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Developmental Biology

Gene Transfer nel pollo Auditory Organ doi: 10.3791/53864 Published: April 17, 2016

Abstract

Embrioni di pollo sono sistemi modello ideale per lo studio dello sviluppo embrionale, come manipolazioni di funzione del gene possono essere svolte con relativa facilità in ovo. L'orecchio interno uditiva organo sensoriale è fondamentale per la nostra capacità di sentire. Ospita un epitelio altamente specializzato sensoriale che è costituito da cellule ciliate meccano-trasduzione (HC) e dintorni gliali-come le cellule di supporto (SCS). Nonostante le differenze strutturali negli organi uditivi, meccanismi molecolari che regolano lo sviluppo dell'organo uditivo sono evolutivamente conservati tra mammiferi e aves In elettroporazione Ovo è in gran parte limitata alle prime fasi a E1 -. E3. A causa della relativa ritardato sviluppo dell'organo uditivo a E5, manipolazioni dell'organo uditivo di elettroporazione in ovo passato E3 sono difficili a causa dello sviluppo advanced dell'embrione di pollo in fasi successive. Il metodo qui presentato è un metodo di trasferimento genico transitoria per il targeting dei geni di interesse afase E4 - E4.5 in via di sviluppo pollo uditivo organo sensoriale via in ovo micro-elettroporazione. Questo metodo è applicabile per GAIN- e perdita di funzioni con plasmide convenzionale vettori di espressione basati sul DNA e può essere combinato con in saggio di proliferazione delle cellule ovo aggiungendo EdU (5-etinil-2'-deossiuridina) per l'intero embrione allo tempo di elettroporazione. L'uso di proteina fluorescente verde o rosso (GFP o RFP) plasmidi di espressione consente allo sperimentatore di determinare rapidamente se l'elettroporazione di mira con successo la porzione uditiva del sviluppo dell'orecchio interno. In questo lavoro il metodo, esempi rappresentativi di esemplari GFP elettroporate sono illustrate; embrioni sono stati raccolti 18-96 ore dopo l'elettroporazione e il targeting della GFP per l'area pro-sensoriale dell'organo uditivo è stata confermata da RNA ibridazione in situ. Il documento metodo fornisce anche un protocollo ottimizzato per l'uso della timidina analogico EdU analizzare prolif cellulerazione; un esempio di un saggio di proliferazione cellulare basato EdU che combina immuno-etichettatura e cliccare EdU chimica è fornito.

Introduction

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Nonostante le differenze nella morfologia e patterning cellulare tra mammiferi e aviaria organo sensoriale uditivo, i fattori molecolari e dei percorsi responsabili dello sviluppo HC sensoriali sono pensati per essere evolutivamente conservato 1-3. La papilla basilare, che ospita le HC uditive e le loro SC circostanti, si sviluppa come un outpocketing del otocyst dell'orecchio interno. Nella fase iniziale di un pool di progenitori HC e SC è specificato all'interno del / otic dominio competente tazza neurale-sensoriale otic placode (NSD). Fate dati di mappatura dimostrano che lignaggi neuronali e sensoriali sono collegati e nascono dalla NSD situato nella regione antero-ventrale della coppa otic o otocyst nei topi e pollo 4,5. In primo luogo, neuroblasti delaminano dal NSD per dare origine ai neuroni del ganglio uditivo-vestibolare, che alla fine diviso in gangli uditivo e vestibolare. Questi neuroni innervano i HC sensoriali dell'orecchio interno e nuclei del tronco cerebrale. Le cellule Tha rimanere nel NSD si pensa di dare origine a varie patch sensoriali, tra cui l'organo sensoriale uditivo, costituito dai HC sensoriali meccano-trasduzione e le loro SC associati.

In entrambi il pulcino e murino, organo uditivo progenitrice sensoriale uscita del ciclo cellulare e la differenziazione HC si verificano in opposte gradienti. In pulcino, uditivo progenitrice uscita del ciclo cellulare inizia intorno ~ E5 e progredisce dalla base all'apice, e dal centro alla periferia 6. Il giorno dopo, la differenziazione HC inizia nel vertice e progredisce alla base 7. Studiando lo sviluppo dell'orecchio interno nei polli offre molti vantaggi tecnici meccanismi funzionali possono essere studiate con relativa facilità in ovo al contrario di manipolare embrioni in utero in altri sistemi modello, che richiede interventi complessi. Il metodo descritto qui utilizza in ovo micro-elettroporazione per indirizzare i geni di interesse nella Basila presuntivaR zona della papilla antero-ventrale nella vescicola otica specificamente a E4.

Elettroporazione in ovo è una tecnica che è ben consolidata e comunemente usato 8-14. Il principio della tecnica elettroporazione si basa sul fatto che i nucleotidi (ad esempio, DNA plasmidico, DNA sintetico, o RNA oligonucleotidi) sono caricati negativamente. Il DNA viene iniettato nel tessuto di interesse. Quando una corrente elettrica viene inserito attraverso il tessuto, la corrente si apre pori transitori nelle pareti cellulari e permette l'assorbimento del DNA, come il DNA caricato negativamente fluisce verso l'elettrodo positivo (anodo). Per gli esperimenti di guadagno di funzione, i geni di interesse sono comunemente subclonati in plasmidi di espressione che contengono adeguate cassette di espressione per Green Fluorescent Protein (GFP) o proteina fluorescente rossa (RFP). Per la perdita di funzione esperimenti plasmide-based dominanti costrutti negativi repressori, o RNAi, o costrutti morpholino sono commonly usato 15,16. Per inibire microRNA (miRNA) funzione miRNA costrutti spugna, che sono tipicamente plasmide base, può essere utilizzato 17. Il metodo qui descritto permette di indagare i meccanismi molecolari che controllano la proliferazione e la differenziazione nell'organo uditivo, come nel metodo di micro-elettroporazione ovo possono essere facilmente combinati con in test di proliferazione cellulare ovo aggiungendo EdU a tutta dell'embrione.

L'elettroporazione e l'aggiunta di EdU viene eseguita a E4 nella vescicola otica, che è un giorno prima della comparsa di uscita del ciclo cellulare nell'organo uditivo. L'analisi dell'organo uditivo è in genere eseguita 18-96 ore dopo l'elettroporazione in E5 (insorgenza di uscita del ciclo cellulare progenitrici sensoriale), E6 (insorgenza di differenziazione HC), e E7 (durante la differenziazione HC); e poi fino a ~ E9 (fine differenziazione HC). Questo metodo elettroporazione del trasferimento genico è transitorio della durata di circa ~ 4 giorni, because i geni di interesse non si integrano nel genoma, ma il metodo è applicabile per l'uso con adeguato plasmide vettori di espressione basati sul DNA, che hanno la capacità di integrarsi nel genoma, come ad esempio il trasferimento genico mediato Tol2 11. Con questo metodo GFP robusto o espressione RFP dura ~ 4 giorni nella coclea, dopo che indicano i segnali di dissolvenza, ma forniscono una finestra di tempo sufficiente per studiare lo sviluppo intricato dell'organo uditivo. Questo metodo di trasferimento genico in ovo è nuovo e consente di indirizzare specificamente l'organo uditivo presuntiva in E4, che è ottimale per le indagini che si concentrano sullo sviluppo HC nell'organo uditivo. Si tratta di una buona aggiunta ai metodi alternativi, che l'elettroporazione in molto più giovani stadi di sviluppo o 11,12 rispetto all'uso di in vitro basilare papille culture espianto 18.

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Protocol

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Le uova non schiuse e gli embrioni sono curati e trattati eticamente e umanamente. Tutti i protocolli per l'uso degli embrioni unhatched sono stati approvati dalla cura degli animali e del Comitato Usa presso la Johns Hopkins School of Medicine, Baltimora, Maryland.

1. Le uova e la preparazione di costrutti di espressione

  1. Uova:
    1. Incubare 3-4 dozzina di uova di gallina fecondate (Gallus gallus) disteso su un fianco a 37 ° C.
      1. Dopo 24 ore di incubazione, tirare 3 cc di albume con una siringa dal back-end round del uovo e sigillare il foro con nastro adesivo trasparente. Questo crea una camera d'aria tra l'embrione e il guscio, consentendo facilità di accesso all'embrione senza l'embrione attaccare allo scafo durante il taglio la finestra di accesso sulla parte superiore dell'uovo 19.
      2. A 117 ore di tempo di incubazione, in scena gli embrioni in base alla Hamburger e Hamilton 20 fasi di sviluppoa E4 (HH24-25) (Vedi Figura 1D).
  2. Espressione crea:
    1. Preparare il DNA plasmide utilizzando reagenti e il protocollo fornito dal produttore di un kit di preparazione disponibile in commercio. Nella fase finale di preparazione, eluire il DNA in 500 microlitri TE (Tris-EDTA) tampone fornito nel kit in una provetta da 1,5 ml.
    2. Etanolo precipitare il DNA di concentrare aggiungendo 50 ml di 3 M acetato di sodio e 1 ml di etanolo al 100% al tubo. Posizionare il tubo a -20 ° CO / N.
    3. Centrifugare la provetta per 30 min a 14.000 rpm a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e aria asciugare il pellet per 10 minuti a RT. Sciogliere il pellet in 15 microlitri di buffer TE, che dovrebbe ottenere una concentrazione di ~ 4 mg / mL.
      NOTA: Il controllo costrutti di espressione usati qui sono pMES-IRES-GFP 10, che è guidato da un promotore di pollo β-actina, o PCI-H2B-IRES-RFP CMV.

2. Pollo In Ovo Micro-elettroporazione e In Ovo Cell Proliferation Assay

  1. In Ovo micro-iniezione di Construct espressione e Micro-elettroporazione:
    1. Tirare i tubi di vetro capillari in aghi sottili con un estrattore di micro-pipetta con i seguenti parametri ottimizzati per un x 2,5 mm Box Platinum riscaldamento filamento 2.5: Pressione = 500, Calore = 600 ° C, Pull = 64, Velocity = 105, e ora = 150 msec (vedi tabella 1).
    2. Impostare la sinistra e fasi di micro-manipolatore di mano destra che fiancheggiano il microscopio (vedi figura 1A). Il micro-manipolatore Destro tiene il capillare ago di vetro e la sinistra-handed micro-manipolatore mantiene gli elettrodi (Figura 1A).
    3. Preparare l'ago capillare di vetro finemente tirato per la micro-iniezione tagliandola punta dell'ago con una pinza mentre lavora sotto il microscopio.
    4. Riempire l'ago manualmente a mano con il micro-manipolatore con 2,5 ml di DNA plasmidico colorati con 0,1% veloce verde mentre lavora sotto il microscopio.
    5. Mettere l'uovo sdraiata su un fianco all'interno di un dispositivo di stampo / uovo partecipazione (vedi Figura 1A). Tagliare una finestrella sulla parte superiore dell'uovo con le forbici 19 (Figura 1A).
    6. Mentre si lavora sotto il microscopio, aprire con cautela le due membrane sovrapposte l'embrione con pinze.
    7. Lavorando al microscopio, fornire circa ~ 0,5 ml di DNA plasmidico per il giusto lume vescicola otic da micro-iniezione manualmente utilizzando la mano destra utilizzando micro-manipolatore e micro-elettroporazione.
      1. Per fare ciò, micro-iniettare la giusta lume vescicole otic con il DNA con la mano destra micro-manipolatore (Figura 1B-D), mentre allo stesso tempo con la mano sinistra Holdinga pinza per stabilizzare la testa dell'embrione, perché la testa dell'embrione immerge nella fase E4. Non micro-iniezione passato lume vescicole otic, perché questo potrebbe danneggiare la vescicola otica.
      2. Subito dopo micro-iniezione mentre lavora sotto il microscopio, utilizzare la mano sinistra micromanipolatore per posizionare il positivo (anodo) 2 millimetri elettrodo di platino antero-ventrale vescicola otica destra e 2 millimetri negativo elettrodo (catodo) in parallelo 1 mm l'uno dall'altro (vedi Figura 1 C). Invia 4 impulsi a 12 V con durata di 100 msec e 200 msec spaziatura. La vescicola otica sinistra serve come un controllo non trattato interno.
        NOTA: Pulire gli elettrodi tra electroporations con un batuffolo di cotone imbevuto con punta in 1x PBS.
  2. In Ovo Cell Proliferation Assay:
    1. Subito dopo l'elettroporazione aggiungere 50 ml di 0,25 mg / ml EdU in 1x PBS facendo cadere manualmente la soluzione di 50 microlitri EdU su tuttaembrione in ovo con una pipetta. Sigillare le uova con nastro e tornare alla incubatore per 18-96 ore.
    2. Rimuovere con attenzione il nastro e verificare gli embrioni per la GFP fluorescenza o il segnale di richiesta di offerta all'interno della vescicola otica dopo 18 - 24 ore utilizzando un microscopio a fluorescenza standard (vedi Figura 1 EE '). Se segnale fluorescente è presente, a questo punto, raccogliere gli embrioni per analisi o richiudere con nastro adesivo e restituirlo al incubatore per la raccolta ed analisi in fasi successive (vedi Figura 1 FP '').
      NOTA: L'espressione di segnale GFP con il costrutto pMES-IRES-GFP è evidente 6-7 ore dopo l'elettroporazione 10.

3. Embrione la raccolta e la lavorazione dei tessuti per l'RNA ibridazione in situ e immunoistochimica

  1. Raccogliere gli embrioni con pinze. Lavare l'embrione in 1x PBS freddo. Rimuovere le teste degli embrioni, tagliando la testa per il collousando pinze, e posizionare le teste in paraformaldeide al 4% O / N a 4 ° C. Perforare il cervello utilizzando una pinza per consentire la penetrazione del paraformaldeide 4% all'interno della testa.
  2. Disidratare le teste di 30% di saccarosio (in 1x PBS) O / N a 4 ° C.
  3. Montare le teste a medio crioprotettiva da congelamento rapido in un impasto di ghiaccio secco e metilbutano (2-metilbutano). In alternativa, rapida congelare le testine in media crioprotettiva con azoto liquido. Conservare le teste montate a -80 ° C.
  4. Cryosection le teste in 12 sezioni micron di tessuto di spessore e raccogliere tutte le sezioni di tessuto dell'orecchio contenenti interno su vetrini da microscopio superfrosted.
  5. Eseguire RNA standard di ibridazione in situ e immunoistochimica come precedentemente descritto 4,21, e analizzare per la proliferazione cellulare EdU seguendo il protocollo fornito dal produttore del kit.
    NOTA: le cellule dei capelli possono essere identificati utilizzando il coniglio policlonali α-MyosinVIIa (MYO7A) untibody (1: 1.000, Proteus Biosciences) e anticorpo secondario fluorescenza marcata (1: 250, di capra anti-coniglio AlexaFluor 488; Invitrogen).

4. Acquisizione Immagine e lavorazione

  1. Prendere le immagini con apparecchiature di imaging digitale. Risultati Immagine immunoistochimica con un microscopio a fluorescenza standard ed i risultati dei controlli in loco utilizzando un microscopio a livello di campo standard (che vanno da 5x a 40x in un ingrandimento).
  2. Elaborare le immagini utilizzando il software di elaborazione delle immagini.

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Representative Results

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In questo DNA metodo della carta plasmide composto di proteina fluorescente verde (GFP) cassette di espressione è stata mirata al pollo in via di sviluppo papilla basilare (BP) con parametri ottimizzati da 12 V e 4 impulsi con 100 durata degli impulsi msec e gli intervalli di 200 msec, ottenendo un ~ tasso di sopravvivenza del 50% degli embrioni e l'efficienza del plasmide-DNA mira alla BP. Imaging fluorescente di espressione GFP nativa in embrioni di mostrato questo metodo di elettroporazione rivolge preferenzialmente l'aspetto antero-ventrale del otocyst, che dà luogo alla BP (Figura 1 EE '; freccia bianca) e l'espressione GFP può essere seguita nel corso tempo fino a circa ~ 4 giorni (Figura 1 EH). RNA ibridazione in situ (ISH) è stato utilizzato per determinare se l'elettroporazione mirata correttamente la porzione uditiva del sviluppo dell'orecchio interno. Per determinare se la GFP è stato ripreso da uditivoprogenitori sensoriali, gli esperimenti sono stati eseguiti su ISH sezioni BP adiacenti. All'interno dei progenitori in via di sviluppo sensoriale BP sono stati identificati dal loro espressione di Sox2 (figura 1 K e N) e frangia Lunatic (Lfng) (Figura 1 J). Questi esperimenti dimostrano che i progenitori sensoriali in tutto il sviluppare BP, come mostrato per la base (Figura 1 I; staffa nero) e apice (Figura 1 L; staffa nero), sono stati presi di mira con successo ed esprimono GFP dopo 68 ore di elettroporazione (Figura 1 I e l; staffe neri). Inoltre, GFP è stato espresso fuori del dominio sensoriale in cellule epiteliali non sensoriali (Figura 1 I e L; frecce rosse) e nel ganglio uditivo (Figura 1I e L; ag, frecce gialle) caratterizzato da espressione Neurod1 (Figura 1M) . In un tipico esperimento GFP (Figura 1 H); questo permette al ricercatore di analizzare la distribuzione spaziale e temporale del progenitore sensoriale recesso del ciclo cellulare e la differenziazione in sviluppo BP. Per determinare il comportamento proliferativo dei progenitori sensoriali, la EDU timidina analogico è stato aggiunto al momento della elettroporazione a E4. Quattro giorni dopo, EdU incorporazione nella sviluppo di BP è stato analizzato in sezioni di tessuto usando "click" chimica. Immuno-etichettatura per la proteina specifica-HC MyosinVIIa (MYO7A) è stato utilizzato per identificare HC differenziano in via di sviluppo BP. Nella parte apicale della BP MYO7A + HC sono stati spesso EdU + (Figura 1 PP '; P' ', frecce bianche), mentre nella base solo poche MYO7A + HC aveva incorporato EdU (Figura 1 OO'; O '', frecce bianche), suggerendo che al momento della EdU Oltre a E4, pro sensorialegenitors nella base sono già ampiamente inviare mitotico. Questi risultati confermano precedenti studi di opposte gradienti di uscita del ciclo cellulare e la differenziazione HC nel pulcino BP 6,7.

Figura 1
Figura 1. In elettroporazione Ovo & In Ovo Cell Proliferation Assay. (AD) immagini in campo chiaro di metodo elettroporazione. In micro-iniezione ovo nella vescicola otica destra (B) e il posizionamento degli elettrodi dopo micro-iniezione di targeting zona antero-ventrale vescicola otica (C). Embrione allo stadio HH24-25 dopo micro-iniezione ed elettroporazione (D; verde vescicola otica, freccia nera). (EH) proteina verde fluorescente (GFP) espressione dopo l'elettroporazione. ( (E ') l'espressione della GFP a 18 ore (vescicole otic, freccia bianca). (FH) Frecce bianche indicano l'espressione della GFP a 40 ore (F, vescicole otic), 68 ore (G, BP), ea 88 ore (H, BP). (IN) adiacenti cocleari tessutali sezioni della BP sondato per GFP, Lfng, Sox2, e Neurod1 trascrizioni da RNA ibridazione in situ a 68 ore. Lfng (J, staffa nero) e Sox2 (K e N, staffa nera) segnano il dell'epitelio sensoriale e Neurod1 (M) segna il ganglio uditivo (AG). GFP è espressa all'interno sensoriale (I e L, la staffa nero) e tessuto non-sensoriale (I e L, frecce rosse), e l'unaganglio uditory (I e L, frecce gialle). (PO '') immagini fluorescenti di MyosinVIIa (MYO7A) / EdU etichettatura. (O'-O '' e p'- P '') ingrandimenti maggiori di O e P. (O 'e P') Più EdU etichettatura è presente all'interno dell'epitelio sensoriale al vertice (P ', staffa bianca) rispetto alla base (O', staffa bianca). O '' e P '') Fusa immagini fluorescenti, frecce bianche indicano MYO7A (+) / EdU (+) cellule ciliate al vertice (P '') e la base (O ''). Più EdU (+), le cellule sono presenti all'interno del ganglio uditivo all'apice (P, ag) rispetto alla base (O, ag). (sac; saccule a O). (A, anteriore e V, ventrale in pannelli B eE). Scala bar 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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Il metodo qui descritto di in ovo micro-elettroporazione è ottimizzato per il trasferimento genico in via di sviluppo dell'organo uditivo. E 'compatibile con il plasmide vettori di espressione basati sul DNA tipicamente utilizzati per manipolare la funzione del gene / espressione. I tempi di elettroporazione in E4 è ottimale per le indagini che si concentrano sullo sviluppo HC nell'organo uditivo. Le fasi più critiche sono micro-iniezione del DNA nel lume vescicola otic senza andare troppo in profondità con l'ago e danneggiando la vescicola otica (vedi Fig. 1A-D), il targeting del DNA nel dominio antero-ventrale vescicola otica by posizionare gli elettrodi di conseguenza (vedi Fig 1C.), e la consegna dei parametri di elettroporazione ottimizzate di 4 impulsi a 12 V. Questi sono ottimizzati i parametri di elettroporazione e la concentrazione del DNA plasmide ottimizzato (~ 3,5-4 mg / mL) per destinatario principale la uditivo presuntiva organo a E4. Inizialmente abbiamo iniziato out condurre electroporations a 6 V, che non ha prodotto segnali fluorescenti. La tensione è stata gradualmente aumentata utilizzando 8 V e 10 V, con l'essere ottimale 12 V. Analogamente, il numero di impulsi per fornire e la durata degli impulsi e la spaziatura degli impulsi sono state ottimizzate. A 12 V, 4 impulsi con durata di 100 msec e 200 msec spaziatura è l'ideale. Questi parametri sono non solo ideale per ottenere il trasferimento di geni efficiente a E4, ma sono ideali anche per un tasso di sopravvivenza degli embrioni di circa ~ 50%. Se nessun segnale fluorescente viene ottenuto entro 24 ore di elettroporazione, dovrebbe essere considerata la seguente: 1.) Assicurarsi che la concentrazione plasmide DNA è di almeno 3,5 mg / mL. 2.) Regolare il parametro elettroporazione da 2 V, per esempio per 10 o 14 V. Come all'ottenimento embrioni E4 (HH24-25) fase entro 117 ore di tempo di incubazione (vedi Fig. 1D), la temperatura incubatrice per le uova dovrebbero essere ottimizzato tra 37-39 ° C, con più o meno ore di incutempo bation bisogno di 117 ore a seconda della temperatura utilizzata, perché ci sono variazioni di detenzione e l'esecuzione temperature utilizzando diversi incubatori tra i diversi laboratori. Vari analoghi della timidina tra BrdU (5-bromo-2'-deossiuridina) o EdU possono essere utilizzati per studiare nella proliferazione cellulare ovo. Tuttavia, l'uso di due composti deve essere ottimizzato per ogni stadio di sviluppo come troppo del composto dimostra tossico per la cellula / vitalità dell'embrione e troppo poco del composto dimostra inefficace. Questo metodo descrive l'uso ottimizzato di EdU ad una concentrazione di 0,25 mg / ml applicatori 50 microlitri sull'intera embrione in ovo specificamente per studiare la proliferazione cellulare e ciclo cellulare-uscita dalla E4 in poi.

In elettroporazione ovo come metodo di manipolazione genetica ha alcune limitazioni. Un gran numero relativo di uova sono necessari per electroporations a E4 con appropriati costrutti di controllo e per le experimentacondizioni l. Ciò è dovuto ad una percentuale di uova, circa il ~ 27%, essendo inutilizzabile per elettroporazione causa di una combinazione di mancanza di concimazione, difetti di sviluppo, e morte embrionale. Un altro fattore importante da considerare è il tasso di sopravvivenza degli embrioni dopo l'elettroporazione. Il tasso di sopravvivenza è di circa ~ 50%. Ciò è dovuto al fatto che gli embrioni anziani a E4 non sopravvivono bene dopo essere manipolato; embrioni più giovani sono più resistenti e tollerare di essere manipolati meglio. Espressione di geni di interesse dopo elettroporazione in E4 sono focale e localizzata nell'intero dotto cocleare compreso il tessuto non sensoriale e sensoriale nonché ganglio uditivo. La ragione per l'espressione più focale e localizzato è perché la destinazione del elettroporazione è il presuntiva, non sviluppato organo uditivo a E4, prima che il pollo organo uditivo inizia a crescere in E5 ed allunga nella sua caratteristica forma a falce di ~ E9 1 . Infine, thMetodo e è transitoria in cui i segnali di espressione rimangono solo per ~ 4 giorni, perché i geni di interesse utilizzati qui non si integrano nel genoma. Tuttavia, il metodo può essere utilizzato con opportuni costrutti plasmide di espressione-based che non hanno la capacità di integrarsi nel genoma.

Padroneggiare il metodo di elettroporazione richiede una certa pratica, gli occhi e le mani esperte, e l'esperienza nel lavoro con embrioni di pollo. I riferimenti forniti per lo sviluppo dell'orecchio interno e pollo atlanti di sviluppo servono come buone guide e sono buoni punti di partenza per un novizio. Dopo padronanza il metodo con questi parametri di elettroporazione ottimizzati, il metodo può essere utilizzato per manipolazioni sugli vescicola otica chiusa da E2 a ~ E4.5. Anche se per electroporating a E2 e E3, 10 V deve essere usato al posto di 12 V. Per l'elettroporazione in E1 mira il placode otic e coppa otic, elettrodi di platino personalizzate con i parametri di elettroporazione modificati possono essere utilizzati 8-10. Oltre a studiare lo sviluppo dell'organo uditivo questo metodo si presta anche per studiare lo sviluppo del innervano ganglion uditivo. Analisi di espressione GFP in campioni elettroporate ha rivelato che il targeting specificamente la vescicola otica antero-ventrale, non si rivolge solo il dominio sensoriale all'interno del competente (NSD) epitelio neurale-sensoriale, ma si rivolge anche alla popolazione neuronale che risiedono all'interno del NSD. neuroni afferenti che innervano gli organi sensoriali vestibolari e uditivi sono principalmente di origine placodal otic. La neurogenesi si verifica nel corso di un periodo di tempo prolungato circa da ~ E1.5 - E4.5 nel pulcino, dove neuroblasti, in fase di intensa proliferazione cellulare continuamente delaminano da epitelio NSD della coppa otic (~ E1.5) e vescicole otica (~ E2.5 - E4.5) e popolare come differenziare i neuroni del ganglio cocleare-vestibolare (CVG; VIII nervo cranico) 8,10,13,22.

Inoltre, con alcune modifiche organi vestibolari possono essere mirati con il metodo presentato. Ad esempio, il crista anteriore presuntiva può essere mirata a E3, che si trova sulla punta dorsale anteriore del NSD antero-ventrale 9. Electroporating a E4 mira le antero-ventrale rendimenti vescicola otic focali ancora robuste espressioni GFP trascrizione all'interno del tessuto sensoriale e non sensoriale tutti gli organi sensoriali vestibolari, vale a dire la creste e utricluar e macule sacciforme (dati non riportati).

In conclusione, il metodo in ovo qui presentato è specifico per condurre guadagno e perdita di funzioni da E4 e per studiare la proliferazione e differenziazione nel pollo sviluppo dell'organo uditivo. Inoltre, questo metodo può essere facilmente adattato per studiare altri aner orecchio fenomeni evolutivi, tra neurogenesi orecchio interno e lo sviluppo di organi vestibolari.

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Acknowledgments

Ringraziamo il Dr. Doris K. Wu per plasmidi di espressione e di sonde in situ, la Johns Hopkins University Center for sensoriale struttura di imaging Biologia e il Centro di udito e l'equilibrio. Questo lavoro è stato sostenuto da NIDCD di Grant T32 DC000023 a LE

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile 1x PBS pH 7.4 gibco 10010-023
Fast Green FCF Powder Sigma F7252-5G
EdU Powder Invitrogen E10187
Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit Invitrogen C10338
HiSpeed Plasmid Midi Kit (25) Qiagen 12643
ECM 830 ElectroSquarePorator  BTX Harvard Apparatus
Banana to Micrograbber Cable Kit BTX Harvard Apparatus 45-0216
Right Handed & Left Handed Micromanipulators World Precision Instruments Inc.  M3301R & M3301L
Two 12 mm Magnetic Holding Device Stages with 7 inch vertical posts World Precision Instruments Inc.  M10
Metal Steel Base Plate 12x24 inch World Precision Instruments Inc.  5479
Scissors for Eggs 12 cm long curved, 12 mm extrafine blades; Spring Scissors World Precision Instruments Inc.  14120
Micropippette Puller for pulling needles Sutter Instrument Co. P-97
2.5x2.5 mm Box Platinum Heating Filament Sutter Instrument Co.
Glass Capillary Tubes/Needles/No Fiber/Borosil 1 mm FHC 27-30-0
Hamilton Glass Syringe 100 μl Hamilton 80601 Model 710LT
Mineral Oil (Heavy) for Hamilton Glass Syringe Fisher Scientific O122-1
Polyethylene Tubing for connecting the Glass Syringe and Glass Cappillary Needles/ Non Toxic Becton Dickinson and Company (BD) 427420 Intramedic Clay Adams Brand
3 cc Disposable Syringes Becton Dickinson and Company (BD) 309657
Disposable 21 Gauge Needles Becton Dickinson and Company (BD) 305122
One pair of 2 mm Platinum Electrodes Bulldog Bio. / Nepagene CUY611P3-2
Electrode Holder Bulldog Bio. / Nepagene CUY580
One pair of Dumont fine forceps number 5 Fine Science Tools (FST)
Matte finish invisible tape for sealing eggs Office Depot 520-928
Cotton-Tipped Swabs Fisher Scientific 23-400-101
Sterile filter tips

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken. The Journal of comparative neurology. 368, 620-630 (1996).
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Gene Transfer nel pollo Auditory Organ<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-elettroporazione
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Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation. J. Vis. Exp. (110), e53864, doi:10.3791/53864 (2016).More

Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation. J. Vis. Exp. (110), e53864, doi:10.3791/53864 (2016).

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