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Immunology and Infection

पूरा का प्रतिदीप्ति समय चूक इमेजिंग Published: February 28, 2016 doi: 10.3791/53863
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Molecular Microbiology, John Innes Centre, Norwich Research Park, 2Department of Biology, Lund University

ERRATUM NOTICE

Introduction

Streptomycetes मिट्टी में रहने वाली बैक्टीरिया है कि निष्क्रिय, unigenomic बीजाणुओं 1-3 को एक बहुकोशिकीय, पोषक तत्वों से सफाई फुई से रूपात्मक भेदभाव से जुड़े एक जटिल विकासात्मक चक्र की विशेषता रहे हैं।

अनुकूल विकास शर्तों के तहत, एक ठेठ Streptomyces बीजाणु एक या दो रोगाणु ट्यूब (चित्रा 1) extruding द्वारा उगना शुरू होता है। इन ट्यूबों टिप विस्तार से बढ़ाना और वनस्पति फुई के रूप में जाना एक branched hyphal नेटवर्क में हो जाना। ध्रुवीय विकास और hyphal शाखाओं में आवश्यक प्रोटीन DivIVA द्वारा निर्देशित है। इस coiled-तार प्रोटीन एक बड़ी cytoplasmic परिसर का हिस्सा polarisome, जो विस्तार देने टिप 4-7 पर नए सेल लिफाफा सामग्री की प्रविष्टि के लिए महत्वपूर्ण है कहा जाता है। वनस्पति विकास के दौरान, hyphal तंतु तथाकथित पार दीवारों 8 का निराला गठन से बंटे हो जाते हैं। इन पार दीवारों के गठन को पुनः quires FtsZ, ट्यूबिलिन तरह cytoskeletal प्रोटीन है कि ज्यादातर बैक्टीरिया 9 में कोशिका विभाजन के लिए आवश्यक है। Streptomyces में, हालांकि, इन वनस्पति पार दीवारों कसना और सेल सेल जुदाई के लिए नेतृत्व नहीं है और इसलिए mycelial बड़े पैमाने पर आपस में जुड़े syncytial डिब्बों के एक नेटवर्क के रूप में बनी हुई है। पोषक तत्वों की सीमा और अन्य संकेत है कि अच्छी तरह से समझ नहीं रहे हैं के जवाब में, विशेष हवाई hyphae वनस्पति फुई से दूर तोड़ने और हवा 3 में हो जाना। इन संरचनाओं के निर्माण से विकास की प्रजनन चरण है, जो के दौरान लंबे बहु जीनोमिक हवाई hyphae बनने समान रूप से आकार unigenomic prespore डिब्बों के दर्जनों में विभाजित शुरू की। यह बड़े पैमाने पर कोशिका विभाजन घटना एकल sporogenic hyphae 2,10 के भीतर कई FtsZ छल्ले के तुल्यकालिक कसना से प्रेरित है। रूपात्मक भेदभाव निष्क्रिय, मोटी दीवारों, रंजित बीजाणुओं की रिहाई के साथ पूरा हुआ।

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चित्रा 1:। ठोस मीडिया पर Streptomyces जीवन चक्र यह एस के शास्त्रीय अध्ययन के आधार पर जीवन चक्र का एक मॉडल है अगर प्लेटों पर बढ़ रही coelicolor। एक बीजाणु के सेलुलर विकास एक या दो रोगाणु ट्यूब, जो टिप विस्तार से बढ़ने hyphae शाखाओं में बंटी के एक नेटवर्क के रूप में के गठन के साथ शुरू होता है। ध्रुवीय विकास और वनस्पति hyphae की शाखाओं में बंटी DivIVA (लाल) द्वारा निर्देशित है। वनस्पति पार दीवारों के गठन FtsZ (हरा) की आवश्यकता है। पोषक तत्वों की सीमाओं और अन्य संकेतों के जवाब में, हवाई hyphae खड़ा कर रहे हैं। हवाई विकास की गिरफ्तारी कसकर FtsZ-बजता है, जो sporulation सेप्टा कि बॉक्स की तरह prespore डिब्बों में sporogenic hyphae compartmentalize को जन्म देने की एक सीढ़ी की विधानसभा के साथ समन्वित है। इन डिब्बों के एक मोटी बीजाणु दीवार को इकट्ठा और अंत में जारी किया हैंके रूप में परिपक्व pigmented बीजाणुओं sed।

Streptomyces जीवन चक्र के प्रमुख विकासात्मक घटनाओं में अच्छी तरह से 1,3 विशेषता है। लेकिन, क्या अब भी है दुर्लभ सेल जैविक अध्ययन है कि प्रतिदीप्ति समय चूक माइक्रोस्कोपी रोजगार ऐसे प्रोटीन स्थानीयकरण गतिशीलता, गुणसूत्र आंदोलन और विकासात्मक नियंत्रित कोशिका विभाजन के रूप में भेदभाव को मजबूती subcellular प्रक्रियाओं, में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए कर रहे हैं। Streptomyces विकास का लाइव सेल इमेजिंग जीवन चक्र की जटिलता और जीव की शारीरिक विशेषताओं की वजह से चुनौतीपूर्ण हो गया है। वनस्पति विकास पर पिछले अध्ययनों और sporulation दो भागों में विभाजित के प्रारंभिक चरणों ऑक्सीजन पारगम्य इमेजिंग कक्षों, या एक खुर्दबीन मंच पर 11-15 Streptomyces coelicolor की agarose-समर्थित विकास कार्यरत है। इन विधियों, हालांकि, कारकों में से एक नंबर के द्वारा सीमित हैं। कुछ सिस्टम केवल एक सेलुलर विकास की अल्पकालिक इमेजिंग की अनुमतिकोशिकाओं से पहले डी फ्लोरोसेंट प्रोटीन अपर्याप्त ऑक्सीजन की आपूर्ति से ग्रस्त हैं या hyphal विकास के तीन आयामी पैटर्न के कारण फोकल हवाई जहाज़ से बाहर हो जाना। मामलों में जहां लंबी अवधि इमेजिंग संभव है, agarose पैड सीमा प्रयोगात्मक लचीलापन पर कोशिकाओं की खेती क्योंकि कोशिकाओं वैकल्पिक विकास या तनाव की स्थिति को उजागर नहीं किया जा सकता, और agarose पैड में मध्यम से गंभीर रूप से कमजोर पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति फ्लोरोसेंट निगरानी करने की क्षमता की सीमा में संकेत है।

यहाँ हम उत्कृष्ट परिशुद्धता और संवेदनशीलता के साथ पूरा Streptomyces जीवन चक्र के रहते सेल इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन। एक प्रतिदीप्ति widefield माइक्रोस्कोप (चित्रा 2) से जुड़े एक microfluidic युक्ति में Streptomyces बढ़ रही द्वारा, अब हम करने के लिए 30 घंटे की समय अवधि में अंकुरण, वनस्पति विकास और sporulation दो भागों में विभाजित की निगरानी करने में सक्षम हैं। यह बहुत नया मॉडल जीव Streptomyces के उपयोग से मदद की है venezuelae क्योंकि यह जलमग्न संस्कृति में पास पूरा करने के लिए और इस तरह sporulates शास्त्रीय मॉडल प्रजातियों एस की सीमा पर काबू coelicolor, जो ठोस मीडिया पर ही 16-20 sporulates। वनस्पति विकास और sporulation कल्पना में मदद करने के लिए, हम सह एक्सप्रेस fluorescently टैग सेल polarity मार्कर DivIVA और चाबी प्रोटीन कोशिका विभाजन FtsZ के संस्करणों।

हम एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध microfluidic युक्ति है कि सफलतापूर्वक माइक्रोबैक्टीरिया, कोलाई, Corynebacterium glutamicum, बेसिलस subtilis और खमीर 21-25 के लिए नियोजित किया गया है का उपयोग कर रहे हैं। प्रणाली एक फोकल हवाई जहाज़ में कोशिकाओं को जाल और विभिन्न जलाशयों से संस्कृति के माध्यम से निरंतर छिड़काव के नियंत्रण की अनुमति देता है। विस्तृत प्रोटोकॉल में हम इस सुविधा का लाभ लेने के एस बेनकाब करने के लिए एक पोषण downshift करने के लिए वनस्पति फुई venezuelae sporulation बढ़ावा देने के लिए।

प्रोटोकॉल deलखा पूरे Streptomyces जीवन चक्र के रहते सेल इमेजिंग के लिए है, लेकिन वैकल्पिक मीडिया की स्थिति या माइक्रोस्कोप सेटिंग्स अगर विशिष्ट विकास के चरणों विशेष रुचि के हैं चुना जा सकता है।

चित्र 2
चित्रा 2: योजनाबद्ध चित्रण प्रयोगात्मक कार्य-प्रवाह। तीन मुख्य प्रोटोकॉल में वर्णित चरणों दिखाए जाते हैं। सबसे पहले, बीजाणुओं और खर्च मध्यम एक स्थिर चरण संस्कृति से तैयार किया जाता है। दूसरा, ताजा बीजाणुओं एक microfluidic प्रणाली और एस में लोड कर रहे हैं venezuelae अपने विकास जीवन चक्र एक ऊष्मायन चैम्बर के साथ एक पूरी तरह से स्वचालित औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर एक इष्टतम विकास तापमान बनाए रखने के लिए भर में imaged है। तीसरा, समय चूक प्राप्त श्रृंखला का विश्लेषण किया और खुला स्रोत सॉफ्टवेयर का उपयोग कर फिजी कार्रवाई की है।

Protocol

1. ताजा एस के अलगाव venezuelae बीजाणु और खर्च मध्यम संस्कृति की तैयारी

  1. टीका लगाना 30 मिलीलीटर Maltose-खमीर निकालें-माल्ट निकालने (एमवाईएम) मध्यम, 60 μl R2 तत्व का पता लगाने समाधान (ते) के साथ पूरक तनाव SV60 [attB φ BT1 :: pSS209 (पी divIVA के 10 μl बीजाणुओं के साथ - divIVA-mCherry पी ftsZ -ftsZ-ypet)]। लगातार वृद्धि और कोशिकाओं के sporulation के लिए, एक चकित कुप्पी या एक कुप्पी कि पर्याप्त वेंटिलेशन के लिए अनुमति देने के लिए एक वसंत का उपयोग करें।
  2. 30 डिग्री सेल्सियस पर 35-40 घंटा और 250 rpm के लिए संस्कृति कोशिकाओं।
  3. तरल घुड़सवार चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा कोशिकाओं की जांच। इस बिंदु पर mycelial टुकड़े और बीजाणुओं दिखाई जाएगी।
  4. अपकेंद्रित्र 1 मिलीलीटर 1 मिनट के लिए 400 XG पर एक टेबल टॉप अपकेंद्रित्र में कोशिकाओं फुई और बड़ा सेल टुकड़े गोली।
  5. स्थानांतरण लगभग 300 μl सतह पर तैरनेवाला सहएक नया 1.5 मिलीलीटर ट्यूब बीजाणुओं के निलंबन ntaining और बर्फ पर रहते हैं। 1.7 कदम के लिए शेष संस्कृति के माध्यम से रखें।
  6. बीजाणुओं एमवाईएम-ते में 01:20 पतला (अंतिम एकाग्रता: 0.5-5 10 x 7 बीजाणुओं / एमएल) और जरूरत तक बर्फ पर रख (2.3 कदम देखें)।
    ध्यान दें: हालांकि सटीक स्थिति है कि Streptomyces में sporulation ट्रिगर, समझ नहीं रहे हैं बिताया एमवाईएम ते माध्यम का उपयोग कर, एक sporulating संस्कृति से किसी अज्ञात कोशिकी संकेतों सहित sporulation उत्तेजित करता है।
  7. शेष संस्कृति के माध्यम से प्राप्त करने के लिए खर्च किया एमवाईएम ते कि बीजाणुओं और mycelial टुकड़े के लिए स्वतंत्र है के 10 मिलीलीटर फ़िल्टर बाँझ। एक बाँझ 0.22 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर का प्रयोग करें और हस्तांतरण एक बाँझ 15 मिलीलीटर ट्यूब एमवाईएम ते बिताया।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर कुछ दिनों के लिए तैयार बिताया एमवाईएम ते रखें अगर इसी तरह विकास की स्थिति का उपयोग करते हुए अतिरिक्त प्रयोगों का आयोजन किया जाना है।

2. microfluidic डिवाइस की तैयारी

नोट: प्रत्येक microfluidic पीएलएते चार स्वतंत्र प्रयोगों के लिए सक्षम बनाता बाहर ले जाने के लिए। अप्रयुक्त प्रवाह कक्षों के संक्रमण से बचने के लिए, जब एक प्रयोग की स्थापना बाँझ समाधान और काम की परिस्थितियों का उपयोग करें।

  1. microfluidic थाली से शिपिंग समाधान निकालें और बाँझ एमवाईएम ते के साथ कुओं कुल्ला।
  2. 300 μl एमवाईएम ते से 6 कुओं से 2 अच्छी तरह से 1 और 300 μl बिताया एमवाईएम ते प्रवेश करने के लिए जोड़ें।
  3. लोड 40 μl लेन 'ए' की सेल लोड हो रहा है अच्छी तरह से 8 में 1.6 कदम से बीजाणुओं पतला और सील के अनुसार थाली करने के लिए कई गुना निर्देश बनाती है।
  4. , Microfluidics नियंत्रण सॉफ्टवेयर लॉन्च उचित प्लेट प्रकार का चयन करें और अप प्रधानमंत्री प्रवाह चैनल और संस्कृति कक्ष के लिए एक प्रवाह कार्यक्रम बहने मध्यम से इनलेट कुओं से 1 से 5 6 साई में अच्छी तरह से प्रति 2 मिनट के लिए निर्धारित किया है।
  5. इनलेट अच्छी तरह से 1 से MYM ते बहने 6 घंटे के लिए अंकुरण और कोशिकाओं की वनस्पति के विकास के लिए अनुमति देने के लिए: microfluidics नियंत्रण सॉफ्टवेयर में प्रयोग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रवाह बना सकते हैं। स्विचउसके बाद प्रयोग के शेष समय के लिए अच्छी तरह से 5 के लिए 2 से खर्च किया एमवाईएम ते का छिड़काव करने के लिए। प्रयोग के दौरान 6 साई (लगभग 9 μl मध्यम / घंटा के लिए इसी) पर दबाव प्रवाह निरंतर रखने के लिए। 3.5 कदम के बाद प्रवाह प्रोग्राम प्रारंभ करें।

3. माइक्रोस्कोप और समय चूक प्रोटोकॉल का सेट

नोट: इस विधि से एक sCMOS कैमरा, एक धातु halide दीपक, एक हार्डवेयर ऑटो फोकस, 96 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए एक मंच धारक और एक पर्यावरण कक्ष के साथ सुसज्जित एक पूरी तरह से मोटर चालित और स्वचालित औंधा widefield माइक्रोस्कोप पर लागू किया गया था।

  1. आदेश में प्रयोग शुरू करने के बाद ऑटो फोकस के साथ समस्याओं को रोकने के लिए अग्रिम में 30 डिग्री सेल्सियस के लिए पर्यावरण कक्ष पूर्व गर्म। समय की आवश्यकता पर्यावरण इस्तेमाल किया चैम्बर, माइक्रोस्कोप और हीटिंग सिस्टम पर निर्भर करता है। अप प्रयोग से पहले सिस्टम रात गर्म करने के लिए शुरू करो।
  2. माइक्रोस्कोप और माइक्रोस्कोपी स्वचालन और नियंत्रण Softwa चालू करेंफिर से। इस तरह के एक 100X, 1.46 एनए तेल डीआईसी उद्देश्य के रूप में इष्टतम संकेत संग्रह और स्थानिक संकल्प, के लिए एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर (एनए) तेल विसर्जन उद्देश्य का प्रयोग करें। अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) छवियों और पीले फ्लोरोसेंट और लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन fusions की छवियों को प्राप्त करने के लिए उपयुक्त फिल्टर और दुरंगा दर्पण का चयन करें।
  3. विसर्जन के तेल की एक बूंद के उद्देश्य पर रखें और microfluidic प्लेट पर इमेजिंग खिड़की के नीचे से विसर्जन तरल पदार्थ जोड़ने छवि अधिग्रहण के दौरान सेल ध्यान में सुधार करने के लिए। ध्यान से उलटा माइक्रोस्कोप के मंच पर सील microfluidic युक्ति (2.5 कदम) माउंट। सुनिश्चित करें कि प्लेट सुरक्षित रूप से मंच धारक में रखा गया है और प्रयोग के दौरान अधिक बदलाव नहीं करता है।
  4. उन्मुखीकरण के लिए एम्बेडेड स्थिति मार्कर का उपयोग ध्यान में microfluidic संस्कृति कक्ष की खिड़की इमेजिंग लाओ। पहले प्रवाह कक्ष के बाएँ हिस्से पर फोकस (लेबल 'ए') जाल आकार 5 के साथ, करने के लिए इसी0.7 माइक्रोन का एक जाल ऊंचाई।
  5. microfluidics सॉफ्टवेयर में, इनलेट अच्छी तरह 8 से लोड कोशिकाओं 15 सेकंड के लिए 4 साई पर। इमेजिंग खिड़की के पार मंच ले जाकर संस्कृति कक्ष में सेल घनत्व की जाँच करें। यदि कोई बीजाणुओं फंस गए थे, सेल लोडिंग कदम दोहराने या वैकल्पिक रूप से लोड हो रहा है दबाव और / या समय में वृद्धि जब तक वांछित सेल घनत्व (2,048 x 2,048 पिक्सल के साथ इमेजिंग खिड़की प्रति 1-10 बीजाणुओं) हासिल की है। संस्कृति कक्ष लदान से बचें।
    नोट: हम आम तौर पर इमेजिंग Streptomyces के लिए जाल आकार 5 का उपयोग करें, लेकिन हम भी आकार 4 और 3 सेल लोड करने की प्रक्रिया के अनुकूलन पर अतिरिक्त सुझाव के लिए आपूर्तिकर्ता मैनुअल को देखें जाल के साथ अच्छे परिणाम प्राप्त किया है।
  6. 2.5 कदम से नियंत्रण सॉफ्टवेयर में प्रवाह कार्यक्रम शुरू करने और microfluidic प्लेट छवि अधिग्रहण शुरू करने से पहले माइक्रोस्कोप चरण में 1 घंटे के लिए गर्मी का संतुलित करने के लिए अनुमति देते हैं।
  7. माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर में, एक बहु-आयामी म्यू लेने के लिए अधिग्रहण की स्थापनासमय के साथ कई चरण पदों पर एकाधिक छवियों:
    1. स्वत: सहेजना के लिए: छवि फ़ाइलों का स्वत: बचत के लिए निर्देशिका निर्दिष्ट करें।
    2. रोशनी सेटिंग्स के लिए, अग्रिम में प्रत्येक विशिष्ट निर्माण के लिए इष्टतम सेटिंग्स रोशनी का निर्धारण। डीआईसी 150 मिसे, YFP 250 मिसे, आरएफपी 100 मिसे: उल्लिखित प्रयोग के लिए, निम्न जोखिम बार का उपयोग करें।
    3. समय श्रृंखला के लिए: अनुक्रम में वांछित समय बिंदुओं पर छवियों को प्राप्त करने के लिए एक समय श्रृंखला की स्थापना की। एस के जीवन चक्र इमेजिंग के लिए venezuelae, एक 24 घंटा अवधि में एक 40 मिनट का समय अंतराल का चयन करें।
    4. स्टेज की दशा और ऑटो फोकस के लिए: ब्याज की प्रत्येक इमेजिंग स्थिति के लिए मंच और दुकान मंच पदों पर ले जाकर संस्कृति कक्ष स्कैन। सुनिश्चित करें कि एकल चरण पदों के अलावा कम से कम करने के लिए पर्याप्त रूप photobleaching और phototoxicity.Typically 12 पदों के लिए उपयोग स्थित हैं। हर समय बिंदु के लिए भागो ऑटोफोकस दिनचर्या धीमी फोकल बहाव के लिए सही करने के लिए। अगर माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर में उपलब्ध"हार्डवेयर ऑटोफोकस द्वारा स्थानीय सतह अद्यतन" करने के लिए, ऑटो फोकस रणनीति निर्धारित किया है। एक बार चयनित मंच पदों की जेड निर्देशांक सत्यापित कर रहे हैं, हार्डवेयर ऑटोफोकस को सक्रिय करें।
  8. माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर में समय चूक प्रयोग शुरू करें।
  9. जाँच करें कि सभी स्तर के पदों पर बाद में बिंदुओं पर ध्यान केंद्रित करने में अभी भी कर रहे हैं। कई घंटे से अधिक समय चल रहा है चूक प्रयोगों के लिए, हम कभी कभी भी एक मंच बहाव का निरीक्षण जब ऑटोफोकस इस्तेमाल करते हैं। मंच पदों पर फिर से ध्यान केंद्रित करने की आवश्यकता है, तो एक उचित समय बिंदु पर प्रयोग बंद करो, ध्यान समायोजित और परिभाषित इमेजिंग समय अंतराल (कदम 3.7.3) के भीतर प्रयोग पुनः आरंभ। कैसे समय श्रृंखला जुटना करने के लिए कदम 4.3 देखें।
  10. 24-30 घंटे के बाद छवि अधिग्रहण बंद करो या जब ब्याज के क्षेत्र में hyphae बीजाणुओं में भेदभाव किया है (डीआईसी छवि श्रृंखला देखें)। सॉफ्टवेयर में प्रवाह कार्यक्रम को रोकने और microfluidic युक्ति अलग करना।
  11. अल्पकालिक एसटू के लिए खेतों में microfluidic थाली तैयारक्रोध। शेष एमवाईएम ते निकालें और 6 के लिए अच्छी तरह से 1 से MYM ते बिताया, खाली बेकार अच्छी तरह से 7 और सेल लोड हो रहा है अच्छी तरह से 8. बाँझ शर्तों के तहत, फिर से भरने के लेन 'ए' के ​​कुओं और अप्रयुक्त गलियों के कुओं ( "बी" का इस्तेमाल करने के लिए बाँझ बफर फॉस्फेट खारा के साथ प्लेट पर 'डी') (पीबीएस)। यह 4 डिग्री सेल्सियस पर बाहर और दुकान सुखाने से रोकने के लिए parafilm के साथ थाली सील।

4. के समय चूक फिल्मों पीढ़ी फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग

नोट: हम ध्यान दें कि विभिन्न वाणिज्यिक और मुफ्त सॉफ्टवेयर संकुल ZenBlue, Metamorph, बर्फीले, ImagePro या ImageJ सहित समय चूक माइक्रोस्कोपी छवियों को संसाधित करने के लिए उपलब्ध हैं। यहाँ हम फिजी, जो एक खुला स्रोत छवि प्रसंस्करण ImageJ पर आधारित कार्यक्रम है, और जो पहले से ही उपयोगी पूर्व स्थापित plugins के एक नंबर प्रदान करता है पर ध्यान केंद्रित।

  1. एक कंप्यूटर है कि फिजी स्थापित किया है करने के लिए अपने समय चूक प्रयोग से स्थानांतरण इमेजिंग डेटा।
  2. कार्यक्रम शुरू करने और उपयोग करते हुए और इमेजिंग फ़ाइल आयात# 34; फ़ाइल> आयात> जैव प्रारूप "। या बस फिजी में इमेजिंग फ़ाइल खींचकर में" जैव प्रारूप आयात के विकल्प को विभाजित चैनल "" बॉक्स को टिक "प्रत्येक रोशनी चैनल के लिए एक अलग छवि ढेर प्राप्त करने के लिए (डीआईसी , आरएफपी, YFP)।
  3. वैकल्पिक: प्रत्येक चैनल के लिए अलग से समय श्रृंखला refocusing (कदम 3.9) के कारण छवि अधिग्रहण में में एक को तोड़ने से उत्पन्न मर्ज करने के लिए संबंधित छवि के ढेर खोलने और चलाने के लिए "छवि> ढेर> उपकरण> जुटना" (डीआईसी, आरएफपी, YFP )।
  4. छवि के ढेर के माध्यम से स्क्रॉल करके समय व्यतीत हो जाने के डेटा की गुणवत्ता का आकलन। hyphae कि समय के साथ ध्यान में रुके थे, शो फुई विकास के लिए देखो और अंततः बीजाणुओं (डीआईसी ढेर) के रूप में। , वनस्पति या sporogenic hyphae (YFP ढेर) में एकल या एकाधिक छल्ले, सीढ़ी की तरह संरचनाओं के गठन hyphal सुझावों पर DivIVA-mCherry (आरएफपी ढेर) और FtsZ-YPet के लिए उम्मीद की subcellular स्थानीयकरण जांच करते क्रमशः।
  5. नीचे की ओर processi के लिए ब्याज की एक क्षेत्र को अलग-थलगछवियों की एनजी। समय चूक माइक्रोस्कोपी अक्सर जो फिजी द्वारा प्रसंस्करण धीमा हो सकता है बड़ा फ़ाइलों का उत्पादन। इसलिए यह पहचान करने और ब्याज (आरओआई) के एक क्षेत्र को अलग और छवि ढेर के इस छोटे संस्करण पर आगे की छवि प्रसंस्करण चरणों को पूरा करने के लिए सिफारिश की है।
    1. मेनू में "आयताकार चयन" उपकरण का चयन करें और इस तरह है कि विकासशील hyphae छवि श्रृंखला के दौरान रॉय द्वारा संलग्न हैं में डीआईसी छवि ढेर में एक आयताकार रॉय आकर्षित।
    2. "Ctrl +" "बदलाव" + "डी" के साथ डुप्लिकेट रॉय ढेर।
    3. YFP छवि ढेर के नाम पट्टी पर क्लिक करें और चुनें "संपादित करें> चयन> पुनर्स्थापित चयन" मेनू में मूल डीआईसी से पिछले आयताकार चयन बहाल YFP ढेर में एक ही स्थिति के लिए ढेर और "Ctrl" के साथ रॉय नकल करने + 'शिफ्ट' + 'डी'।
    4. आरएफपी ढेर के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
  6. छवियों को संरेखित में तीन छवि टी ढेरओ समय के साथ XY विमान में मंच drifts को हटा दें। डीआईसी ढेर में पिछले फ्रेम करने के लिए स्क्रॉल करें और मेनू से चुनें "प्लगइन> पंजीकरण> StackReg> RigedBody"। आरएफपी और YFP छवि ढेर के लिए इस चरण को दोहराएँ। यदि आवश्यक हो, कदम 4.5.1-4.5.3 दोहरा द्वारा रॉय फसल।
  7. वैकल्पिक: चमक और विपरीत स्वयं "चमक और विपरीत उपकरण को समायोजित" ( "Ctrl +" "बदलाव" + "सी") या चयन के साथ प्रत्येक छवि के ढेर के लिए "प्रक्रिया> विपरीत बढ़ाने" मेनू से समायोजित करें और "सामान्य" लागू ढेर में सभी छवियों के लिए आदेश। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि बाद के आदेश पिक्सेल मूल्यों बदल जाएगा और इसलिए नीचे की ओर छवि विश्लेषण प्रभावित कर सकता है।
  8. वैकल्पिक: अलग-अलग ढेर गठबंधन (आरजीबी फ़ाइल स्वरूप में परिवर्तित, 4.11 देखें) क्षैतिज या खड़ी प्लगइन का उपयोग "छवि> ढेर> उपकरण> जुडा है"।
  9. एक पैमाने पर पट्टी जोड़ें ( "विश्लेषण> उपकरण> स्केल बार") और एक समय Stamper (&# 34; छवि> ढेर> समय Stamper ")।
  10. "झगड़ा" प्रारूप में एक छवि दृश्य के रूप में संशोधित छवि के ढेर को बचाओ। एक फिल्म का निर्माण करने के लिए, ".avi" के रूप में बचाने के लिए। वैकल्पिक रूप से, "जैव प्रारूप> जैव प्रारूप निर्यातक" प्लगइन और ".mov" फ़ाइल प्रकार का चयन का उपयोग कर QuickTime प्रारूप में निर्यात छवि श्रृंखला।
  11. एकल फ्रेम से चित्रों को प्राप्त करने के लिए, ब्याज की फ्रेम का चयन करें और छवि "Ctrl +" "बदलाव" नकल + 'डी'। परिणामस्वरूप छवि को "आरजीबी" या "8 बिट" के तहत "छवि> प्रकार> आरजीबी रंग या 8 बिट" का प्रकार बदलने और 'झगड़ा' के रूप में छवि को बचाने के।
    नोट: फिजी अतिरिक्त कार्य आगे व्याख्या करने के लिए या प्रक्रिया में समय चूक श्रृंखला के एक नंबर प्रदान करता है। विस्तृत जानकारी (http://fiji.sc/Fiji) के लिए फिजी ऑनलाइन समर्थन करने के लिए जाओ।

Representative Results

पूरे एस के सफल रहते सेल इमेजिंग venezuelae जीवन चक्र अंकुरण, वनस्पति विकास और sporulation (चित्रा 3, मूवी 1) के प्रमुख विकास के चरणों सहित एक सतत समय श्रृंखला अर्जित करता है। जीवन चक्र के माध्यम से प्रगति के दृश्य के आगे DivIVA-mCherry और FtsZ-YPet के विशिष्ट subcellular स्थानीयकरण द्वारा बढ़ाया है। अंकुरण और वनस्पति के विकास के दौरान, DivIVA-mCherry विशेष रूप से बढ़ रहा है hyphal सुझावों या नव शाखा अंक के गठन (चित्रा 4 ए) के निशान पर जम जाता है। इन परिणामों के DivIVA 12,26 की पहले से सूचना दी subcellular स्थिति के साथ लाइन में हैं। इसके विपरीत, FtsZ-YPet रूपों से बढ़ फुई (चित्रा 4 बी) में अनियमित अंतराल पर एक अंगूठी संरचनाओं की तरह। इन संरचनाओं गैर सिकुड़नेवाला वनस्पति पार दीवारों के संश्लेषण के लिए पाड़ प्रदान करते हैं interconn के गठन के लिए अग्रणीected hyphal डिब्बों 8। Sporogenic hyphae में hyphae बढ़ रही है की सेलुलर भेदभाव ध्रुवीय DivIVA-mCherry foci के लापता होने से दृश्यमान हो जाता है, ध्रुवीय विकास की गिरफ्तारी और FtsZ-YPet प्रतिदीप्ति के सहवर्ती वृद्धि (चित्रा 4C)। hyphae sporulating में, FtsZ-YPet के स्थानीयकरण पैटर्न नाटकीय रूप से बदलता है; पहले पेचदार FtsZ-YPet तंतु Hypha साथ गिरना और फिर, अचानक, लगभग तुल्यकालिक घटना में, इन सर्पिलों नियमित रूप से स्थान दिया गया है FtsZ-YPet छल्ले की एक सीढ़ी में सम्मिलित। यहाँ वर्णित प्रयोगात्मक शर्तों के तहत, इन समान रूप से वितरित FtsZ-YPet सीढ़ी लगभग 2 घंटे के लिए जारी रहती है। अंत में, sporulation सेप्टा अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) छवियों (चित्रा 4D) और अंत में नई बीजाणुओं जारी कर रहे हैं में नमूदार हो जाते हैं।

बाद में प्रोटोकॉल फिजी सॉफ्टवेयर के रूप में प्रदान करता है का उपयोग कर छवि प्रसंस्करण का वर्णन TEP-दर-कदम कैसे हासिल कर ली समय चूक श्रृंखला (1 मूवी) से प्रकाशन के लिए एक फिल्म का निर्माण करने के स्पष्टीकरण की।

चित्र तीन
चित्रा 3: एस के एक प्रतिनिधि समय चूक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी श्रृंखला से स्नैपशॉट चित्र venezuelae उत्पादन fluorescently लेबल FtsZ (हरा) और DivIVA (लाल) से पता चला मर्ज किए गए चित्र के चयनित फ्रेम कर रहे हैं (शीर्ष पैनल: आरएफपी YFP डीआईसी, नीचे पैनल: डीआईसी)। अंकुरण, वनस्पति विकास और sporulation सहित Streptomyces जीवन चक्र visualizing। छवियों से मूवी 1. समय लिया गया था मानव संसाधन में है: मि। स्केल सलाखों = 5 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 4: Streptomyces जीवन चक्र का एक सफल समय चूक श्रृंखला के लिए प्रतिनिधि परिणाम (ए) DivIVA-mCherry का स्थानीयकरण।। आरएफपी दिखाया और डीआईसी चैनलों के विलय छवियों के साथ फिल्म 1 से दो बाद समय अंक की फोटो हैं। DivIVA-mCherry नई hyphal शाखा साइटों (भरा तीर सिर) के निशान और ध्रुवीय विकास (खुला तीर सिर) के निर्देशन के लिए hyphal नोक पर localizes। स्केल बार = 10 माइक्रोन (बी) वनस्पति विकास (तीर सिर) के दौरान FtsZ-YPet स्थानीयकरण। FtsZ-YPet रूपों एकल अंगूठी संरचनाओं की तरह (ऊपरी पैनल) कि कसना नहीं है (डीआईसी, कम पैनल)। (सी) FtsZ-YPet (हरा) sporulation दो भागों में विभाजित दौरान स्थानीयकरण। (: न्यूनतम मानव संसाधन) DivIVA-mCherry foci गुजरे समय नीचे दर्शाया साथ, लाल रंग में दिखाया गया है। स्केल पट्टी: 5 माइक्रोन। (डी) (सी) से sporulating hyphae की डीआईसी छवियों इसी रूप दिखादिखाई sporulation सेप्टा (बाएं छवि) के साथ prespore डिब्बों, जो अंततः बीजाणुओं की एक श्रृंखला (सही छवि) में परिपक्व की समझना। समय मानव संसाधन में है: मि। स्केल बार = 5 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

फिल्म 1 से फ़्रेम
फिल्म 1: समय व्यतीत हो जाने के जीवन चक्र venezuelae Streptomyces की प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी श्रृंखला फिल्म विलय आरएफपी YFP छवियों (बाएं) और इसी अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) छवियों (दाएं) के होते हैं।। DivIVA-mCherry हरे रंग में लाल और FtsZ-YPet में दिखाया गया है। एकल फ्रेम के बीच समय अंतराल 40 मिनट है। स्केल बार = 10 माइक्रोन। Thi देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंफिल्म।

Discussion

Streptomyces जीवन चक्र के समय चूक माइक्रोस्कोपी अतीत में तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो गया है। यहाँ हम सेल polarity मार्कर DivIVA और कोशिका विभाजन प्रोटीन FtsZ करने के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन fusions का उपयोग कर कल्पना और (चित्रा 2) विकास कार्यक्रम के माध्यम से प्रगति का पता लगाने में मदद करने के लिए पूरा जीवन चक्र का जीना सेल इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए एक मजबूत प्रोटोकॉल उपस्थित थे।

इस विधि के लिए केंद्रीय एस की खेती है एक microfluidic युक्ति है कि खर्च मध्यम (बिताया एमवाईएम-ते) के साथ लगातार मध्यम छिड़काव और सामान्य मध्यम विकास (एमवाईएम-ते) के आदान-प्रदान की अनुमति देता में venezuelae। संस्कृति हालत बदलने के लिए, क्योंकि संस्कृति के माध्यम से खर्च में किसी भी अभी तक अज्ञात कोशिकी संकेतों के रूप में कुओं (जैसे कोरम संवेदन संकेतों) के रूप में पोषक तत्वों की downshift वर्णित प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण है sporulation को बढ़ावा देने, जबकि पोषक तत्वों से भरपूर माध्यम की एक सतत आपूर्ति वनस्पति growt को उत्तेजित करता हैशायद ही कोई बीजाणु गठन के साथ एच (डेटा) नहीं दिखाया। इस प्रकार, इस microfluidic प्रणाली में संवर्धन कोशिकाओं agarose पर संवर्धन कोशिकाओं क्योंकि यह अधिक प्रायोगिक लचीलापन प्रदान करता है और संस्कृति की स्थितियों को बदलने के जवाब में बैक्टीरिया विकास में परिवर्तन की लंबे समय तक निगरानी की अनुमति देता है के लिए बेहतर है। हालांकि microfluidic प्लेटों एकल उपयोग के लिए तैयार कर रहे हैं केवल, चैनलों कि कोशिकाओं बाद के प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ टीका नहीं किया गया है प्रवाह। हम एक सप्ताह के भीतर एक microfluidic थाली के सभी चैनलों का उपयोग करना चाहिये जैसा कि हम प्लेटें कि अब समय के लिए खोल दिया गया है करने के लिए कई गुना सील समस्याओं का अनुभव किया।

जब एक प्रयोग की स्थापना, हमने पाया है कि हौसले से तैयार बीजाणुओं, प्रवाह कक्ष में लोड किया जा रहा से दो घंटा के भीतर अंकुरित जबकि एक जमे हुए ग्लिसरॉल स्टॉक से निकाली गई बीजाणुओं की आवश्यकता कम से कम 6 घंटा पहले रोगाणु नलियों में उभरा (डेटा) नहीं दिखाया। अंकुरण में इस देरी प्रयोग की लंबाई में फैली हुई है और साथ हस्तक्षेप कर सकते हैंउपकरण की उपलब्धता और प्रयोगात्मक शर्तों। यह भी कम से कम 3 घंटे के लिए एमवाईएम ते के छिड़काव के साथ प्रयोग शुरू करने के लिए विकास और रोगाणु ट्यूबों के परिणाम के लिए पर्याप्त पोषक तत्व प्रदान करने के लिए महत्वपूर्ण है। MYM-ते के साथ छिड़काव यदि प्रयोग वनस्पति के विकास का अध्ययन करने के लिए बनाया गया है प्रारंभिक 3 घंटा से आगे बढ़ाया जा सकता है। जबकि बीजाणुओं सामग्री शुरू की पहली पसंद प्रदान करते हैं, लघु hyphal टुकड़े भी microfluidic प्लेट में लोड किया जा सकता है। हालांकि, लदान क्षमता जब sheared फुई का उपयोग महत्वपूर्ण कम है और अक्सर कई लोडिंग रन जब गैर sporulating म्यूटेंट की जांच है जो एक सीमा उपस्थित हो सकता है की आवश्यकता है। इस्तेमाल किया inoculum के प्रकार के बावजूद, यह बीजाणुओं या इस रूप में hyphal टुकड़े के साथ संस्कृति कक्ष अधिभार नहीं तेजी से भीड़भाड़ है कि मीडिया के प्रसार के साथ हस्तक्षेप और छवि विश्लेषण जटिल हो सकता है का नेतृत्व करेंगे महत्वपूर्ण है।

यह संवाददाता प्रोटीन के निर्माण की योजना के लिए महत्वपूर्ण है carefully Streptomyces में प्रतिदीप्ति समय चूक इमेजिंग में उपयोग के लिए। लक्ष्य प्रोटीन और फ्लोरोसेंट रिपोर्टर और एन या सी टर्मिनल fusions के चुनाव के बीच लिंकर लंबाई महत्वपूर्ण हो सकता है। इसके अलावा, इमेजिंग आवृत्ति और समय जोखिम सहित इष्टतम प्रयोगात्मक शर्तों, प्रत्येक fluorescently टैग प्रोटीन के लिए पहले से निर्धारित किया जा करने की जरूरत है। एस venezuelae hyphae प्रदर्शनी हरी / पीला चैनल कि समस्याग्रस्त एक fluorescently लेबल प्रोटीन है कि निम्न स्तर पर व्यक्त की है जब इमेजिंग बन सकते में ऑटो प्रतिदीप्ति। इसके अलावा, यह है कि ध्यान दिया जाना चाहिए, अंकुरण और प्रारंभिक वनस्पति के विकास के चरण, एस के दौरान venezuelae विशेष रूप से लघु तरंग दैर्ध्य प्रकाश (उदाहरण के लिए जब सीएफपी करने के लिए प्रोटीन fusions का उपयोग) के प्रति संवेदनशील है।

बैक्टीरिया का जीना सेल इमेजिंग के लिए इमेजिंग तकनीक और फ्लोरोसेंट संवाददाता प्रणालियों के क्षेत्र में निरंतर प्रगति के बावजूद, सॉफ्टवेयर संकुल के अधिकांश (जैसे MicrobeTracker, Schnitzelcएल, CellProfiler) डेटा सेट के इन प्रकार के बाद स्वचालित प्रसंस्करण के लिए एक बहुकोशिकीय जीवन शैली के साथ 27-29 filamentous बैक्टीरिया से निकाली गई छवियों के विश्लेषण का समर्थन नहीं करते। इस प्रकार, वहाँ Streptomyces और अन्य filamentous बैक्टीरिया से इमेजिंग डेटा के मात्रात्मक उच्च throughput विश्लेषण के लिए एक उपयुक्त एल्गोरिथ्म विकसित करने की आवश्यकता है।

सारांश में, काम यहाँ वर्णित एस की अपार क्षमता को दर्शाता है क्योंकि तरल में sporulate के लिए अपनी क्षमता का जीनस के लिए एक नया मॉडल विकास प्रणाली, के रूप में venezuelae। microfluidic संवर्धन डिवाइस अनुभवहीन उपयोगकर्ताओं के लिए भी उपयोग करने के लिए सरल है। यह सेल जैविक गतिशील प्रोटीन स्थानीयकरण, ध्रुवीकृत विकास, और unigenomic बीजाणुओं की जंजीरों में एक बहुकोशिकीय फुई की रूपात्मक भेदभाव सहित Streptomyces जीवन चक्र, के लिए केंद्रीय प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मंच प्रदान करता है। इसके अलावा इस प्रयोगात्मक यू सेटपी भी इस तरह के फ्लोरोसेंट डी -amino एसिड पेप्टीडॉग्लीकैन संश्लेषण या propidium आयोडाइड और 4 पर नजर रखने के लिए ', 6-diamidino-2-phenylindole के रूप में विकास में घटनाओं है कि संस्कृति की स्थिति बारी की आवश्यकता होती है, या फ्लोरोसेंट रंगों के उपयोग की जांच करने के लिए एक आकर्षक प्रारंभिक बिंदु प्रदान करता है (DAPI) गुणसूत्र संगठन 30,31 कल्पना करने के लिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B04A CellAsic ONIX plate for bacteria cells Merck-Millipore B04A-03-5PK Microfluidic culture plates
CellAsic ONIX Microfluidic Perfusion System and ONIX FG (version 5.0.2) Merck-Millipore EV-262 The latest ONIX vesion (July 2015) and instructions on how to use the programme can be found here: http://www.merckmillipore.com
Axio Observer.Z1 Microscope Zeiss 431007-9902-000 Fully automated and motorized inverted widefield microscope
Incubator XL multi S1 with Temperature Module S1 and Heating unit XL S2 Zeiss 411857-9061-000 Environmental chamber surrounding the microscope
Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC objective Zeiss 420792-9800-000
Ocra FLASH 4 V2 Hamamatsu Photonics K.K. C11440-22CU
Illuminator HXP 120V Zeiss 423013-9010-000
FL Filter Set 46 HE YFP shift free Zeiss 489046-9901-000 Fluorescent filter set, excitation 500/25 nm, emission 535/30 nm
FL Filter Set 63 HE RFP shift free Zeiss 489063-0000-000 Fluorescent filter set, excitation 572/25 nm, emission 629/30 nm
Mounting frame K-M for multiwell plates Zeiss 000000-1272-644 Stage holder for microfluidic plate
ZEN pro 2012 Zeiss 410135-1002-120 Microscope control software
ZEN Module Time Lapse Zeiss 410136-1031-110 Software module to set up time-lapse microscopy experiments
ZEN Module Tiles/Positions Zeiss 410136-1025-110 Software module to save specific stage positions (xzy)
Fiji open-source software package http://fiji.sc/Fiji Generation of time-lapse movies
Maltose-Yeast Exctract-Malt Extract (MYM)
4 g Maltose
4 g Yeast extract
10 g Malt extract
add 1 L H2O using 50 % tap water and 50 % reverse osmosis water and supplement with 200 ml of R2 trace element solution per 100 ml after autoclaving		 Sporulation medium used to culture S. venezuelae SV60
R2 Trace element solution (TE)
8 mg ZnCl2
40 mg FeCl3-6H2O
2 mg CuCl2-2H2O
2 mg MnCl2-4H2O
2 mg Na2B4O7-10H2O
2 mg (NH4)6Mo7O24-4H2O
add 200 ml H2O
Autoclave and store at 4 oC		 Add 0.002 volumes to MYM
PBS (phosphate buffered saline) Sigma P4417-100TAB Used to refill inlet wells of unused lanes in B04A plates in order to prepare plate for short-term storage.
0.22 µm syringe filters Satorius stedim 16532-K Preparation of spent MYM-TE
SV60 John Innes Centre strain collection S. venezuelae strain expressing divIVA-mcherry and ftsZ-ypet

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 108, समय चूक माइक्रोस्कोपी FtsZ DivIVA ध्रुवीय विकास sporulation विकास microfluidic युक्ति फिजी सॉफ्टवेयर।

Erratum

Formal Correction: Erratum: Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device
Posted by JoVE Editors on 07/01/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

The author's name was updated from:

Mark Buttner

to:

Mark J. Buttner

पूरा का प्रतिदीप्ति समय चूक इमेजिंग<em&gt; एस। venezuelae</em&gt; जीवन चक्र एक microfluidic युक्ति का प्रयोग
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Schlimpert, S., Flärdh, K.,… More

Schlimpert, S., Flärdh, K., Buttner, M. J. Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device. J. Vis. Exp. (108), e53863, doi:10.3791/53863 (2016).

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