Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Fluorescens Time-lapse Imaging af Complete Published: February 28, 2016 doi: 10.3791/53863
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Molecular Microbiology, John Innes Centre, Norwich Research Park, 2Department of Biology, Lund University

ERRATUM NOTICE

Introduction

Streptomycetes er jordboende bakterier, der er kendetegnet ved en kompleks udviklingsmæssig cyklus involverer morfologisk differentiering fra en flercellede, næringsstof-latrintømning mycelium til hvilende, unigenomic sporer 1-3.

Under gunstige vækstbetingelser, en typisk Streptomyces Spore begynder at spire ved ekstrudering én eller to mikroberør (figur 1). Disse rør langstrakt med tip udvidelse og vokse ind i en forgrenet hyfe netværk kendt som den vegetative mycelium. Polar vækst og hyfeforgrening er instrueret af den væsentlige protein DivIVA. Denne coiled-coil-protein er en del af en stor cytoplasmatisk kompleks kaldet polarisome, hvilket er afgørende for indsættelse af nye celle kuvert materiale ved strækker spidsen 4-7. Under vegetativ vækst, de svampetrådenes filamenterne bliver ruminddelt af sjældne dannelse af såkaldte cross-vægge 8. Dannelsen af ​​disse tværgående vægge re quires FtsZ, tubulin-lignende cytoskeletale protein der er essentielt for celledeling i de fleste bakterier 9. I Streptomyces, men disse vegetative cross-vægge ikke fører til indsnævring og celle-celle-adskillelse og derfor myceliemassen forbliver som et netværk af indbyrdes forbundne syncytial rum. Som reaktion på næringssaltbegrænsning og andre signaler, der ikke er godt forstået, specialiserede lufthyfer bryde væk fra den vegetative mycelium og vokse i luften 3. Opførelsen af ​​disse strukturer initierer reproduktive udviklingsfase, hvor den lange multi-genomisk lufthyfer blive opdelt i snesevis af lige store unigenomic prespore rum. Denne massive celledeling begivenhed er drevet af den synkrone konstriktion af flere FtsZ ringe inden enkelt sporogenic hyfer 2,10. Morfologisk differentiering er afsluttet ved frigivelse af hvilende, tykvæggede, pigmenterede sporer.

t "fo: holde-together.within-side =" 1 "> Figur 1
Figur 1:. Den Streptomyces livscyklus på faste medier Dette er en model af livscyklus baseret på klassiske studier af S. coelicolor vokser på agarplader. Den cellulære udvikling af en sporesuspension begynder med dannelsen af ​​en eller to mikroberør, som vokser ved spids forlængelse for at danne et netværk af forgrenende hyfer. Polar vækst og forgrening af den vegetative hyfer er instrueret af DivIVA (rød). Dannelsen af ​​vegetative cross-vægge kræver FtsZ (grøn). Som svar på begrænsninger næringsstoffer og andre signaler, der lufthyfer rejst. Anholdelse af antenne vækst er tæt koordineret med samling af en stige af FtsZ-ringe, som giver anledning til den sporuleringen septa, der inddeler den sporogenic hyfer i box-lignende prespore rum. Disse rum samle en tyk spore- væg og er til sidst Released som modne pigmenterede sporer.

De vigtigste udviklingsmæssige begivenheder i Streptomyces livscyklus er godt karakteriseret 1,3. Men hvad er stadig sparsomme er celle biologiske undersøgelser, der beskæftiger fluorescens time-lapse mikroskopi til at give indsigt i de subcellulære processer understøtter differentiering, såsom protein lokalisering dynamik, kromosom bevægelse og udviklingsmæssigt kontrolleret celledeling. Lev-cell imaging af Streptomyces udvikling har været en udfordring på grund af kompleksiteten af livscyklus og de ​​fysiologiske egenskaber af organismen. Tidligere undersøgelser på den vegetative vækst og de ​​indledende stadier af sporedannelse septumdannelse har ansat oxygenpermeable billeddannende kamre, eller agarose-understøttede vækst af Streptomyces coelicolor på et mikroskop stadium 11-15. Disse metoder er imidlertid begrænset af en række faktorer. Nogle systemer tillader kun kortvarig billeddannelse af cellevækst end fluorescerende proteiner før celler lider under utilstrækkelig ilttilførsel eller vokse ud af fokusplanet på grund af den tredimensionale mønster af hyfe udvikling. I tilfælde, hvor langsigtet billeddannelse er mulig, dyrke celler på agarose puder grænser eksperimentel fleksibilitet, fordi cellerne ikke kan udsættes for alternative vækst- eller stresstilstande, og baggrunden fluorescens fra mediet i agarose puder alvorligt begrænser muligheden for at overvåge svagere fluorescerende signaler.

Her beskriver vi en protokol for live-cell imaging af komplette Streptomyces livscyklus med fremragende præcision og følsomhed. Ved at dyrke Streptomyces i et mikrofluidapparat tilsluttet en fluorescens vidvinklede mikroskop (Figur 2), er vi nu i stand til at overvåge spiring, vegetativ vækst og sporedannelse septumdannelse over en tidsperiode på op til 30 timer. Dette er i høj grad lettes ved anvendelse af de nye model organisme Streptomyces venezuelae fordi det sporulates til nær færdiggørelse i nedsænket kultur og derved overvinder begrænsningen af den klassiske model arter S. coelicolor, som kun sporulates på faste medier 16-20. At hjælpe med at visualisere vegetativ vækst og sporedannelse, vi coudtrykke fluorescens mærkede versioner af cellepolaritet markør DivIVA og nøglen celledeling protein FtsZ.

Vi bruger en kommercielt tilgængelig mikrofluidanordning, der er blevet anvendt med held til mycobakterier, Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis og gær 21-25. Systemet fælder celler i et enkelt fokalplan og tillader kontrol med kontinuerlig perfusion af dyrkningsmedium fra forskellige reservoirer. I detaljeret protokol tager vi fordel af denne funktion til at udsætte S. venezuelae vegetativ mycelium til en ernæringsmæssig nedgearing til fremme sporedannelse.

Protokollen deScribed er for live-cell imaging af hele Streptomyces livscyklus, men alternative medier betingelser eller mikroskop indstillinger kan vælges, hvis specifikke udviklingstrin er af særlig interesse.

Figur 2
Figur 2: Skematisk afbilder eksperimentelle arbejde-flow. De tre vigtigste trin, der er beskrevet i protokollen, er vist. Først sporer og brugte medium fremstilles ud fra en stationær fase kultur. For det andet er de friske sporer fyldt i en mikrofluidsystem og S. venezuelae afbildes hele dets udviklingsmæssige livscyklus hjælp af et fuldt automatiseret inverteret mikroskop med en inkubation kammer til at opretholde en optimal væksttemperatur. For det tredje er det time-lapse-serien opnåede analyseres og behandles med open source-software Fiji.

Protocol

1. Isolering af Fresh S. venezuelae Sporer og Udarbejdelse af brugt Culture Medium

  1. Podes 30 ml Maltose-gærekstrakt-malt-ekstrakt (MYM) medium suppleret med 60 pi R2 sporstof løsning (TE), med 10 pi sporer af stammen SV60 [attB φ BT1 :: pSS209 (P divIVA - divIVA-mcherry P ftsZ -ftsZ-ypet)]. For konsekvent vækst og sporedannelse af cellerne, skal du bruge en forbløffet kolbe eller en kolbe, som indeholder en fjeder til at give mulighed for tilstrækkelig udluftning.
  2. Dyrke celler i 35-40 timer ved 30 ° C og 250 rpm.
  3. Undersøg cellerne ved væske monteret fase-kontrast mikroskopi. På dette tidspunkt myceliefragmenter og sporer vil være synlige.
  4. Centrifuge 1 ml celler i en table-top centrifuge ved 400 xg i 1 min for at pelletere myceliet og større cellefragmenter.
  5. Overfør ca. 300 pi supernatant containing en suspension af sporer i et nyt 1,5 ml rør og holde på is. Hold resterende dyrkningsmedium til trin 1.7.
  6. Fortynd sporer 1:20 i MYM-TE (slutkoncentration: 0,5-5 x 10 7 sporer / ml) og holde på is indtil brug (se trin 2.3).
    Bemærk: Selv om de nøjagtige betingelser, der udløser sporedannelse i Streptomyces ikke er forstået, bruger brugt MYM-TE medium, herunder eventuelle ukendte ekstracellulære signaler fra en sporedannende kultur, stimulerer sporedannelse.
  7. Filter-sterilisere 10 ml af det resterende dyrkningsmedium at få brugt MYM-TE, der er fri for sporer og myceliefragmenter. Brug en steril 0,22 um sprøjtefilter og overførsel tilbragte MYM-TE til et sterilt 15 ml rør.
  8. Hold forberedt brugt MYM-TE i et par dage ved 4 ° C, hvis der skal gennemføres yderligere forsøg med lignende vækstbetingelser.

2. Fremstilling af den mikrofluidapparatet

Bemærk: Hver mikrofluid plate muliggør op til fire uafhængige forsøg, der skal udføres. For at undgå kontaminering af de uudnyttede flow kamre, bruge sterile opløsninger og arbejdsvilkår, når du indstiller et eksperiment.

  1. Fjern forsendelsesløsning fra mikrofluid plade og skyl brøndene med sterilt MYM-TE.
  2. Tilføj 300 pi MYM-TE til indløb godt 1 og 300 pi brugt MYM-TE til brønde 2 til 6.
  3. Load 40 pi fortyndet sporer fra trin 1.6 i celle loading godt 8 lane "A" og forsegle manifolden til pladen ifølge fabrikantens instruktioner.
  4. Start mikrofluidik kontrol software, vælge den relevante plade type og etablere et flow program til prime flowet kanal og kultur kammer ved strømmende medium fra indløbs- brønde 1 til 5 ved 6 psi i 2 min per brønd.
  5. I mikrofluidik kontrol software, skabe et flow-protokol til eksperimentet: flyder MYM-TE fra indløb godt 1 for 6 timer for at tillade spiring og vegetativ vækst af cellerne. Kontaktderefter til perfusion af brugt MYM-TE fra godt 2 til 5 for den resterende tid af eksperimentet. Under forløbet af eksperimentet holde flow tryk konstant på 6 psi (svarende til ca. 9 pi medium / time). Start flow program efter trin 3.5.

3. Opsætning af mikroskopet og Time-lapse Protocol

Bemærk: Denne metode blev gennemført på et helt motoriseret og automatiseret inverteret Vidvinklet mikroskop udstyret med et sCMOS kamera, en metalhalogenlampe, en hardware autofokus, en etape holder til plader med 96 brønde og en miljømæssig kammer.

  1. Pre-varme miljøkammeret til 30 ° C på forhånd for at forhindre problemer med autofokus efter start af forsøget. Den nødvendige tid afhænger af den klimakammer anvendes, mikroskopet og varmesystemet. Begynd at varme systemet op aftenen før forsøget.
  2. Tænd mikroskop og mikroskopi automatisering og kontrol software. Brug en høj numerisk apertur (NA) nedsænkning olie målsætning for optimal signal indsamling og rumlig opløsning, såsom en 100X, 1,46 NA olie DIC mål. Vælg passende filtre og dikromatiske spejle til at erhverve forskellen interferens kontrast (DIC) billeder og billeder af gul-fluorescerende og rød-fluorescerende protein-fusioner.
  3. Placer en dråbe immersionsolie på objektive og tilføj nedsænkning fluidum til bunden af ​​den billeddannende vinduet på mikrofluid plade for at forbedre celle-fokus under billedoptagelse. mount omhyggeligt forseglet mikrofluidapparatet (trin 2.5) på den fase af inverteret mikroskop. Sikre, at pladen er forsvarligt placeret i holderen scenen og ikke vrider sig i løbet af forsøget.
  4. Bring billeddannende vindue i mikrofluid kultur kammer i fokus ved hjælp af de indlejrede positionsmarkører til orientering. Fokus på den yderste venstre del af den første strøm kammer (mærket "A") med fælden størrelse 5, hvilket svarer tilen fælde højde på 0,7 um.
  5. I mikrofluidik software, vejeceller fra indløb godt 8 ved 4 psi i 15 sek. Check celledensiteten i kulturen kammer ved at flytte opmærksomheden i scanningsvindue. Hvis der ikke sporer blev fanget, gentag celle lastning trin eller alternativt øge lastning tryk og / eller tid, indtil den ønskede celletæthed er opnået (1-10 sporer pr billedbehandling vindue med 2.048 x 2.048 pixels). Undgå overbelastning af kultur kammer.
    Bemærk: Vi bruger normalt fælde størrelse 5 til billeddannelse Streptomyces, men vi har også opnået gode resultater med fælde størrelser 4 og 3. Der henvises til leverandørens manual for yderligere forslag om at optimere cellens lastningen.
  6. Start strømmen program i styresoftware fra trin 2.5 og tillade mikrofluid plade til varme-ækvilibrere i 1 time i mikroskopbordet før start billedoptagelse.
  7. I mikroskopet kontrol software, der er nedsat en multi-dimensional erhvervelse at tage multiple billeder på flere trin positioner over tid:
    1. For Autosave: Angiv mappe til automatisk lagring af billedfiler.
    2. Til belysning indstillinger bestemme optimale belysning indstillinger for hver specifik konstruktion på forhånd. For den skitserede eksperiment bruge følgende eksponeringstider: DIC 150 msek, YFP 250 msek, RFP 100 msek.
    3. For Time-serien: oprette en tidsserie for at erhverve billeder på de ønskede tidspunkter i rækkefølge. Til billeddannelse livscyklus S. venezuelae, vælg 40 min tidsinterval over en 24 timers periode.
    4. For Stage positioner og autofokus: scanne kultur kammer ved at flytte scenen og opbevare stage positioner i hvert enkelt imaging position af interesse. Sørg for, at de enkelte fase positioner er placeret tilstrækkeligt fra hinanden til at minimere fotoblegning og phototoxicity.Typically bruge op til 12 positioner. Kør autofokus rutine for hvert tidspunkt til at korrigere for langsom fokal afdrift. Hvis det er tilgængeligt i mikroskopet kontrol softwareIndstil autofokus strategi til "lokal opdatering overflade ved hardware autofokus". Når Z-koordinaterne for de valgte stage positioner er verificeret, aktiveres hardware autofokus.
  8. Start time-lapse eksperiment i mikroskopet kontrol software.
  9. Kontroller, at alle fase positioner er stadig i fokus på senere point. For time-lapse eksperimenter kører over flere timer, vi lejlighedsvis observere en scene drift selv ved brug autofokus. Hvis fase positioner bør refokuseres, standse eksperimentet på et passende tidspunkt, justere fokus og genstart eksperimentet inden for den definerede imaging tidsinterval (trin 3.7.3). Se trin 4.3 for hvordan til at sammenkæde tidsserien.
  10. Stop erhvervelse billede efter 24-30 timer, eller når hyfer i området af interesse er differentieret i sporer (se DIC billedserier). Stop flow program i softwaren og adskille mikrofluidapparatet.
  11. Forbered brugt microfluidic plade til kortvarig storaseri. Fjern resterende MYM-TE og tilbragte MYM-TE fra brønd 1 til 6, tom affald godt 7 og celle lastning godt 8. Under sterile forhold, re-fill bruges brønde af lane "A" og brønde af ubrugte baner ( "B" til "D") på pladen med steril phosphatpufret saltopløsning (PBS). Forsegle skiltet med parafilm at forhindre det i at udtørre og opbevares ved 4 ° C.

4. generation af Time-lapse film Brug Fiji Software

Bemærk: Vi bemærker, at forskellige kommercielle og gratis software pakker er tilgængelige til at behandle time-lapse mikroskopi billeder herunder ZenBlue, Metamorph, ICY, ImagePro eller ImageJ. Her fokuserer vi på Fiji, som er et open source billedbehandling program baseret på ImageJ, og som allerede indeholder en række nyttige forudinstallerede plugins.

  1. Overførsel billeddata fra din time-lapse eksperiment til en computer, der har Fiji installeret.
  2. Start programmet og importere imaging fil ved hjælp af &# 34; Filer> Importer> Bio-formater ". Eller blot ved at trække imaging fil i Fiji I" Bio-formater importindstillinger ", hak i boksen" opdelt kanaler "for at få et separat billede stak for hver belysning kanal (DIC , RFP, YFP).
  3. Valgfrit: Hvis du vil flette separat tidsserie som følge af et brud i den i købet billedet grundet omlægning (trin 3.9), åbne respektive billedstakke og køre "Image> Stacks> Værktøj> Sammenkæde" for hver kanal (DIC, RFP, YFP ).
  4. Vurdere kvaliteten af ​​time-lapse data ved at rulle gennem billedet stakke. Kig efter hyfer, der opholdt sig i fokus over tid, viser mycelievækst og i sidste ende danne sporer (DIC stak). Undersøg den forventede subcellulære lokalisering for DivIVA-mCherry på svampetrådenes tips (RFP stack) og FtsZ-YPet danner enkelte ringe eller flere, stigen-lignende strukturer i vegetative eller sporogenic hyfer (YFP stack), hhv.
  5. Isoler et område af interesse for downstream processing af billederne. Time-lapse mikroskopi ofte producerer store filer, som kan sinke behandlingen af ​​Fiji. Det anbefales derfor at identificere og isolere et område af interesse (ROI) og til at udføre yderligere billedbehandling skridt på denne mindre version af stakken billedet.
    1. Vælg "Rektangulær Selection" værktøj i menuen og tegne en rektangulær ROI i billedet stakken DIC på en sådan måde, at udviklingslandene hyfer er omsluttet af ROI hele billedserien.
    2. Identiske ROI-stack med "Ctrl" + "Shift" + "D".
    3. Klik på navnet bar af billedet stakken YFP og vælg "Rediger> Valg> Gendan Selection" i menuen for at genoprette den tidligere rektangulær markering fra den oprindelige DIC stak til samme positon i YFP stakken og duplikere ROI med "Ctrl" + "Shift" + "D".
    4. Gentag denne proces for RFP stakken.
  6. Juster billederne i tre billedet stakke to fjerne stage driver i xy-planet over tid. Rul til den sidste ramme i DIC stakken og vælg "Plugin> Registrering> StackReg> RigedBody" fra menuen. Gentag dette trin for RFP og YFP billedstak. Hvis det er nødvendigt, beskære ROI ved at gentage trin 4.5.1-4.5.3.
  7. Valgfrit: Juster lysstyrke og kontrast manuelt for hvert billede stak med "Justering af lysstyrke og kontrast Tool" ( "Ctrl" + "Shift" + "C") eller vælg "Process> Forbedr Contrast" fra menuen og anvende "Normalisér" kommando til alle billeder i stakken. Det skal bemærkes, at sidstnævnte kommando vil ændre pixelværdier, og derfor kan påvirke nedstrøms billedanalyse.
  8. Valgfrit: Kombiner individuelle stakke (konverteret til RGB-filformat, se 4.11) vandret eller lodret ved hjælp af plugin "Image> Stakke> Værktøjer> Forbind".
  9. Tilføj en skala bar ( "Analyser> Værktøjer> Scale Bar") og en tid stamper (&# 34; Image> Stakke> Time Stamper ").
  10. Gem ændrede billedfiler stakke som en billedsekvens i ".tiff" format. For at producere en film, gem som ".avi". Alternativt eksport billedserier i QuickTime-format ved hjælp af "Bio-Formater> Bio-formater Eksportør" plugin og vælg ".mov" filtype.
  11. For at få billeder fra enkelte frames, skal du vælge rammen af ​​interesse og duplikere billedet "Ctrl" + "Shift" + "D". Ændre typen af ​​det resulterende billede til "RGB" eller "8-bit" under "Image> Type> RGB-farve eller 8-bit" og gemme billedet som ".tiff".
    Bemærk: Fiji tilbyder en række ekstra funktioner til yderligere at annotere eller proces time-lapse-serien. Gå til Fiji online support til detaljerede oplysninger (http://fiji.sc/Fiji).

Representative Results

Den succesfulde live-cell imaging af hele S. venezuelae livscyklus giver en kontinuerlig tidsserier herunder de centrale udviklingsstadier i spiring, vegetativ vækst og sporedannelse (Figur 3, Movie 1). Visualisering af progression gennem livscyklus er yderligere forstærket af den klare subcellulære lokalisering af DivIVA-mCherry og FtsZ-YPet. Under spiring og vegetativ vækst, DivIVA-mCherry udelukkende akkumuleres på de voksende svampetrådenes tips eller mærker nyligt danner forgreningspunkter (figur 4A). Disse resultater er i overensstemmelse med den tidligere rapporterede subcellulære placering af DivIVA 12,26. I modsætning hertil FtsZ-YPet danner enkelt ring-lignende strukturer med uregelmæssige mellemrum i det voksende mycelium (figur 4B). Disse strukturer giver stilladset til syntese af ikke-konstriktiv vegetative cross-vægge, hvilket fører til dannelsen af ​​interconnected svampetrådenes rum 8. Den cellulære differentiering af voksende hyfer i sporogenic hyfer bliver synlig ved forsvinden polære DivIVA-mCherry foci, arrestation af polære vækst og samtidig stigning af FtsZ-YPet fluorescens (figur 4C). I sporedannende hyfer, lokalisering mønster af FtsZ-YPet ændrer sig dramatisk; første spiralformede FtsZ-YPet filamenter tumler langs hypha og derefter, i en pludselig, næsten synkron begivenhed, disse helixer smelte sammen til en stige af regelmæssigt fordelte FtsZ-YPet ringe. Under de eksperimentelle betingelser, der er beskrevet her, disse jævnt fordelte FtsZ-YPet stiger vare ved ca. 2 timer. Endelig sporedannelse septa blive mærkbar i differential interferens kontrast (DIC) billeder (figur 4D) og til sidst nye sporer frigives.

Den efterfølgende protokol beskriver behandlingen billedet ved hjælp af Fiji software giver som TEP-for-trin forklaring på, hvordan man producerer en film til offentliggørelse af den erhvervede time-lapse-serien (Movie 1).

Figur 3
Figur 3: Snapshot billeder fra en repræsentativ tidsforskudt fluorescensmikroskopi serie af S. venezuelae producerer fluorescerende mærket FtsZ (grøn) og DivIVA (rød) Vist er udvalgte billeder af flettede billeder (øverste panel: RFP-YFP-DIC, bund panel: DIC). visualisere Streptomyces livscyklus, herunder spiring, vegetativ vækst og sporedannelse. Billeder blev taget fra Movie 1. Tid er i hr: min. Scale barer = 5 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

d / 53863 / 53863fig4.jpg "/>
Figur 4: Repræsentative resultater for en vellykket tid-lapse serie Streptomyces livscyklus (A) Lokalisering af DivIVA-mCherry.. Vist er snapshots af to efterfølgende tidspunkter fra Movie 1 med flettede billeder af RFP og DIC-kanaler. DivIVA-mCherry markerer nye hyfe gren sites (fyldt pil hoved) og lokaliserer på hyfe spids til direkte polar vækst (åben pil hoved). Scale bar = 10 um (B) FtsZ-YPet lokalisering under vegetativ vækst (pil hoved). FtsZ-YPet danner enkelt ring-lignende strukturer (øverste felt), som ikke snøre (DIC, nedre panel). (C) FtsZ-YPet (grøn) lokalisering under sporulation tværdeling. DivIVA-mCherry foci vises i rødt, med forløbet tid afbildet nedenfor (hr: min). Målestok: 5 um. (D) Tilsvarende DIC billeder af sporedannende hyfer fra (C), der viser formenation af prespore rum med synlige sporulering septa (venstre billede), som i sidste ende modnes til en kæde af sporer (højre billede). Tiden er i hr: min. Scale bar = 5 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Ramme fra Movie 1
Movie 1: Time-lapse fluorescensmikroskopi serie af Streptomyces venezuelae livscyklus Filmen består af sammenlagte RFP-YFP billeder (til venstre) og den tilsvarende differential interferens kontrast (DIC) billeder (højre).. DivIVA-mCherry vises i rødt og FtsZ-YPet i grøn. Tidsintervallet mellem enkeltbilleder er 40 min. Scale bar = 10 um. Klik her for at se this film.

Discussion

Time-lapse mikroskopi af Streptomyces livscyklus har været teknisk udfordrende i fortiden. Her præsenterer vi en robust protokol til at udføre live-cell imaging af det komplette livscyklus anvendelse af fluorescerende protein fusioner til cellepolaritet markør DivIVA og celledeling protein FtsZ at hjælpe med at visualisere og spore progression gennem udviklingsmæssige program (figur 2).

Centralt for denne fremgangsmåde er dyrkning af S. venezuelae i en mikrofluid enhed, som giver konstant medium perfusion og udveksling af normal vækstmedium (MYM-TE) med brugt medium (brugt MYM-TE). Ændringen af kultur tilstand er vigtig for den beskrevne protokol, fordi den ernæringsmæssige downshift som brønde som nogen endnu uidentificerede ekstracellulære signaler (f.eks quorum sensing signaler) i det brugte dyrkningsmedium, fremme sporulering, mens en konstant forsyning af næringsrige medium stimulerer vegetativ growth med næppe sporedannelse (data ikke vist). Således dyrkning af celler i dette mikrofluidsystem er overlegen i forhold til dyrkning af celler på agarose, fordi det giver mere eksperimenterende fleksibilitet og muliggør langsigtet overvågning af ændringer i bakterievækst som reaktion på skiftende dyrkningsbetingelser. Selvom mikrofluide plader er designet til engangsbrug, strømningskanaler, der ikke er podet med celler kan anvendes i efterfølgende eksperimenter. Vi anbefaler at bruge alle kanaler i en mikrofluid plade inden for en uge, som vi har oplevet problemer forsegling manifolden til plader der er blevet åbnet i længere tid.

Ved opsætning af et eksperiment, fandt vi, at frisk tilberedt sporer spiret inden for to timer for at blive læsset ind i strømmen kammeret, mens sporer afledt af en frossen glycerol lager kræves mindst 6 timer før kimtråde opstået (data ikke vist). Denne forsinkelse i spiring udvider længden af ​​eksperimentet og kan forstyrreudstyr tilgængelighed og eksperimentelle betingelser. Det er også vigtigt at starte eksperimentet med perfusion af MYM-TE i mindst 3 timer for at give tilstrækkelige næringsstoffer til udvikling og udvækst af kim rør. Perfusion med MYM-TE kan udvides ud over den indledende 3 timer, hvis eksperimentet er designet til at studere vegetativ vækst. Mens sporer giver det foretrukne valg af udgangsmateriale, kan korte hyfefragmenter også lægges i mikrofluid plade. Men lastning effektivitet ved brug af klippet mycelium er væsentligt lavere og ofte kræver flere lastning kørsler, som kan udgøre en begrænsning ved undersøgelsen ikke-sporulerende mutanter. Uanset typen af ​​inokulum anvendes, er det vigtigt ikke at overbelaste kultur kammer med sporer eller hyfefragmenter da dette vil føre til hurtig overbelægning, der kan forstyrre medier diffusion og komplicere billedanalysen.

Det er vigtigt at planlægge opførelsen af ​​reporter-proteiner carefully til brug i fluorescens time-lapse billeddannelse i Streptomyces. Linker længde mellem målproteinet og det fluorescerende reporter og valget af N- eller C-terminale fusioner kan være kritisk. Desuden optimale forsøgsbetingelser, herunder billeddannelse frekvens og eksponeringstid, skal fastlægges på forhånd for hver fluorescens-mærkede protein. S. venezuelae hyfer udviser auto-fluorescens i grøn / gul kanal, der kan blive problematisk, når afbildning af et fluorescensmærket protein, der udtrykkes i lave niveauer. Desuden bør det bemærkes, at, under spiring og den indledende vegetative vækstfase, S. venezuelae er særligt følsomme over for korte bølgelængde (fx ved anvendelse af proteinfusioner til FFP).

På trods af de løbende fremskridt i billeddiagnostiske teknikker og fluorescerende reporter systemer til live-cell imaging af bakterier, de fleste af de software-pakker (f.eks MicrobeTracker, Schnitzelcalen, CellProfiler) til efterfølgende automatisk behandling af disse former for datasæt understøtter ikke analysen af billeder, der er afledt af trådformede bakterier med en flercellet livsstil 27-29. Således er der et behov for at udvikle en passende algoritme til kvantitativ high-throughput analyse af billeddata fra Streptomyces og andre trådformede bakterier.

Sammenfattende den her beskrevne arbejde viser det enorme potentiale for S. venezuelae som ny model udviklingsmæssig system til slægten, på grund af dens evne til at danne sporer i væske. Den mikrofluid dyrkning enhed er enkel at bruge, selv for uerfarne brugere. Det giver en fremragende platform til at studere celle biologiske processer er centrale for Streptomyces livscyklus, herunder dynamisk protein lokalisering, polariseret vækst, og den morfologiske differentiering af en flercellet mycelium i kæder af unigenomic sporer. Desuden indstille denne eksperimentelle up tilvejebringer også en fristende udgangspunkt at undersøge begivenheder i den udvikling, der kræver skiftevis dyrkningsbetingelser, eller anvendelse af fluorescerende farvestoffer, såsom fluorescerende D-aminosyrer til overvågning peptidglykansyntese eller propidiumiodid og 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) at visualisere kromosom organisation 30,31.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B04A CellAsic ONIX plate for bacteria cells Merck-Millipore B04A-03-5PK Microfluidic culture plates
CellAsic ONIX Microfluidic Perfusion System and ONIX FG (version 5.0.2) Merck-Millipore EV-262 The latest ONIX vesion (July 2015) and instructions on how to use the programme can be found here: http://www.merckmillipore.com
Axio Observer.Z1 Microscope Zeiss 431007-9902-000 Fully automated and motorized inverted widefield microscope
Incubator XL multi S1 with Temperature Module S1 and Heating unit XL S2 Zeiss 411857-9061-000 Environmental chamber surrounding the microscope
Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC objective Zeiss 420792-9800-000
Ocra FLASH 4 V2 Hamamatsu Photonics K.K. C11440-22CU
Illuminator HXP 120V Zeiss 423013-9010-000
FL Filter Set 46 HE YFP shift free Zeiss 489046-9901-000 Fluorescent filter set, excitation 500/25 nm, emission 535/30 nm
FL Filter Set 63 HE RFP shift free Zeiss 489063-0000-000 Fluorescent filter set, excitation 572/25 nm, emission 629/30 nm
Mounting frame K-M for multiwell plates Zeiss 000000-1272-644 Stage holder for microfluidic plate
ZEN pro 2012 Zeiss 410135-1002-120 Microscope control software
ZEN Module Time Lapse Zeiss 410136-1031-110 Software module to set up time-lapse microscopy experiments
ZEN Module Tiles/Positions Zeiss 410136-1025-110 Software module to save specific stage positions (xzy)
Fiji open-source software package http://fiji.sc/Fiji Generation of time-lapse movies
Maltose-Yeast Exctract-Malt Extract (MYM)
4 g Maltose
4 g Yeast extract
10 g Malt extract
add 1 L H2O using 50 % tap water and 50 % reverse osmosis water and supplement with 200 ml of R2 trace element solution per 100 ml after autoclaving		 Sporulation medium used to culture S. venezuelae SV60
R2 Trace element solution (TE)
8 mg ZnCl2
40 mg FeCl3-6H2O
2 mg CuCl2-2H2O
2 mg MnCl2-4H2O
2 mg Na2B4O7-10H2O
2 mg (NH4)6Mo7O24-4H2O
add 200 ml H2O
Autoclave and store at 4 oC		 Add 0.002 volumes to MYM
PBS (phosphate buffered saline) Sigma P4417-100TAB Used to refill inlet wells of unused lanes in B04A plates in order to prepare plate for short-term storage.
0.22 µm syringe filters Satorius stedim 16532-K Preparation of spent MYM-TE
SV60 John Innes Centre strain collection S. venezuelae strain expressing divIVA-mcherry and ftsZ-ypet

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bush, M. J., Tschowri, N., Schlimpert, S., Flärdh, K., Buttner, M. J. c-di-GMP signalling and the regulation of developmental transitions in streptomycetes. Nat. Rev. Microbiol. 13, 749-760 (2015).
  2. Jakimowicz, D., van Wezel, G. P. Cell division and DNA segregation in Streptomyces.: how to build a septum in the middle of nowhere? Mol. Microbiol. 85, 393-404 (2012).
  3. McCormick, J. R., Flärdh, K. Signals and regulators that govern Streptomyces development. FEMS Microbiol. Rev. 36, 206-231 (2012).
  4. Flärdh, K., Richards, D. M., Hempel, A. M., Howard, M., Buttner, M. J. Regulation of apical growth and hyphal branching in Streptomyces. Curr. Opin. Microbiol. 15, 737-743 (2012).
  5. Hempel, A. M., et al. The Ser/Thr protein kinase AfsK regulates polar growth and hyphal branching in the filamentous bacteria Streptomyces. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 109, E2371-E2379 (2012).
  6. Fuchino, K., et al. Dynamic gradients of an intermediate filament-like cytoskeleton are recruited by a polarity landmark during apical growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, E1889-E1897 (2013).
  7. Holmes, N. A., et al. Coiled-coil protein Scy is a key component of a multiprotein assembly controlling polarized growth in Streptomyces. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, E397-E406 (2013).
  8. McCormick, J. R., Su, E. P., Driks, A., Losick, R. Growth and viability of Streptomyces coelicolor. mutant for the cell division gene ftsZ. Mol. Microbiol. 14, 243-254 (1994).
  9. Margolin, W. FtsZ and the division of prokaryotic cells and organelles. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 862-871 (2005).
  10. Grantcharova, N., Lustig, U., Flärdh, K. Dynamics of FtsZ assembly during sporulation in Streptomyces coelicolor A3(2). J. Bacteriol. 187, 3227-3237 (2005).
  11. Richards, D. M., Hempel, A. M., Flärdh, K., Buttner, M. J., Howard, M. Mechanistic basis of branch-site selection in filamentous bacteria. PLoS Comput. Biol. 8, e1002423 (2012).
  12. Hempel, A. M., Wang, S. B., Letek, M., Gil, J. A., Flärdh, K. Assemblies of DivIVA mark sites for hyphal branching and can establish new zones of cell wall growth in Streptomyces coelicolor. J. Bacteriol. 190, 7579-7583 (2008).
  13. Wolanski, M., et al. Replisome trafficking in growing vegetative hyphae of Streptomyces coelicolor A3(2). J. Bacteriol. 193, 1273-1275 (2011).
  14. Jyothikumar, V., Tilley, E. J., Wali, R., Herron, P. R. Time-lapse microscopy of Streptomyces coelicolor.growth and sporulation. Appl. Environ. Microbiol. 74, 6774-6781 (2008).
  15. Willemse, J., Borst, J. W., de Waal, E., Bisseling, T., van Wezel, G. P. Positive control of cell division: FtsZ is recruited by SsgB during sporulation of Streptomyces. Genes. Dev. 25, 89-99 (2011).
  16. Glazebrook, M. A., Doull, J. L., Stuttard, C., Vining, L. C. Sporulation of Streptomyces venezuelae. in submerged cultures. J. Gen. Microbiol. 136, 581-588 (1990).
  17. Bibb, M. J., Domonkos, A., Chandra, G., Buttner, M. J. Expression of the chaplin and rodlin hydrophobic sheath proteins in Streptomyces venezuelae.is controlled by sigma(BldN) and a cognate anti-sigma factor, RsbN. Mol. Microbiol. 84, 1033-1049 (2012).
  18. Al-Bassam, M. M., Bibb, M. J., Bush, M. J., Chandra, G., Buttner, M. J. Response regulator heterodimer formation controls a key stage in Streptomyces development. PLoS Genet. 10, e1004554 (2014).
  19. Bush, M. J., Bibb, M. J., Chandra, G., Findlay, K. C., Buttner, M. J. Genes required for aerial growth, cell division, and chromosome segregation are targets of WhiA before sporulation in Streptomyces venezuelae. MBio. 4, e00684-e00613 (2013).
  20. Tschowri, N., et al. Tetrameric c-di-GMP mediates effective transcription factor dimerization to control Streptomyces development. Cell. 158, 1136-1147 (2014).
  21. Mirouze, N., Ferret, C., Yao, Z., Chastanet, A., Carballido-Lòpez, R. MreB-Dependent Inhibition of Cell Elongation during the Escape from Competence in Bacillus subtilis. PLoS Genet. 11, e1005299 (2015).
  22. Zopf, C. J., Maheshri, N. Acquiring fluorescence time-lapse movies of budding yeast and analyzing single-cell dynamics using GRAFTS. J. Vis. Exp. (e50456), (2013).
  23. Meniche, X., et al. Subpolar addition of new cell wall is directed by DivIVA in mycobacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 111, E3243-E3251 (2014).
  24. Donovan, C., Schauss, A., Kramer, R., Bramkamp, M. Chromosome segregation impacts on cell growth and division site selection in Corynebacterium glutamicum. PLoS One. 8, e55078 (2013).
  25. Rojas, E., Theriot, J. A., Huang, K. C. Response of Escherichia coli. growth rate to osmotic shock. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 111, 7807-7812 (2014).
  26. Flärdh, K. Essential role of DivIVA in polar growth and morphogenesis in Streptomyces coelicolor A3(2). Mol. Microbiol. 49, 1523-1536 (2003).
  27. Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. High-throughput subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics. Mol. Microbiol. 80, 612-627 (2011).
  28. Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nat. Protoc. 7, 80-88 (2012).
  29. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, R100 (2006).
  30. Kuru, E., Tekkam, S., Hall, E., Brun, Y. V., Van Nieuwenhze, M. S. Synthesis of fluorescent D-amino acids and their use for probing peptidoglycan synthesis and bacterial growth in situ. Nat. Protoc. 10, 33-52 (2015).
  31. Szafran, M., et al. Topoisomerase I (TopA) is recruited to ParB complexes and is required for proper chromosome organization during Streptomyces coelicolor. sporulation. J. Bacteriol. 195, 4445-4455 (2013).

Tags

Immunologi , Tid-lapse mikroskopi FtsZ DivIVA polar vækst sporulering udvikling mikrovæskeanordning Fiji software.

Erratum

Formal Correction: Erratum: Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device
Posted by JoVE Editors on 07/01/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

The author's name was updated from:

Mark Buttner

to:

Mark J. Buttner

Fluorescens Time-lapse Imaging af Complete<em&gt; S. venezuelae</em&gt; Life Cycle Brug af en mikrofluidapparat
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schlimpert, S., Flärdh, K.,… More

Schlimpert, S., Flärdh, K., Buttner, M. J. Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device. J. Vis. Exp. (108), e53863, doi:10.3791/53863 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter