Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Gene Transfer til kylling Auditory Organ med doi: 10.3791/53864 Published: April 17, 2016

Abstract

Kylling embryoner er ideelle modelsystemer til at studere embryonale udvikling som manipulationer af gen-funktion kan udføres med relativ lethed i ovo. Det indre øre auditive sanseorgan er afgørende for vores evne til at høre. Det huser en højt specialiseret sensoriske epithel, der består af mekanisk-transducerende hårceller (HC) og omgivende glia-lignende understøttende celler (SCS). Trods strukturelle forskelle i de auditive organer, er molekylære mekanismer, der regulerer udviklingen af den auditive organ evolutionært bevaret mellem pattedyr og aves in ovo elektroporering er stort set begrænset til tidlige stadier på E1 -. E3. På grund af den relative sene udvikling af den auditive organ på E5, manipulationer af den auditive orgel ved in ovo elektroporering forbi E3 er vanskelig på grund af den avancerede udvikling af kylling embryo på senere stadier. Fremgangsmåden præsenteres her er en forbigående genoverførselsfremgangsmåde til målretning gener af interesse påfase E4 - E4.5 i udviklingslandene kylling auditive sanseorgan via in ovo mikro-elektroporation. Denne metode anvendes til GAIN- og tab af funktioner og konventionelt plasmid DNA-baserede ekspressionsvektorer og kan kombineres med in ovo celleproliferationsassay ved tilsætning edu (5-ethynyl-2'-deoxyuridin), til hele embryo på tid af elektroporering. Anvendelsen af ​​grønt eller rødt fluorescerende protein (GFP eller RFP) ekspressionsplasmider tillader eksperimentatoren hurtigt afgøre, om elektroporering lykkedes at målrette auditive del af den udviklende indre øre. I denne fremgangsmåde papir, er repræsentative eksempler på GFP elektroporeret enheder illustreret; embryoer blev høstet 18 - 96 timer efter elektroporering og målretning af GFP til den pro-sensoriske område for den auditive orgel blev bekræftet ved RNA in situ hybridisering. Fremgangsmåden papir tilvejebringer også en optimeret protokol til anvendelsen af ​​thymidin analog edu at analysere celle spredningsrelateredebejde; et eksempel på en edu baseret celleproliferationsassay, der kombinerer immuno-mærkning og klik edu kemi er tilvejebragt.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Trods forskelle i morfologi og cellulære mønster mellem pattedyr og fugle auditive sanseorgan, er de molekylære faktorer og veje, der er ansvarlige for sensorisk HC udvikling menes at være evolutionært bevaret 1-3. Basilar papilla, som huser de auditive HCS og deres omkringliggende SCs, udvikler sig som en outpocketing i det indre øre otocyst. Tidligt på en pulje af HC og SC stamfædre er angivet i den otiske placode / otiske kop neural-sensorisk kompetent domæne (NSD). Fate-kortlægning data giver belæg for, at neuronale og sensoriske slægter er forbundet og opstå fra NSD placeret i antero-ventrale region af otiske kop eller otocyst i mus og kylling 4,5. Først neuroblaster delaminere fra NSD at give anledning til neuronerne i den auditive-vestibulære ganglion, som i sidste ende opdelt i auditiv og vestibulær ganglier. Disse neuroner innerverer de sensoriske HC'er i det indre øre og kerner i hjernestammen. Cellerne thved forblive i NSD menes at give anledning til forskellige sensoriske patches, herunder den auditive sanseorgan bestående af de mekanisk-transducerende sensoriske HCS og deres tilknyttede SC'er.

I både chick og murine, høreorgan sensorisk progenitorcelle-cyklus exit og HC differentiering forekommer i modsatte hældninger. I chick, begynder auditive stamcelle-cyklus exit omkring ~ E5 og skrider fra bunden til toppen, og fra midten til periferien 6. En dag senere, HC differentiering starter i spidsen og udvikler sig til bunden 7. Undersøge udviklingen af det indre øre i kylling giver mange tekniske fordele som funktionelle mekanismer kan undersøges med relativ lethed in ovo i modsætning til at manipulere embryoner in utero i andre modelsystemer, som kræver komplekse operationer. Den her beskrevne metode bruger i ovo mikro-elektroporation til at målrette gener af interesse i den formodede Basilar papilla område anterior-ventralt i otisk vesikel specifikt mod E4.

Elektroporering in ovo er en teknik, er veletableret og almindeligt anvendte 8-14. Princippet i elektroporationsteknik er baseret på den kendsgerning, at nukleotider (fx plasmid-DNA, syntetisk DNA eller RNA oligonukleotider) er negativt ladede. DNA'et injiceres i vævet af interesse. Når en elektrisk strøm sættes på tværs af væv, den nuværende åbner transiente porer i cellevæggene og muliggør optagelse af DNA, som det negativt ladede DNA flyder mod den positive elektrode (anoden). For gevinst-of-function eksperimenter, er gener af interesse almindeligvis subklonet i ekspressionsplasmider, der indeholder passende ekspressionskassetter for grønt fluorescerende protein (GFP) eller rødt fluorescerende protein (RFP). For tab-af-funktion eksperimenter plasmid-baserede dominerende negative repressor konstruktioner eller RNAi eller morpholino konstruktioner er commonly brugt 15,16. Til hæmning microRNA (miRNA) -funktionen miRNA svamp konstruktioner, som typisk plasmid baseret, kan anvendes 17. Den her beskrevne fremgangsmåde giver mulighed for at undersøge de molekylære mekanismer, der styrer proliferation og differentiering i den auditive organ, som den in ovo mikro-elektroporeringsmetoden kan let kombineres med in ovo celleproliferationsassay ved tilsætning edu til hele embryo.

Den elektroporering og tilsætning af edu udføres ved E4 i otisk vesikel, der er én dag før indtræden af ​​cellecyklus-exit i den auditive orgel. Analyse af den auditive organ er typisk 18 - 96 timer efter elektroporering ved E5 (indtræden af ​​sensorisk progenitorcelle-cycle exit), E6 (indtræden af ​​HC differentiering), og E7 (i HC differentiering); og senere op til ~ E9 (slutningen af ​​HC differentiering). Denne elektroporering fremgangsmåde til genoverførsel er forbigående varig ca. ~ 4 dage, becauSE generne af interesse ikke integreres i genomet, men metoden er anvendelig til brug med passende plasmid DNA-baserede ekspressionsvektorer, som har evnen til at integrere i genomet, såsom Tol2 genoverførsel 11. Med denne metode robust GFP eller RFP udtryk varer ~ 4 dage i cochlea, hvorefter peger signalerne fade, men giver en rigelig tid vindue til at studere den indviklede udvikling af det auditive orgel. Dette in ovo genoverførselsfremgangsmåde er ny og giver mulighed for specifikt at målrette den formodede auditive orgel ved E4, som er optimal for undersøgelser, der fokuserer på HC udvikling i det auditive orgel. Det er en god tilføjelse til alternative metoder, der elektroporere på langt yngre udviklingsstadier 11,12 eller i forhold til brugen af in vitro basilar papiller eksplantatkulturer 18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Æggene og uklækkede embryoner bliver passet og behandlet etisk og humant. Alle protokoller for uklækkede embryo brug blev godkendt af Animal Care og brug Udvalg på Johns Hopkins School of Medicine, Baltimore, Maryland.

1. Æg og Udarbejdelse af ekspressionskonstruktioner

  1. Æg:
    1. Der inkuberes 3 - 4 dusin befrugtede hønseæg (Gallus gallus), der ligger fladt på deres sider ved 37 ° C.
      1. Efter 24 timers inkubation, træk 3 cc af æggehvidestof med en sprøjte fra den runde bagenden af ​​ægget og forsegle hullet med gennemsigtig tape. Dette skaber et luftkammer mellem foster og æggeskallen, der giver mulighed for nem adgang til foster uden fosteret stikning til skallen ved skæring af vinduet for at få adgang på toppen af ægget 19.
      2. Ved 117 timers af inkubationstid, iscenesætte embryoner i henhold til Hamburger og Hamilton 20 udviklingsstadierpå E4 (HH24-25) (se figur 1D).
  2. Expression Konstruerer:
    1. Forbered plasmid-DNA'et under anvendelse af reagenser og protokollen tilvejebragt af producenten af ​​et kommercielt tilgængeligt præparat kit. På det sidste trin i fremstillingen, eluering af DNA'et i 500 pi TE (Tris-EDTA) buffer tilvejebragt i sættet i et 1,5 ml rør.
    2. Ethanol udfælde DNA for at koncentrere det ved tilsætning af 50 pi 3 M natriumacetat og 1 ml 100% ethanol til røret. Glasset anbringes ved -20 ° CO / N.
    3. Centrifugeres i 30 minutter ved 14.000 rpm ved 4 ° C. Fjern supernatanten og lufttørre pelleten i 10 minutter ved stuetemperatur. Pellet opløses i 15 pi TE-buffer, som skal give en koncentration på ~ 4 pg / pl.
      BEMÆRK: kontrol ekspressionskonstrukter anvendt her, er PME'er-IRES-GFP 10, som drives af en kylling β-actinpromotoren, eller PCI-H2B-IRES-RFP CMV-promotoren.

2. Chicken in ovo Micro-elektroporering og in ovo celleproliferationsassay

  1. I Ovo Micro-injektion af Expression Construct og Micro-elektroporation:
    1. Træk glas kapillarrør i fine nåle ved hjælp af en mikro-pipette aftrækker med følgende optimerede parametre for en 2,5 x 2,5 mm Box Platinum Opvarmning Filament: Pressure = 500, Heat = 600 ° C, Pull = 64, Velocity = 105, og Time = 150 msek (se tabel 1).
    2. Opsæt venstre og højre udleveres mikro-manipulator etaper flankerer mikroskop (se figur 1A). The Right-handed mikro-manipulator holder glas kapillar nålen og venstrehåndet mikro-manipulator holder elektroderne (figur 1A).
    3. Forbered fint trukket glas kapillar nål til mikro-injektion ved at skærespidsen af ​​nålen med en pincet under arbejdet under mikroskopet.
    4. Kanylen fyldes manuelt med hånden under anvendelse af mikro-manipulator med 2,5 pi plasmid-DNA tonet med 0,1% Fast Green, mens de arbejder under mikroskopet.
    5. Placer ægget liggende på siden i en støbeform / æg holdeindretning (se figur 1A). Skær et rundt vindue på toppen af ægget med en saks 19 (figur 1A).
    6. Mens han arbejdede under mikroskop, forsigtigt åbne to membraner overliggende foster med pincet.
    7. Mens han arbejdede under mikroskop, levere ca. ~ 0,5 ul plasmid-DNA til de rigtige øre- vesikel lumen ved mikro-injektion manuelt ved hjælp af højre hånd ved hjælp af mikro-manipulator og ved mikro-elektroporation.
      1. For at gøre dette, mikro-injicere de rigtige øre- vesikel lumen med DNA med den højre hånd mikro-manipulator (Figur 1B-D), mens på samme tid ved hjælp af venstre Holdinga forcep til steady lederen af ​​fosteret, fordi lederen af ​​embryo dips på scenen E4. Må ikke mikro-injicere forbi øre- vesikel lumen, da dette vil beskadige otisk vesikel.
      2. Umiddelbart efter mikro-injektion, mens du arbejder under mikroskopet, skal du bruge venstre hånd mikro-manipulator til at placere den positive (anode) 2 mm platin elektrode anterior-ventral til højre otisk vesikel og den negative 2 mm elektrode (katode) parallelt 1 mm fra hinanden (se figur 1 C). Lever 4 pulser på 12 V med 100 ms varighed og 200 ms mellemrum. Den venstre otisk vesikel tjener som en intern ubehandlet kontrol.
        BEMÆRK: Rens elektroderne i mellem elektroporeringer med en vatpind dyppet i 1x PBS.
  2. In ovo celleproliferationsassay:
    1. Umiddelbart efter elektroporation tilsættes 50 ul på 0,25 mg / ml Edu i 1x PBS ved manuelt at tabe 50 pi Edu opløsningen på heleembryo in ovo under anvendelse af en pipette. Forsegl æggene med tape og vende tilbage til inkubatoren i 18 - 96 timer.
    2. Fjern forsigtigt tapen og kontrollere embryoner til fluorescerende GFP eller RFP signal i otisk vesikel efter 18-24 timers brug af en standard fluorescerende mikroskop (se figur 1 EE "). Hvis fluorescerende signal er til stede, på dette tidspunkt høste embryoner til analyser eller forsegle med tape og returnere det til inkubatoren til høst og analyser på senere stadier (se figur 1 FP '').
      BEMÆRK: Ekspression af GFP signal med det PME'er-IRES-GFP-konstruktion er indlysende 6 - 7 timer efter elektroporering 10.

3. Embryo Høst og Tissue Behandling for RNA in situ hybridisering og Immunhistokemi

  1. Høst embryoner ved anvendelse af pincetter. Skyl embryo i koldt 1x PBS. Fjern lederne af de embryoner, ved at skære hovedet af sin halsmed pincet, og placere lederne i 4% paraformaldehyd O / N ved 4 ° C. Punktere hjernen under anvendelse af en forcep at tillade penetration af 4% paraformaldehyd inde i hovedet.
  2. Dehydrere hovederne i 30% sucrose (i 1x PBS) O / N ved 4 ° C.
  3. Monter lederne i kryobeskyttelsesmedium ved hurtig frysning i en opslæmning af tøris og methylbutan (2-methylbutan). Alternativt hurtig fryse hovederne i kryobeskyttelsesmedium med flydende nitrogen. Opbevar de monterede hoveder ved -80 ° C.
  4. Kryosektion hovederne i 12 um tykke vævssnit og indsamle alle de indre øre-holdige vævssnit onto superfrosted mikroskop objektglas.
  5. Udfør standard RNA in situ hybridisering og immunhistokemi som tidligere beskrevet 4,21, og analysere for edu celleproliferation efter protokollen tilvejebragt af producenten af kittet.
    BEMÆRK: Hår celler kan identificeres under anvendelse af kanin polyklonale α-MyosinVIIa (Myo7a) entibody (1: 1,000, Proteus Biosciences) og fluorescens-mærket sekundært antistof (1: 250, gede-anti-kanin AlexaFluor 488; Invitrogen).

4. Billedoverførsel og Processing

  1. Tag billeder med udstyr til digital billedbehandling. Billede immunhistokemi resultater med en standard fluorescerende mikroskop og resultaterne af in situ ved hjælp af en standard bredt felt mikroskop (fra 5x til 40x i forstørrelse).
  2. Behandle billeder ved hjælp af billedbehandling software.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I denne fremgangsmåde papir plasmid DNA bestående af grønt fluorescerende protein (GFP) ekspressionskassetter blev målrettet til at udvikle kylling basilar papilla (BP) med optimerede parametre for 12 V og 4 impulser med 100 ms pulsvarighed og intervaller på 200 ms, hvilket gav en ~ 50% embryo overlevelsesrate og effektiviteten af ​​plasmid-DNA målretning ind i BP. Fluorescerende billeddannelse af nativt GFP-ekspression i udviklingen embryoer viste denne metode til elektroporering fortrinsvis målretter anterior-ventrale aspekt af otocyst, der giver anledning til BP (figur 1 EE «hvid pil) og GFP-ekspression kan følges over et tidsforløb på op til ca. ~ 4 dage (Figur 1 EH). RNA in situ hybridisering (ISH) blev anvendt til at bestemme, om elektroporering lykkedes at målrette auditive del af den udviklende indre øre. For at bestemme om GFP blev taget op af auditivesensoriske progenitorer, udførtes ISH eksperimenter på tilstødende BP sektioner. Inden udviklingslandene BP sensoriske forfædre blev identificeret ved deres udtryk for Sox2 (figur 1 K og N) og Lunatic frynser (Lfng) (Figur 1 J). Disse eksperimenter viser, at sensoriske stamfædre hele udvikler BP, som vist for basen (Figur 1 I; sort beslag) og toppunktet (figur 1 L, sort beslag), lykkedes målrettet og udtrykke GFP efter 68 timers af elektroporation (Figur 1 I og L, sort parentes). Desuden blev GFP udtrykt uden den sensoriske domæne i ikke-sensoriske epithelceller (fig 1 I og L, røde pile) og i den auditive ganglion (Figur 1I og l; ag, gule pile) mærket med Neurod1 ekspression (figur 1 M) . I et typisk eksperiment GFP (figur 1 H); dette tillader investigator at analysere den rumlige og tidsmæssige mønster af sensorisk progenitorcelle-cycle tilbagetrækning og differentiering i udviklingslandene BP. For at bestemme den proliferative adfærd sensoriske progenitorer blev thymidinanalog edu tilsat på tidspunktet for elektroporation ved E4. Fire dage senere blev Edu inkorporering i udviklingslandene BP analyseres i vævssnit ved hjælp af "klik" kemi. Immuno-mærkning for HC-specifikke protein MyosinVIIa (Myo7a) blev anvendt til at identificere differentierende HC i udviklingslandene BP. I den apikale del af BP Myo7a + HC var ofte edu + (Figur 1 PP ', P' ', hvide pile), mens kun få Myo7a + HC i bunden havde indarbejdet Edu (figur 1 OO «O' ', hvide pile), hvilket antyder, at på tidspunktet for edu tilsætning ved E4, sensorisk progenitors i bunden er allerede i vid udstrækning skrive mitotiske. Disse resultater bekræfter tidligere undersøgelser af modsatrettede gradienter af celle-cyklus exit og HC differentiering i chick BP 6,7.

figur 1
Figur 1. in ovo Elektroporation & in ovo-celleproliferationsassay. (AD) lysfelt billeder af elektroporeringsmetoden. In ovo mikro-injektion i højre otisk vesikel (B) og placering af elektroder efter mikroinjektion målrettet anterior-ventrale område den otisk vesikel (C). Embryo på scenen HH24-25 efter mikro-injektion og elektroporation (D, grøn otisk vesikel, sort pil). (EH) grønt fluorescerende protein (GFP) ekspression efter elektroporering. ( (E ') GFP udtryk ved 18 timer (otisk vesikel, hvid pil). (FH) Hvide pile peger på GFP-ekspression ved 40 timer (F, otisk vesikel), 68 timer (G, BP), og ved 88 timer (H, BP). (IN) Tilstødende cochlear væv-dele af BP undersøgt for GFP, Lfng, Sox2, og Neurod1 udskrifter af RNA in situ hybridisering ved 68 timer. Lfng (J, sort beslag) og Sox2 (K og N, sort beslag) markerer sensoriske epithel og Neurod1 (M) markerer den auditive ganglion (ag). GFP udtrykkes inden sensorisk (i og L, sort beslag) og ikke-sensoriske væv (i og L, røde pile), og enuditory ganglion (I og L, gule pile). (OP '') Fluorescerende billeder af MyosinVIIa (Myo7a) / edu mærkning. (O'-O '' og p'-P '') Højere forstørrelser af O og P. (O 'og P') Mere edu mærkning er til stede i sensoriske epithel ved spidsen (P ', hvid beslag) end ved bunden (O', hvid beslag). O '' og P '') Merged fluorescerende billeder, hvide pile peger på Myo7a (+) / edu (+) hårceller ved toppunktet (P '') og bunden (O ''). Flere edu (+) celler er til stede inden den auditive ganglion ved spidsen (P, ag) end ved bunden (O, ag). (sac; saccule i O). (A, Anterior og V, bug- i paneler B ogE). Scale bars 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den her beskrevne fremgangsmåde til in ovo mikro-elektroporering er optimeret til genoverførsel til det udviklende auditive orgel. Den er kompatibel med plasmid DNA-baserede ekspressionsvektorer, der typisk anvendes til at manipulere genfunktion / ekspression. Timingen af ​​elektroporation ved E4 er optimal for undersøgelser, der fokuserer på HC udvikling i det auditive orgel. De mest kritiske trin er mikro-injektion af DNA i øre- vesikel lumen uden at gå for dybt med nålen og beskadige otiske vesikel (se fig. 1A-D), målretning af DNA'et i anterior-ventrale domæne af otisk vesikel af placere elektroderne i overensstemmelse hermed (se fig 1C.), og levere de optimerede elektroporation parametre for 4 impulser ved 12 V. Disse er optimeret elektroporation parametre og optimeret koncentration af plasmid-DNA (~ 3.5 - 4 pg / pl) for specifikt at målrette den formodede auditive orgel på E4. Oprindeligt startede vi out ledende elektroporeringer på 6 V, hvilket gav ingen fluorescerende signaler. Spændingen blev trinvist forøges ved anvendelse 8 V og 10 V, med at være optimal 12 V. Tilsvarende er antallet af pulser levere og pulsvarigheder og afstanden mellem pulser blev optimeret. Ved 12 V, 4 pulser med 100 ms varighed og 200 ms afstand er ideel. Disse parametre er ikke blot velegnet til opnåelse effektiv genoverførsel i E4, men er også ideelle til et foster overlevelsesrate på ca. ~ 50%. Hvis der ikke opnås fluorescerende signal inden 24 timer af elektroporation, bør overvejes følgende: 1.) Sørg for, at plasmid DNA-koncentrationen er mindst 3,5 pg / pl. 2.) Juster elektroporation parameter ved 2 V, for eksempel til 10 eller 14 V. Med hensyn til opnåelse af E4 (HH24-25) embryoer inden 117 timer af inkubationstiden (se fig. 1D), inkubatoren temperatur i Æggene optimeres between 37 ° - 39 ° C med flere eller færre timers INCUbation nødvendige tid end 117 timers afhængig af temperaturen anvendte, fordi der er variationer i besiddelse og kører temperaturer ved hjælp af forskellige inkubatorer blandt forskellige laboratorier. Forskellige thymidinanaloger herunder BrdU (5-brom-2'-deoxyuridin) eller edu kan anvendes til at studere in ovo celleproliferation. har imidlertid anvendelsen af ​​enten forbindelse, der skal optimeres for hver udviklingsstadiet som alt for meget af forbindelsen viser sig toksiske for celle / embryo levedygtighed og for lidt af forbindelsen viser sig ineffektiv. Denne metode beskriver optimeret anvendelse af edu ved en koncentration på 0,25 mg / ml påført som 50 pi onto hele embryo in ovo specielt til at studere celleproliferation og celle-cyklus-udgang fra E4 fremefter.

In ovo elektroporering som en metode til genmanipulation har visse begrænsninger. Der kræves en relativt stort antal æg til elektroporeringer på E4 med egnede kontrolforanstaltninger konstruktioner og for Experimental forhold. Dette skyldes en andel af æg, ca. ~ 27%, bliver ubrugelig til elektroporering skyldes en kombination af mangel på befrugtning, udviklingsmæssige defekter, og embryonale død. En anden vigtig faktor at overveje er overlevelsesraten for de embryoner efter elektroporering. Overlevelsesraten er ca. ~ 50%. Dette skyldes det faktum, at ældre embryoner i E4 ikke overleve godt efter at være blevet manipuleret; yngre embryoner er mere modstandsdygtige og tåle at blive manipuleret bedre. Udtryk for generne af interesse efter elektroporation ved E4 er omdrejningspunkt og lokaliseret i hele cochlear kanalen herunder ikke-sensorisk og sensoriske væv samt det auditive ganglion. Årsagen til den mere fokal og lokaliserede ekspression er fordi målet for elektroporering er den formodede, uudviklede høreorgan på E4, før kyllingen høreorgan begynder at vokse ud på E5 og forlænges ind i sin karakteristiske seglformede form ved ~ E9 1 . Endelig the metode er forbigående hvor ekspressionssignaler kun forblive i ~ 4 dage, fordi generne af interesse her anvendte ikke integreres i genomet. Imidlertid kan fremgangsmåden anvendes med passende plasmid-baserede ekspressionskonstruktioner, der har evnen til at integrere i genomet.

Mastering elektroporation metode kræver lidt øvelse, trænede øjne og hænder, og ekspertise i at arbejde med kylling embryoner. Referencerne fastsatte indre øre udvikling og kylling udviklingsmæssige atlas tjene som gode vejledninger og er gode udgangspunkter for en nybegynder. Efter mastering fremgangsmåden med disse optimerede elektroporation parametre kan fremgangsmåden anvendes til manipulationer i lukket otisk vesikel fra E2 til ~ E4.5. Selv for elektroporering på E2 og E3, 10 V bør i stedet bruges på 12 V. For elektroporation på E1 målrette otiske placode og otisk kop, tilpassede platinelektroder med modificerede elektroporation parametre kan bruges 8-10. Ud over at studere udviklingen af ​​den auditive organ denne fremgangsmåde egner sig også til at studere udviklingen af ​​innerverer auditive ganglion. Analyse af GFP-ekspression i elektroporerede prøver viste, at målrette specifikt anterior-ventrale otisk vesikel ikke kun retter sig mod den sensoriske domæne i neurale-sensorisk kompetent (NSD) epitel men også rettet mod den neuronale befolkningen, der bor inden for NSD. Afferente neuroner innerverer de vestibulære og auditive sensoriske organer er primært af otisk placodal oprindelse. Neurogenese sker over en langvarig tidsperiode fra ca. ~ E1.5 - E4.5 i chick, hvor neuroblaster, der undergår intens celleproliferation kontinuerligt delaminere fra NSD epitel otiske kop (~ E1.5) og otisk vesikel (~ E2.5 - E4.5) og befolker som differentierende neuroner cochlear-vestibulære ganglion (CVG; VIII kranienerver) 8,10,13,22.

Desuden med visse modifikationer vestibulære organer kan målrettes med den metode præsenteres. For eksempel kan den formodede forreste crista målrettes på E3, som ligger på den dorsale forreste spids af anterior-ventrale NSD 9. Elektroporering ved E4 målretning anterior-ventrale otiske vesikel udbytter fokal alligevel robust GFP transcript udtryk inden sensorisk og ikke-sensoriske væv i alle de sensoriske vestibulære organer, nemlig cristae, og utricluar og Sækformet maculae (data ikke vist).

Det konkluderes, at in ovo metode præsenteret her er specifik for udførelse forstærkningsudjævnet og tab af funktioner starter ved E4 og til undersøgelse proliferation og differentiering i udviklingslandene kylling auditive orgel. Desuden kan denne fremgangsmåde let tilpasses til at studere andre iner øre udviklingsmæssige fænomener, herunder indre øre neurogenese og udvikling af vestibulære organer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Doris K. Wu for ekspressionsplasmider og in situ-sonder, Johns Hopkins University Center for Sanse Biologi imaging facilitet og Center for Hørelse og Balance. Dette arbejde blev støttet af NIDCD Grant T32 DC000023 til LE

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile 1x PBS pH 7.4 gibco 10010-023
Fast Green FCF Powder Sigma F7252-5G
EdU Powder Invitrogen E10187
Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit Invitrogen C10338
HiSpeed Plasmid Midi Kit (25) Qiagen 12643
ECM 830 ElectroSquarePorator  BTX Harvard Apparatus
Banana to Micrograbber Cable Kit BTX Harvard Apparatus 45-0216
Right Handed & Left Handed Micromanipulators World Precision Instruments Inc.  M3301R & M3301L
Two 12 mm Magnetic Holding Device Stages with 7 inch vertical posts World Precision Instruments Inc.  M10
Metal Steel Base Plate 12x24 inch World Precision Instruments Inc.  5479
Scissors for Eggs 12 cm long curved, 12 mm extrafine blades; Spring Scissors World Precision Instruments Inc.  14120
Micropippette Puller for pulling needles Sutter Instrument Co. P-97
2.5x2.5 mm Box Platinum Heating Filament Sutter Instrument Co.
Glass Capillary Tubes/Needles/No Fiber/Borosil 1 mm FHC 27-30-0
Hamilton Glass Syringe 100 μl Hamilton 80601 Model 710LT
Mineral Oil (Heavy) for Hamilton Glass Syringe Fisher Scientific O122-1
Polyethylene Tubing for connecting the Glass Syringe and Glass Cappillary Needles/ Non Toxic Becton Dickinson and Company (BD) 427420 Intramedic Clay Adams Brand
3 cc Disposable Syringes Becton Dickinson and Company (BD) 309657
Disposable 21 Gauge Needles Becton Dickinson and Company (BD) 305122
One pair of 2 mm Platinum Electrodes Bulldog Bio. / Nepagene CUY611P3-2
Electrode Holder Bulldog Bio. / Nepagene CUY580
One pair of Dumont fine forceps number 5 Fine Science Tools (FST)
Matte finish invisible tape for sealing eggs Office Depot 520-928
Cotton-Tipped Swabs Fisher Scientific 23-400-101
Sterile filter tips

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken. The Journal of comparative neurology. 368, 620-630 (1996).
  2. Cantos, R., Cole, L. K., Acampora, D., Simeone, A., Wu, D. K. Patterning of the mammalian cochlea. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 11707-11713 (2000).
  3. Whitfield, T. T. Development of the inner ear. Current opinion in genetics & development. 32, 112-118 (2015).
  4. Raft, S., et al. Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development. Development. 134, 4405-4415 (2007).
  5. Satoh, T., Fekete, D. M. Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear. Development. 132, 1687-1697 (2005).
  6. Katayama, A., Corwin, J. T. Cell production in the chicken cochlea. The Journal of comparative neurology. 281, 129-135 (1989).
  7. Cotanche, D. A., Sulik, K. K. The development of stereociliary bundles in the cochlear duct of chick embryos. Brain Res. 318, 181-193 (1984).
  8. Alsina, B., et al. FGF signaling is required for determination of otic neuroblasts in the chick embryo. Developmental biology. 267, 119-134 (2004).
  9. Chang, W., et al. Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements. PLoS genetics. 4, e1000050 (2008).
  10. Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3879-3890 (2013).
  11. Freeman, S., Chrysostomou, E., Kawakami, K., Takahashi, Y., Daudet, N. Tol2-mediated gene transfer and in ovo electroporation of the otic placode: a powerful and versatile approach for investigating embryonic development and regeneration of the chicken inner ear. Methods in molecular biology. 916, 127-139 (2012).
  12. Kamaid, A., Neves, J., Giraldez, F. Id gene regulation and function in the prosensory domains of the chicken inner ear: a link between Bmp signaling and Atoh1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 11426-11434 (2010).
  13. Neves, J., Kamaid, A., Alsina, B., Giraldez, F. Differential expression of Sox2 and Sox3 in neuronal and sensory progenitors of the developing inner ear of the chick. The Journal of comparative neurology. 503, 487-500 (2007).
  14. Neves, J., Uchikawa, M., Bigas, A., Giraldez, F. The prosensory function of Sox2 in the chicken inner ear relies on the direct regulation of Atoh1. PLoS One. 7, 30871 (2012).
  15. Das, R. M., et al. A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon. Developmental biology. 294, 554-563 (2006).
  16. Wu, C. Y., Hooper, R. M., Han, K., Taneyhill, L. A. Migratory neural crest cell alphaN-catenin impacts chick trigeminal ganglia formation. Developmental biology. 392, 295-307 (2014).
  17. Kumar, M. S., et al. Suppression of non-small cell lung tumor development by the let-7 microRNA family. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3903-3908 (2008).
  18. Jacques, B. E., Dabdoub, A., Kelley, M. W. Fgf signaling regulates development and transdifferentiation of hair cells and supporting cells in the basilar papilla. Hearing research. 289, 27-39 (2012).
  19. Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. Journal of visualized experiments: JoVE. e306 (2007).
  20. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of morphology. 88, 49-92 (1951).
  21. Oh, S. H., Johnson, R., Wu, D. K. Differential expression of bone morphogenetic proteins in the developing vestibular and auditory sensory organs. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 6463-6475 (1996).
  22. Bell, D., et al. Spatial and temporal segregation of auditory and vestibular neurons in the otic placode. Developmental biology. 322, 109-120 (2008).
Gene Transfer til kylling Auditory Organ med<em&gt; I Ovo</em&gt; Micro-elektroporation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation. J. Vis. Exp. (110), e53864, doi:10.3791/53864 (2016).More

Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation. J. Vis. Exp. (110), e53864, doi:10.3791/53864 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter