. 29 En ytterligere fordel er at akustiske anordninger kan fokusere partiklene på tvers et bredt spekter av anvendt strømningshastigheter og uavhengig av strømningsretningen, noe som ikke er mulig i anordninger that stole på treghetskrefter for å fokusere, 28 som gir mulighet til å effektivt transportere partikler eller celler for økt partikkel inspeksjon for applikasjoner som flowcytometri og partikkel dimensjonering. 30,31 Den enkle enheten fabrikasjon og drift kan direkte gi rom for gjennomføring av tilsvarende enheter for å fokusere, konsentrere seg, fraksjonering og sortering gjenstander suspendert i væske. 32
Vi har vist at den primære strålings krefter, som er de sterkeste krefter som produseres av akustiske, stående bølger, kan en fokusere mikropartikler som strømmer gjennom et mikrofluidkanal ved strømningshastigheter på over 10 ml / t i en enkelt åpning utforming. For en fast strømningshastighet på 100 mL / min, viser vi at vår enhet kan fokusere partiklene inn i en smal strømlinje (det vil si 50 um i diameter) uten noen kappe fluider ved spenninger så lave som 20 V spiss-til-spiss, slik at et lavt -Power metode for satsvis fokusering på 10 millioner partisykluser / min ved behandling av tett konsentrerte oppløsninger (f.eks, 6 x 10 8 partikler / ml), som et eksempel. Videre kan denne gjennomstrømming økes dramatisk ved å fabrikkere flermunnings acoustofluidic chips eller kanaler som aktiveres med høyere harmoniske for å produsere sett av parallelle noder. 33
Mens anordningen som er vist her bare krever materialer og metoder som benyttes i konvensjonelle microfabrication, legges det vekt på at det finnes en håndfull av andre teknikker som kan brukes for å konstruere lignende enheter. 19,34,35 Fordelene med denne tilnærmingen er dens enkelhet samt holdbarheten av den siste enheten.
De kritiske trinn til fremstillingen av disse enhetene inkluderer fotolitografi for å definere geometrien av microchannel, reaktiv ioneetsing å danne kanalen i silisium og anodisk bonding for å smelte silisium til en transparent "lokk" for observasjon av fluorescence mikroskopi. Alle disse trinnene krever clean room fasiliteter for å unngå oppsamling av støv eller rusk i enheten. Når disse trinnene er fullført, men å lime en PZT svinger og fluid porter er relativt enkel og kan utføres utenfor et rent rom.
Imidlertid er riktig behandling av innretningen essensielle for dens levetid. Dette innbefatter (1) inkubering av enheten med passiverende reagenser (for eksempel, poly (etylenglykol) silan) før hvert eksperiment for å beskytte kanalen fra residuet oppbygning og (2) spyling av anordningen med vaskemidler etter hvert eksperiment. Opphoping av avfall kan kompromittere kvaliteten til den akustiske stående bølge og kan redusere evnen til å effektivt fokusere partikler eller celler i enheten. Vi merker oss også at disse enhetene er ikke godt egnet for svært polydisperse prøver eller prøver som inneholder enheter nærmer halvparten av størrelsen på den stående bølgen.
Acoustofluidic enheter gir enorme verktøy for en rekke anvendelser som strekker seg fra kolloidal sammenstilling til celleseparasjon og flowcytometri. Evnen til å behandle biologiske prøver med presisjon ved høye strømningshastigheter kan tillate muligheten for økt gjennomstrømning av disse microfluidic enheter, samtidig som kostnadene reduseres fra overflødige reagenser, store prøvevolum eller noe utstyr for utlevering kappe væsker. De fabrikasjon metoder som kreves for å gjøre acoustofluidic enheter er grei og de krav som stilles for sin drift er brukervennlige. Vi håper disse prosedyrene vil oppmuntre den utbredte utvikling av lignende enheter for å katalysere nye forskningsområder for applikasjoner på tvers av materialvitenskap, bioteknologi og medisin.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the National Science Foundation (through grants DMR-1121107, CMMI-1363483 and Graduate Research Fellowships (GRF-1106401) to C.W.S., D.F.C. and K.A.O.) and the National Institutes of Health (R21GM111584). The authors have no conflicts of interest.
Silicon wafers | Addison Engineering, Inc. | 3P1 | 6” mechanical grade silicon wafer <111> |
AZ® 9260 photoresist | MicroChemicals GmbH | AZ9260-Q | Positive photoresist |
AZ® 400K developer | MicroChemicals GmbH | AZ400K CONC-CS | Dilute 1 part AZ 400k in 4 parts deionized H2O |
H2O2 | Sigma Aldrich, Co. | 216763 | 30 wt.% in H2O |
H2SO4 | Sigma Aldrich, Co. | 320501 | ACS reagent, 95.0-98.0% |
1165 Photoresist Remover | Dow Chemical, Co. | DEM-10018073 | 1-methyl-2-pyrrolidinone based |
Acetone | Sigma Aldrich, Co. | 320110 | ACS reagent, ≥99.5% |
Isopropyl alcohol | Sigma Aldrich, Co. | W292907 | ≥99.7%, FCC, FG |
Methanol | Sigma Aldrich, Co. | 322415 | Anhydrous, 99.8% |
Borosilicate glass (Nexterion glass B) | Schott AG | 2098576 | Size: 120×60 ±0.1 mm, Thickness: 1 ±0.005 mm |
|
|||
Thickness: 1 | |||
|
|||
Drill bit for glass and ceramic | McMaster-Carr, Inc. | 2954A1 | Drill bit size: 1/8” Overall length: 2 3/16” Shank diameter: 7/64” |
Overall length: 2 3/16” | |||
Shank diameter: 7/64” | |||
Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Sigma Aldrich, Co. | 761036 | Dow Corning, Co.; Sylgard 184®; 10 g clip-pack |
Biopsy punch | Ted Pella, Inc. | 15078 | Harris uni-core Tip ID: 3.0 mm Tip OD: 3.40 mm |
Tip ID: 3.0 mm | |||
Tip OD: 3.40 mm | |||
Lead zirconate titanate (PZT) transducer | APC International, Ltd. | Custom order, (841 WFB) | Length: 30.0 mm, Width: 5.0mm, Freq.: 2.46 MHz, 2.0 mm end wrap for leads |
(841 WFB) | Width: 5.0mm | ||
Freq.: 2.46 MHz | |||
2.0 mm end wrap for leads | |||
Silicone tubing | Cole Parmer Instrument, Co. | 07625-22 | 0.6 mm I.D. |
Polystyrene beads | Thermo Fischer Scientific, Inc. | F-8836 | 10 µm yellow-green fluorescence |