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Developmental Biology

Transfert de gènes dans l'organe de poulet Auditory par doi: 10.3791/53864 Published: April 17, 2016

Abstract

Embryons de poulet sont des systèmes modèles idéaux pour l' étude du développement embryonnaire manipulations de la fonction des gènes peuvent être effectuées avec une relative facilité in ovo. L'organe sensoriel auditif de l'oreille interne est essentiel pour notre capacité à entendre. Il abrite un épithélium hautement spécialisé sensorielle qui se compose de cellules ciliées mécano-transduction (CAH) et entourant gliales comme des cellules de soutien (SC). En dépit des différences structurelles dans les organes auditifs, les mécanismes moléculaires qui régulent le développement de l'organe auditif sont évolutivement conservées entre mammifères et aves Dans électroporation ovo est en grande partie limitée aux premiers stades de E1 -. E3. En raison du développement tardif relatif de l'organe auditif à E5, les manipulations de l'organe auditif par électroporation ovo passé E3 sont difficiles en raison du développement avancé de l'embryon de poulet aux stades ultérieurs. La méthode présentée ici est une méthode de transfert de gène transitoire pour le ciblage de gènes d'intérêt àétape E4 - E4.5 dans l'organe sensoriel auditif de poulet en développement par l' intermédiaire d' in ovo micro-électroporation. Cette méthode est applicable à intensité forte et perte de fonctions avec le plasmide classique des vecteurs d'expression à base d' ADN et peut être combiné avec dans un essai de prolifération cellulaire in ovo en y ajoutant EdU (5-éthynyl-2'-désoxyuridine) pour l'ensemble de l' embryon au le temps de l'électroporation. L'utilisation de la protéine fluorescente verte ou rouge (GFP ou RFP) plasmides d'expression permet à l'expérimentateur de déterminer rapidement si le succès électroporation ciblé la partie auditive de l'oreille interne en développement. Dans cette méthode papier, des exemples représentatifs des spécimens de GFP électroporation sont illustrés; les embryons ont été récoltées 18-96 heures après l' électroporation et le ciblage de la GFP dans la région pro-sensorielle de l'organe auditif a été confirmée par hybridation d' ARN in situ. Le document de la méthode fournit également un protocole optimisé pour l'utilisation de la thymidine analogique EdU pour analyser des cellules prolifration; un exemple d'un essai de prolifération cellulaire sur la base EdU qui combine l'immuno-marquage et cliquer sur le EdU chimie est fourni.

Introduction

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En dépit des différences dans la morphologie et la structuration cellulaire entre le mammifère et l' organe sensoriel auditif aviaire, les facteurs moléculaires et les voies responsables du développement de HC sensorielle sont pensés pour être évolutivement conservée 1-3. La papille basilaire, qui abrite le HCS auditifs et leurs SCs environnantes, se développe comme un outpocketing du otocyste de l'oreille interne. Au début d'une piscine de progéniteurs HC et SC est spécifié dans le / otique domaine compétente tasse neuronal-sensorielle placode otique (NSD). Les données cartographiques destin montrent que les lignées de neurones sensoriels et sont liés et découlent de la NSD située dans la région antéro-ventrale de la coupelle ou otique otocyste chez les souris et les poulets 4,5. Tout d'abord, les neuroblastes délaminage de la NSD pour donner naissance à des neurones du ganglion auditif-vestibulaire, qui a finalement divisé en ganglion auditive et vestibulaire. Ces neurones innervent les CAH sensorielles de l'oreille interne et des noyaux du tronc cérébral. Les cellules ièmeà rester dans le NSD sont pensés pour donner lieu à divers patchs sensoriels, y compris l'organe sensoriel auditif, composé des CAH sensorielles mécano-transduction et leurs SCs associés.

Dans les deux le poussin et murin, progéniteur sensorielle sortie du cycle cellulaire organe auditif et la différenciation HC se produisent dans des gradients opposés. Dans poussin, la sortie du cycle cellulaire progéniteur auditif commence autour ~ E5 et progresse depuis la base jusqu'au sommet, et du centre vers la périphérie 6. Un jour plus tard, la différenciation HC commence au sommet et avance vers la base 7. L' étude du développement de l'oreille interne chez le poulet présente de nombreux avantages techniques des mécanismes fonctionnels peuvent être étudiés avec une relative facilité in ovo , par opposition à la manipulation d' embryons in utero dans d' autres systèmes modèles, ce qui nécessite des chirurgies complexes. La méthode décrite ici utilise en micro-électroporation ovo pour cibler des gènes d'intérêt dans le Basila présomptifr zone papille antéro-ventral dans la vésicule otique spécifiquement à E4.

Électroporation in ovo est une technique qui est bien établie et couramment utilisé 8-14. Le principe de la technique d'électroporation est basée sur le fait que les nucléotides (par exemple, ADN plasmidique, l' ADN synthétique, l' ARN ou des oligonucléotides) sont chargées négativement. L'ADN est injecté dans le tissu d'intérêt. Lorsqu'un courant électrique est placé à travers le tissu, le courant transitoire ouvre les pores dans les parois cellulaires et permet l'absorption de l'ADN, sous forme de flux de l'ADN chargé négativement vers l'électrode positive (anode). Pour des expériences de gain de fonction, les gènes d'intérêt sont généralement sous-clonés dans des plasmides d'expression qui contiennent des cassettes d'expression appropriés pour la protéine fluorescente verte (GFP) ou la protéine fluorescente rouge (RFP). Pour la perte de fonction des expériences dominantes des constructions à base de plasmide négatif répresseurs ou ARNi ou constructions morpholino sont commonly utilisé 15,16. Pour inhiber microARN (miARN) miARN fonction d' assemblage d'épongé, qui sont généralement à base de plasmide, peut être utilisé 17. La méthode décrite ici permet d'enquêter sur les mécanismes moléculaires qui contrôlent la prolifération et la différenciation dans l'organe auditif, comme dans la méthode micro-électroporation ovo peut être facilement combiné avec dans le dosage de prolifération cellulaire ovo en ajoutant EdU à l'ensemble de l' embryon.

L'électroporation et l'addition de EdU est effectuée à E4 dans la vésicule otique, qui est un jour avant le début de la sortie du cycle cellulaire dans l'organe auditif. L'analyse de l'organe auditif est généralement effectuée 18-96 heures après électroporation à E5 (début de sortie du cycle cellulaire progéniteur sensorielle), E6 (début de la différenciation HC) et E7 (lors de la différenciation HC); et plus tard jusqu'à ~ E9 (fin de la différenciation des HC). Cette méthode d'électroporation de transfert de gènes est transitoire d'une durée approximative ~ 4 jours, because les gènes d'intérêt ne pas intégrer dans le génome, mais la méthode est applicable pour une utilisation avec le plasmide approprié des vecteurs d'expression à base d' ADN, qui ont la capacité d'intégrer dans le génome, comme le transfert de gène Tol2 médiée 11. Avec cette méthode de GFP robuste ou une expression RFP dure ~ 4 jours dans la cochlée, après quoi les signaux pointent fanent, mais fournissent une fenêtre de temps suffisant pour étudier le développement complexe de l'organe auditif. Cette in ovo méthode de transfert de gènes est nouveau et permet de cibler spécifiquement l'organe auditif présomptif à E4, qui est optimal pour les enquêtes qui mettent l' accent sur ​​le développement de HC dans l'organe auditif. Il est un bon ajout à d' autres méthodes, qui électroporation à des stades de développement beaucoup plus jeunes ou 11,12 par rapport à l'utilisation de cultures in vitro d'explants de papilles basilaire 18.

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Protocol

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Les œufs et les embryons non éclos sont soignés et traités de façon éthique et humainement. Tous les protocoles pour l'utilisation d'embryons non éclos ont été approuvés par le soin des animaux et l'utilisation Comité à la Johns Hopkins School of Medicine, Baltimore, Maryland.

1. Les œufs et la préparation de constructions d'expression

  1. Des œufs:
    1. Incuber 3 - 4 douzaine oeufs fécondés de poulet (Gallus gallus) à plat sur ​​leurs côtés à 37 ° C.
      1. Après 24 heures d'incubation, tirez 3 cc de l'albumine avec une seringue de l'extrémité ronde arrière de l'œuf et sceller le trou avec du ruban adhésif transparent. Cela crée une chambre d'air entre l'embryon et la coquille, ce qui permet la facilité d'accès à l'embryon sans l'embryon coller à la coque lors de la coupe de la fenêtre d'accès au - dessus de l'œuf 19.
      2. A 117 heures de temps d'incubation, le stade des embryons en fonction de Hamburger et Hamilton 20 stades de développementà E4 (HH24-25) (voir la figure 1D).
  2. Expression Construit:
    1. Préparer l'ADN plasmidique en utilisant des réactifs et le protocole fourni par le fabricant d'un kit de préparation disponible dans le commerce. Lors de l'étape finale de la préparation, éluer l'ADN dans 500 ul de TE (Tris-EDTA), le tampon fourni dans le kit dans un tube de 1,5 ml.
    2. Éthanol précipite l'ADN à concentrer en ajoutant 50 ul de 3 M d'acétate de sodium et 1 ml d'éthanol à 100% dans le tube. Placer le tube à -20 ° CO / N.
    3. Centrifuger le tube pendant 30 min à 14000 rpm à 4 ° C. Retirer le surnageant et sécher à l'air le culot pendant 10 min à température ambiante. Dissoudre le culot dans un tampon TE 15 pi, ce qui devrait conduire à une concentration de ~ 4 pg / pl.
      REMARQUE: Les constructions d'expression de contrôle utilisés ici sont PMES-IRES-GFP 10 qui est entraînée par un promoteur β-actine de poulet ou pCI-H2B-IRES-DP CMV.

2. Poulet En Ovo Micro-électroporation et In Ovo Cell Proliferation Assay

  1. Dans Ovo Micro-injection d'expression Construct et Micro-électroporation:
    1. Tirez sur les tubes capillaires de verre en fines aiguilles à l'aide d'un extracteur micro-pipette avec les paramètres optimisés suivants pour un 2,5 x 2,5 mm Box Platinum Chauffage Filament: Pression = 500, Chaleur = 600 ° C, Pull = 64, vitesse = 105, et le temps = 150 msec (voir le tableau 1).
    2. Mettre en place la gauche et les étapes micro-manipulateur droitier flanquant le microscope (voir la figure 1A). Le micro-manipulateur Adroit tient l'aiguille capillaire en verre et le micro-manipulateur Gauche maintient les électrodes (figure 1A).
    3. Préparer l'aiguille capillaire en verre finement tiré pour la micro-injection par découpagela pointe de l'aiguille avec une pince tout en travaillant sous le microscope.
    4. Remplissez l'aiguille manuellement par la main en utilisant le micro-manipulateur avec 2,5 ul d'ADN plasmidique teintées avec 0,1% Fast Green tout en travaillant sous le microscope.
    5. Placez l'oeuf couché sur le côté dans un dispositif de retenue moule / oeuf (voir la figure 1A). Couper une fenêtre ronde au - dessus de l'œuf à l' aide de ciseaux 19 (figure 1A).
    6. Tout en travaillant sous le microscope, ouvrir avec précaution les deux membranes recouvrant l'embryon en utilisant une pince.
    7. Tout en travaillant sous le microscope, livrer environ ~ 0,5 ul d'ADN plasmidique à la bonne lumière des vésicules otiques par micro-injection manuellement à l'aide de la main droite en utilisant le micro-manipulateur et par micro-électroporation.
      1. Pour ce faire, micro-injecter les bonnes lumière des vésicules otiques avec l'ADN avec le bouton droit de la main micro-manipulateur (figure 1B-D) , tandis que dans le même temps en utilisant le holdin de la main gauchega forcep pour stabiliser la tête de l'embryon, parce que la tête de l'embryon plonge à l'étape E4. Ne pas micro-injection passé la lumière des vésicules otiques, parce que cela va endommager la vésicule otique.
      2. Immédiatement après la micro-injection, tout en travaillant sous le microscope, utilisez le micro-manipulateur à gauche pour placer le positif (anode) 2 mm électrode de platine antéro-ventrale à la vésicule otique droite et l'électrode négative de 2 mm (cathode) en parallèle 1 mm d' intervalle (voir la figure 1 C). Livrer 4 impulsions à 12 V avec 100 msec et 200 msec espacement. La vésicule otique gauche sert un témoin non traité interne.
        REMARQUE: Nettoyez les électrodes entre électroporations avec un tampon de coton-tige trempé dans du PBS 1x.
  2. En Ovo la prolifération des cellules de dosage:
    1. Immédiatement après l'électroporation ajouter 50 pl de 0,25 mg / ml dans PBS 1x EdU en abaissant manuellement la solution EdU 50 ul sur touteembryon in ovo à l' aide d' une pipette. Sceller les oeufs avec du ruban adhésif et de revenir à l'incubateur pour les 18 - 96 h.
    2. Retirez délicatement la bande et vérifier les embryons pour la GFP fluorescente ou signal de DP au sein de la vésicule otique après 18-24 h en utilisant un microscope à fluorescence standard (voir Figure 1 EE '). Si le signal fluorescent est présent, à ce stade , la récolte des embryons pour des analyses ou reboucher avec du ruban adhésif et le retourner à l'incubateur pour la récolte et des analyses à des stades ultérieurs (voir la figure 1 FP '').
      NOTE: L' expression du signal de GFP avec la construction PMEs-IRES-GFP est évident 6-7 heures après électroporation 10.

Récolte 3. Embryo et traitement des tissus pour l' ARN hybridation in situ et immunohistochimie

  1. Récolter les embryons en utilisant une pince. Rincer l'embryon dans 1x PBS froid. Retirez les têtes des embryons, en coupant la tête par son colen utilisant une pince, et placer les têtes dans 4% de paraformaldehyde O / N à 4 ° C. Piquer le cerveau en utilisant une pince pour permettre la pénétration du paraformaldéhyde 4% dans la tête.
  2. Déshydrater les têtes de saccharose à 30% (en 1x PBS) O / N à 4 ° C.
  3. Monter les têtes dans un milieu cryoprotecteur par congélation rapide dans une bouillie de glace sèche et méthylbutane (2-Methylbutane). Alternativement, rapide geler les têtes dans un milieu cryoprotecteur avec de l'azote liquide. Stocker les têtes montées à -80 ° C.
  4. Cryosection les têtes en 12 um coupes de tissus épais et de collecter toutes les coupes de tissus contenant l'oreille-interne sur des lames de verre de microscope superfrosted.
  5. Effectuer un ARN étalon hybridation in situ et immunohistochimie comme décrit précédemment 4,21 et analyser EdU pour la prolifération des cellules selon le protocole fourni par le fabricant du kit.
    REMARQUE: les cellules de cheveux peuvent être identifiés à l'aide de lapin polyclonaux α-MyosinVIIa (MYO7A) untibody (1: 1000, Proteus Biosciences) et un anticorps secondaire marqué par fluorescence (1: 250, chèvre anti-lapin AlexaFluor 488; Invitrogen).

4. Captage et traitement des images

  1. Prenez des photos avec des équipements d'imagerie numérique. Résultats image immunohistochimie avec un microscope et les résultats de l'in situ à l' aide d' un microscope grand champ standard (allant de 5x à 40x de grossissement) fluorescent standard.
  2. Traiter les images en utilisant un logiciel de traitement d'image.

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Representative Results

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Dans cet ADN méthode papier plasmidique constitué de la protéine fluorescente verte (GFP) des cassettes d'expression ont été ciblés dans le poulet en développement papille basilaire (BP) avec des paramètres optimisés de 12 V et 4 impulsions avec 100 durée d'impulsion msec et des intervalles de 200 ms, ce qui donne un ~ 50% le taux et l'efficacité du plasmide ADN-ciblage dans le BP survie des embryons. L' imagerie de fluorescence l' expression de GFP natif dans le développement des embryons a montré que cette méthode d'électroporation cible de préférence la face antéro-ventrale de la otocyste, qui donne lieu à la BP (figure 1 EE '; flèche blanche) et l' expression de GFP peut être suivie sur un décours temporel jusqu'à environ ~ 4 jours (Figure 1 EH). ARN hybridation in situ (ISH) en a été utilisé pour déterminer si l'électroporation avec succès ciblé la partie auditive de l'oreille interne en développement. Pour déterminer si la GFP a été repris par auditiveprogéniteurs sensorielles, des expériences de ISH ont été réalisées sur des sections adjacentes BP. Dans les progéniteurs sensorielles BP en développement ont été identifiés par leur expression de Sox2 (Figure 1 K et N) et frange Lunatic (Lfng) (Figure 1 J). Ces expériences démontrent que les progéniteurs sensorielles à travers le BP en développement, comme le montre la base (Figure 1 I; support noir) et le sommet (Figure 1 L; support noir), ont été ciblés et expriment la GFP après 68 h d'électroporation (Figure 1 I avec succès et L; crochets noirs). En outre, la GFP a été exprimée en dehors du domaine sensorielle dans les cellules épithéliales non sensorielles (Figure 1 I et L, les flèches rouges) et dans le ganglion auditif (figure 1I et L; ag flèches jaunes) marqué par l' expression NeuroD1 (figure 1M) . Dans une expérience typique GFP (Figure 1 H); cela permet à l'enquêteur d'analyser la répartition spatiale et temporelle de progéniteur sensorielle retrait du cycle cellulaire et la différenciation dans le BP en développement. Pour déterminer le comportement prolifératif des progéniteurs sensorielles, l'EdU thymidine analogique a été ajouté au moment de l'électroporation à E4. Quatre jours plus tard, EdU incorporation dans le BP en développement a été analysée dans des coupes de tissus en utilisant "cliquez sur" la chimie. Immuno-étiquetage pour la protéine spécifique HC MyosinVIIa (MYO7A) a été utilisé pour identifier les CAH différenciateurs dans le BP en développement. Dans la partie apicale de la BP MYO7A + CAH étaient souvent EdU + (Figure 1 PP '; P' ', flèches blanches), alors que dans la base seulement quelques MYO7A + CAH avaient incorporé EdU (Figure 1 OO'; O '', flèches blanches), ce qui suggère que, au moment de l'addition EdU à E4, pro sensoriellegéniteurs dans la base sont déjà largement poster mitotique. Ces résultats confirment les études précédentes de gradients de sortie du cycle cellulaire et la différenciation HC adverse dans le poussin BP 6,7.

Figure 1
Figure 1. En électroporation Ovo & In Ovo cellulaire Essai de prolifération. (AD) images fond clair de la méthode d'électroporation. En micro-injection in ovo dans la vésicule droite otique (B) et le placement des électrodes après micro-injection ciblant la région antéro-ventrale la vésicule otique (C). Embryon au stade HH24-25 après micro-injection et l' électroporation (D; vésicule otique vert, flèche noire). (EH) la protéine fluorescente verte (GFP) expression après l' électroporation. ( (E ') d'expression de la GFP à 18 h (vésiculaire otique, flèche blanche). (FH) Les flèches blanches indiquent l' expression de GFP à 40 h (F, vésicule otique), 68 h (G, BP), et à 88 h (H, BP). Tissu-sections cochléaires (IN) adjacentes de la BP sondé pour la GFP, les transcriptions Lfng, Sox2 et NEUROD1 par hybridation d' ARN in situ à 68 h. Lfng (J, support noir) et Sox2 (K et N, support noir) marquent la épithélium sensoriel et NeuroD1 (M) marque le ganglion auditive (ag). GFP est exprimé à l'intérieur sensoriel (I et l, un support noir) et un tissu non-sensoriel (I et l, les flèches rouges) et l'unganglion uditory (I et L, flèches jaunes). (OP '') des images fluorescentes de MyosinVIIa (MYO7A) / EdU étiquetage. (O'-O '' et P'-P '') grossissements plus élevés de O et P. (O 'et P') Plus EdU étiquetage est présent au sein de l'épithélium sensoriel au sommet (P ', support blanc) qu'à la base (O', support blanc). O '' et P '') Fusionné images fluorescentes, flèches blanches indiquent MYO7A (+) / EdU (+) des cellules de cheveux au sommet (P '') et la base (O ''). Plus de cellules EdU (+) sont présents dans le ganglion auditif au sommet (P, ag) qu'à la base (O, ag). (sac; saccule à O). (A, Anterior et V, ventral dans les panneaux B etE). Echelle barres 100 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

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Le procédé décrit ici de micro-électroporation in ovo est optimisé pour le transfert de gène dans l'organe auditif développement. Il est compatible avec les plasmides vecteurs d'expression à base d'ADN utilisés habituellement pour manipuler la fonction du gène / expression. Le moment de l'électroporation à E4 est optimal pour les enquêtes qui mettent l'accent sur le développement de HC dans l'organe auditif. Les étapes les plus critiques sont micro-injecter l'ADN dans la lumière de la vésicule otique sans aller trop profond avec l'aiguille et d' endommager la vésicule otique (voir Fig. 1A-D), le ciblage de l'ADN dans le domaine antéro-ventrale de la vésicule otique par placer les électrodes en conséquence (voir figure 1c.), et délivrant les paramètres d'électroporation optimisées de 4 impulsions à 12 V. Celles - ci sont optimisées des paramètres d'électroporation et d' optimiser la concentration de l' ADN plasmidique (~ 3,5 à 4 ug / ul) pour cibler spécifiquement l'auditif présomptif orgue à E4. Au départ, nous avons commencé out mener électroporations à 6 V, qui a abouti à aucun des signaux fluorescents. La tension a été incrémentielle augmentée en utilisant 8 V et 10 V, 12 V étant optimal. De même, le nombre d'impulsions pour délivrer et les durées d'impulsion et l'espacement des impulsions ont été optimisées. A 12 V, 4 impulsions avec 100 msec et 200 msec espacement est idéal. Ces paramètres ne sont pas seulement idéal pour obtenir un transfert de gène efficace à E4, mais sont également idéales pour un taux de survie des embryons d'environ ~ 50%. Si aucun signal fluorescent est obtenu dans les 24 heures de l'électroporation, les points suivants devraient être pris en considération: 1.) Assurez-vous que la concentration d'ADN plasmidique est d'au moins 3,5 ug / ul. 2.) Réglez le paramètre électroporation de 2 V, par exemple à 10 ou 14 V. En ce qui concerne l' obtention d' embryons E4 (HH24-25) de la scène dans les 117 heures de temps d'incubation (voir Fig. 1D), la température de l' incubateur pour les œufs devraient une optimisation entre 37-39 ° C, avec plus ou moins d'heures d'incutemps de probation nécessaire de 117 heures en fonction de la température utilisée, car il y a des variations dans la détention et l'exécution des températures en utilisant différents incubateurs entre les différents laboratoires. Divers analogues de la thymidine , y compris BrdU (5-bromo-2'-désoxyuridine) , ou EdU peuvent être utilisés pour étudier la prolifération cellulaire in ovo. Cependant, l'utilisation de l'un composé doit être optimisé pour chaque stade de développement que trop le composé se révèle toxique pour la cellule / viabilité de l'embryon et trop peu du composé prouve inefficace. Cette méthode décrit l'utilisation optimisée de EdU à une concentration de 0,25 mg / ml , 50 ul appliqué comme sur l'ensemble de l' embryon in ovo , en particulier pour l' étude de la prolifération cellulaire et du cycle cellulaire sortie de E4 en avant.

Électroporation in ovo comme moyen de manipulation génétique a quelques limitations. Un grand nombre relatif d'œufs sont requis pour électroporations à E4 avec des constructions de contrôle appropriées et pour les experimental conditions. Cela est dû à une proportion d'œufs, environ ~ 27%, étant inutilisable pour l'électroporation en raison d'une combinaison de l'absence de fécondation, les défauts de développement, et la mort embryonnaire. Un autre facteur important à considérer est le taux des embryons après électroporation de survie. Le taux de survie est d'environ ~ 50%. Ceci est dû au fait que les embryons plus âgés à E4 ne survivent pas bien après avoir été manipulé; jeunes embryons sont plus résistants et tolérer d'être manipulés mieux. Expression des gènes d'intérêt après l'électroporation à E4 sont focale et localisée dans l'ensemble du conduit cochléaire incluant un tissu non-sensorielle et sensoriels ainsi que le ganglion auditif. La raison de l'expression plus focale et localisée est parce que la cible de l'électroporation est, organe auditif peu développé présomptif à E4, devant l'organe auditif de poulet commence à se développer sur à E5 et allonge sa forme en forme de faucille caractéristique par ~ E9 1 . Enfin, eméthode de e est transitoire où les signaux d'expression restent seulement pour ~ 4 jours, parce que les gènes d'intérêt utilisés ici n'intègrent pas dans le génome. Cependant, le procédé peut être utilisé avec des constructions d'expression à base de plasmide appropriés qui ont la capacité d'intégrer dans le génome.

Maîtriser la méthode d'électroporation exige une certaine pratique, les yeux et les mains formés, et de l'expertise dans le travail avec des embryons de poulet. Les références fournies par atlas de développement de développement de l'oreille interne et de poulet servent comme de bons guides et sont de bons points de départ pour un novice. Après la maîtrise du procédé, avec ces paramètres optimisés d'électroporation, le procédé peut être utilisé pour des manipulations dans la vésicule otique fermée de E2 ~ E4.5. Bien que pour l'électroporation à E2 et E3, 10 V doit être utilisé au lieu de 12 V. Pour électroporation à E1 ciblant le placode otique et la coupe otique, des électrodes de platine personnalisés avec des paramètres d'électroporation modifiés peuvent être utilisés 8-10. En plus d'étudier le développement de l'organe auditif ce procédé se prête également à étudier le développement de l'innervation ganglionnaires auditive. Analyse de l' expression de GFP dans des échantillons a révélé que l' électroporation ciblant spécifiquement la vésicule otique antéro-ventrale vise non seulement le domaine sensoriel au sein de la compétence (NSD) épithélium neuro-sensoriel , mais vise également la population neuronale qui résident dans le NSD. Les neurones afférents innervant les organes sensoriels vestibulaires et auditifs sont principalement d'origine placodal otique. Neurogenèse se produit sur une période de temps prolongée approximativement de ~ E1.5 - E4.5 dans le poussin, où neuroblastes, subissant une prolifération cellulaire intense délaminer en continu de l'épithélium NSD de la coupe otique (~ de E1.5) et vésicule otique (~ E2.5 - E4.5) et remplir comme différenciation des neurones du ganglion cochléaire-vestibulaire (CVG; VIII nerf crânien) 8,10,13,22.

De plus, avec quelques modifications organes vestibulaires peuvent être ciblées avec la méthode présentée. Par exemple, la partie antérieure crista présomptif peut être ciblée à l' E3, qui se trouve sur la pointe dorsale antérieure de la NSD antéro-ventral 9. Électroporation à E4 ciblant les antéro-ventral rendements des vésicules otiques focaux encore robustes expressions de transcription de la GFP dans le tissu sensoriel et non-sensorielle dans tous les organes vestibulaires sensorielles, à savoir le cristae et utricluar et macules sacculaire (données non présentées).

En conclusion, le procédé présenté ici dans ovo est spécifique pour la réalisation de gain et de perte des fonctions à partir de E4 et pour étudier la prolifération et la différenciation dans le poulet organe auditif développement. En outre, ce procédé peut être facilement adapté pour l'étude de l'autre dansner l'oreille des phénomènes de développement, y compris la neurogenèse de l'oreille interne et le développement des organes vestibulaires.

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Acknowledgments

Nous remercions le Dr Doris K. Wu pour les plasmides d'expression et de sondes in situ, le Centre de l' Université Johns Hopkins pour Sensory installation d'imagerie de la biologie et le Centre d'audience et de l' équilibre. Ce travail a été soutenu par NIDCD Grant T32 DC000023 à LE

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile 1x PBS pH 7.4 gibco 10010-023
Fast Green FCF Powder Sigma F7252-5G
EdU Powder Invitrogen E10187
Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit Invitrogen C10338
HiSpeed Plasmid Midi Kit (25) Qiagen 12643
ECM 830 ElectroSquarePorator  BTX Harvard Apparatus
Banana to Micrograbber Cable Kit BTX Harvard Apparatus 45-0216
Right Handed & Left Handed Micromanipulators World Precision Instruments Inc.  M3301R & M3301L
Two 12 mm Magnetic Holding Device Stages with 7 inch vertical posts World Precision Instruments Inc.  M10
Metal Steel Base Plate 12x24 inch World Precision Instruments Inc.  5479
Scissors for Eggs 12 cm long curved, 12 mm extrafine blades; Spring Scissors World Precision Instruments Inc.  14120
Micropippette Puller for pulling needles Sutter Instrument Co. P-97
2.5x2.5 mm Box Platinum Heating Filament Sutter Instrument Co.
Glass Capillary Tubes/Needles/No Fiber/Borosil 1 mm FHC 27-30-0
Hamilton Glass Syringe 100 μl Hamilton 80601 Model 710LT
Mineral Oil (Heavy) for Hamilton Glass Syringe Fisher Scientific O122-1
Polyethylene Tubing for connecting the Glass Syringe and Glass Cappillary Needles/ Non Toxic Becton Dickinson and Company (BD) 427420 Intramedic Clay Adams Brand
3 cc Disposable Syringes Becton Dickinson and Company (BD) 309657
Disposable 21 Gauge Needles Becton Dickinson and Company (BD) 305122
One pair of 2 mm Platinum Electrodes Bulldog Bio. / Nepagene CUY611P3-2
Electrode Holder Bulldog Bio. / Nepagene CUY580
One pair of Dumont fine forceps number 5 Fine Science Tools (FST)
Matte finish invisible tape for sealing eggs Office Depot 520-928
Cotton-Tipped Swabs Fisher Scientific 23-400-101
Sterile filter tips

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References

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Transfert de gènes dans l&#39;organe de poulet Auditory par<em&gt; Dans Ovo</em&gt; Micro-électroporation
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Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation. J. Vis. Exp. (110), e53864, doi:10.3791/53864 (2016).More

Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation. J. Vis. Exp. (110), e53864, doi:10.3791/53864 (2016).

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