Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Tavuk İşitsel Organ gen Transferi tarafından doi: 10.3791/53864 Published: April 17, 2016

Abstract

Tavuk embriyo gen fonksiyonunun manipülasyonlar ovo göreli kolaylıkla yapılabilir embriyonik gelişme çalışmak için ideal bir model sistemleridir. iç kulak işitme duyu organı duymak yeteneğimizi için kritik öneme sahiptir. Bu destek hücreleri (SC'ler) glial gibi son derece uzmanlaşmış duyusal (HCS) mekano nakleden saç hücrelerden oluşur epiteli ve çevresindeki evler. Işitsel organlarda yapısal farklılıklara rağmen, işitsel organ gelişimini düzenleyen moleküler mekanizmalar evrimsel memeliler ve kuşların arasında muhafaza edilir ovo elektroporasyon E1 erken aşamalarında büyük ölçüde sınırlıdır -. E3. Nedeniyle E5 işitsel organ göreli geç gelişmesine, E3 geçmiş ovo elektroporasyon ile işitsel organın manipülasyonlar nedeniyle daha sonraki aşamalarda tavuk embriyo ileri gelişimine zordur. Burada sunulan yöntem de ilgi genleri hedef için geçici bir gen transferi yöntemisahne E4 - ovo mikro-elektroporasyon yoluyla gelişmekte olan tavuk işitsel duyu organ E4.5. Bu yöntem, gain- ve-kaybı fonksiyonları bilinen plazmid DNA bazlı ekspresyon vektörleri ile uygulanabilir ve en bütün embriyoya edu (5-etinil-2'-deoksiuridin) eklenerek ovo hücre çoğalma tahlilinde birleştirilebilir elektroporasyon süresi. yeşil ya da kırmızı floresan proteininin (GFP veya RFP) ifade plazmaları kullanımı deneyci hızla elektroporasyon başarıyla gelişen iç kulağın işitme bölümünü hedef belirlemek için izin verir. Bu yöntem yazıda, GFP Electroporated örneklerin temsili örnekleri gösterilmiştir; elektroporasyon sonra 96 saat ve işitsel organ yanlısı duyusal alana GFP hedefleyen in situ hibridizasyon RNA tarafından doğrulandı - embriyolar 18 toplandı. yöntemi kağıt da CellProlif analiz etmek edu analog timidin kullanımı için optimize edilmiş bir protokol sağlardurmasýna; immüno-etiketlenmesi birleştiren edu Click kimyası eğitsel göre hücre çoğalma tahlilinin bir örneği temin edilmiştir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Memeli ve kuş işitsel duyu organı arasındaki morfoloji farklılıkları ve hücresel desenlendirme rağmen, moleküler faktörler ve duyusal HC geliştirmeden sorumlu yollar evrimsel 1-3 korunmuş olduğu düşünülmektedir. işitsel HCS ve çevrelerindeki SC'ler evler baziler papilla, iç kulak otocyst outpocketing olarak gelişir. Erken HC ve SC atalarıdır bir havuz otik plakod / otik fincan sinir-duyu yetkili etki alanı (NSDAP) içinde belirtilir. Kader-haritalama verileri nöronal ve duyusal soylar bağlantılı ve otik fincan antero-ventral bölgesinde bulunan ya da fareler ve tavuk 4,5 yılında otocyst NSDAP kaynaklanan olduğunu kanıtlar sunmaktadır. İlk olarak, Nöroblastlar sonunda işitsel ve vestibüler ganglionlar bölünmüş işitsel-vestibüler ganglion, nöronlar yol vermek için NSDAP dan tabakalara. Bu nöronlar beyin sapı iç kulak ve çekirdeklerin duyusal HCS innerve. th hücreleriNSDAP kalır at mekano nakleden duyusal HCS ve bunların ilişkili AVM oluşan işitsel duyu organı dahil olmak üzere çeşitli duyusal yamalar, yol düşünülmektedir.

civciv ve sıçangil hem de, işitme organı duyusal progenitör hücre döngüsü çıkış ve HC farklılaşma degradeler karşı meydana gelir. Civciv, işitsel progenitör hücre döngüsü çıkış ~ E5 etrafında başlar ve tabandan tepeye doğru ilerler ve merkezden çevreye 6. Bir gün sonra, HC farklılaşma apeks başlar ve tabanına 7 ilerler. Fonksiyonel mekanizmalar karmaşık ameliyatları gerektirir diğer model sistemler uterus, embriyolar manipüle aksine ovo göreli kolaylıkla araştırılabilir olarak tavuk iç kulak gelişiminin incelenmesi birçok teknik avantajlar sağlamaktadır. Burada tarif edilen yöntem, olası Basila ilgi genleri hedef ovo mikro elektroporasyon kullananÖzellikle E4 otik vezikül r papilla alanı ön-ventral.

Ovo Elektroporasyon iyi kurulmuş ve genel olarak 8-14 kullanılan bir tekniktir. Elektroporasyon tekniği ilkesi nükleotidleri (örneğin, plazmid DNA, sentetik DNA ya da RNA oligonükleotidleri) negatif yüklü gerçeğine dayanır. DNA, ilgi konusu doku içine enjekte edilir. bir elektrik akımı doku boyunca yerleştirildiğinde, mevcut hücre duvarlarının geçici gözenekleri açılır ve negatif yüklü DNA, pozitif elektrot (anot) doğru akarken, DNA alımı için izin verir. kazanç fonksiyon-deneyleri için, ilgi konusu gen genellikle yeşil flüoresan protein (GFP) veya kırmızı flöresanlı proteindir (RFP) için uygun ekspresyon kasetleri içeren ifade plazmidleri alt klonlanır. kayıp-fonksiyon deneyleri plazmid tabanlı dominant negatif represör yapıları veya RNAi veya morfolino yapıları için c vardırommonly 15,16 kullanılır. Bazlı plazmid tipik mikroRNA (MiRNA) işlevi miRNA'lar sünger yapıları, inhibe etmek için, 17 kullanılabilir. Ovo mikro elektroporasyon yöntemi kolayca tüm embriyo edu ekleyerek ovo hücre çoğalma tahlilinde birleştirilebilir burada tarif edilen yöntem olup, işitme organı proliferasyonu ve farklılaşmasını kontrol eden molekül mekanizmalarının incelenmesi için izin verir.

elektroporasyon ve Edu eklenmesi bir gün işitsel organında hücre döngüsü çıkış başlangıcından önce olduğu otik vezikül içinde E4 gerçekleştirilir. tipik olarak 18 gerçekleştirilen bir işitsel organ Analizi - (HC farklılaşma sırasında) E5 (duyusal progenitör hücre döngüsü çıkış başlangıcı), E6 (HC farklılaşma başlangıcı) ve E7 elektroporasyon sonra 96 ​​saat; ve daha sonra ~ E9 (HC farklılaşma sonuna) kadar. Gen transferi bu elektroporasyon yöntemi olup, ~ 4 gün yaklaşık süren geçicidir becauSE ilgili genler, genomu içine entegre değildir, ancak yöntem, Tol2-aracılı gen transferi 11 gibi genomuna entegre yeteneğine sahip yapmak için, uygun plazmid DNA bazlı ekspresyon vektörleri ile kullanılmak için uygundur. Bu yöntemle sağlam GFP veya RFP ifade sürer ~ ile sinyalleri işaret solmaya, ancak işitsel organ karmaşık gelişimini incelemek için geniş bir zaman pencere sağlamak sonra kokleadaki 4 gün. Ovo gen aktarım yöntemi Bu roman ve özellikle işitme organı HC geliştirme odaklanmak araştırmalar için en uygun olan E4 olası işitsel organı, hedef sağlar. Bu çok daha genç gelişim aşamalarında 11,12 ya da in vitro baziler papilla eksplant kültürleri 18 kullanımı ile karşılaştırıldığında en elektroporasyona alternatif yöntemler, iyi bir yer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

yumurta ve çıkmamış embriyolar için bakım ve etik ve insanca muamele edilir. çıkmamış embriyo kullanımı için tüm protokoller Tıp Baltimore, Maryland Johns Hopkins School Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından kabul edildi.

1. Yumurta ve ekspresyon yapıları hazırlanması

  1. Yumurtalar:
    1. 3 inkübe - 4 düzine döllenmiş tavuk yumurtası (Gallus gallus) 37 ° C'de onların yüzüne düz yalan.
      1. inkübasyon 24 saat sonra yumurtanın yuvarlak arka ucundan bir şırınga ile albümin 3 cc çekin ve şeffaf bir bantla delik mühür. Bu yumurta 19 üstünde erişim için pencere keserken kabuk yapışmasını embriyo olmadan embriyo erişim kolaylığı sağlayan, embriyo ve yumurta kabuğu arasında bir hava boşluğu oluşturur.
      2. İnkübasyon süresi 117 saatte, Hamburger ve Hamilton 20 gelişim aşamalarına göre embriyolar sahneE4 (HH24-25) de (Şekil 1D bakınız).
  2. İfade oluşturur:
    1. reaktifler kullanılarak plazmid DNA ve bir ticari olarak temin edilebilir preparat kitinin üretici tarafından yapılan protokoller hazırlayın. hazırlama son aşamasında, 500 ul TE (Tris-EDTA), 1.5 ml tüp içine kitte sağlanan tampon içine DNA elüte.
    2. Etanol 3 M sodyum asetat ve 50 ul ve boru 100,% 1 mL etanol ekleyerek konsantre DNA hızlandırabilir. -20 ° CO / N tüp yerleştirin.
    3. 4 ° C'de 14,000 rpm'de 30 dakika boyunca tüp santrifüjleyin. Süpernatantı ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca pelet hava-kurutun. ~ 4 ug / ul konsantrasyon elde edilmelidir, 15 ul TE tampon maddesi içinde pelet, eritin.
      Not: Burada kullanılan kontrol tanım yapılan bir tavuk β-aktin promotör tarafından yönlendirilen PMES IRES-GFP 10, ya da pCI-H2B-IRES-RFP vardır CMV promoteri tarafından tahrik edilir> 10 kadar.

Ovo Mikro elektroporasyon ve Ovo Hücre Proliferasyon Tahlili 2 tavuk

  1. İfade Construct ve Mikro-elektroporasyon Ovo Mikro enjeksiyon:
    1. 2.5 x 2.5 mm Kutu Platin Isıtma Filament için aşağıdaki optimize parametreler ile bir mikro-pipet çektirmenin kullanarak ince iğneler içine cam kılcal tüpler çekin: Basınç = 500, Isı = 600 ° C, Velocity = 105 ve Zaman = 64 çekin = 150 milisaniye (bakınız Tablo 1).
    2. Sol- ve mikroskop yan Sağ el mikro-manipülatör aşamalarında kurmak (Şekil 1A bakınız). Sağ el mikro-manipülatör cam kılcal iğne ve Solaklar mikro-manipülatör elektrotlar (Şekil 1A) tutar tutar.
    3. keserek mikro-enjeksiyon için ince çekti cam kapiller iğne hazırlayınBir forseps ile iğne ucu mikroskop altında çalışırken.
    4. Mikroskop altında çalışırken% 0.1 Hızlı Yeşil ile renklendirilmiş plazmid DNA 2.5 ul mikro-manipülatör kullanarak elle manuel olarak iğne doldurun.
    5. (Şekil 1A bakınız) bir kalıp / yumurta tutma cihaz içinde yan yatan yumurta yerleştirin. Makas 19 (Şekil 1A) kullanarak yumurtanın üstünde bir yuvarlak pencere kesti.
    6. Mikroskop altında çalışırken, dikkatle forseps kullanarak embriyo kaplayan iki membranlar açın.
    7. Mikroskop altında çalışırken, elle mikro-manipülatör kullanarak ve mikro-elektro-sağ elinizi kullanarak mikro-enjeksiyon sağ kulak vezikül lümene plazmid DNA yaklaşık ~ 0.5 ul teslim.
      1. Aynı anda sol ışığımdır kullanırken bu yüzden, Sağ mikro-manipülatör (Şekil 1B-D) DNA ile sağ kulak vezikül lümen mikro-enjekte yapmakEmbriyonun baş aşaması E4 dips çünkü ga forcep, embriyonun baş sakinleştirmeye. Bu otik vezikül zarar verecektir çünkü, otik vezikül lümeni geçmiş mikro-enjekte etmeyin.
      2. Hemen mikro-enjeksiyon sonrasında, mikroskop altında çalışırken, pozitif (anot) platin elektrot ön-ventral sağ kulak vezikül ve paralel olarak negatif 2 mm elektrot (katot) ile 2 mm yerleştirmek için Sol mikro-manipülatör kullanın 1 mm aralıklı (Şekil 1 C). 100 milisaniye süre ve 200 msn aralıkla 12 V 4 darbeleri sunun. sol kulak vezikül bir iç işlenmemiş kontrol olarak hizmet vermektedir.
        NOT: 1x PBS batırılmış bir pamuk uçlu çubukla electroporations arasında elektrotlar temizleyin.
  2. Ovo Hücre Proliferasyon Tahlili:
    1. Hemen elektroporasyon sonra el bütün üzerine 50 ul Edu çözüm bırakarak 0.25 mg 50 ul ekleyin / ml edu 1x PBS içindeBir pipet kullanarak ovo embriyo. bant ile yumurta Seal ve 18 için inkübatör dönmek - 96 saat.
    2. ( 'Şekil 1 EE bakınız) standart floresan mikroskop kullanılarak 24 saat - dikkatle bandı çıkarın ve 18 sonrası otik vezikül içinde floresan GFP veya RFP sinyali embriyolar kontrol edin. Floresan sinyal varsa, ( '' Şekil 1 FP bakınız) bu noktada analizler için embriyolar hasat veya bant ile yeniden mühürlemek ve hasat için inkübatör iade ve sonraki aşamalarda analiz eder.
      NOT: - 7 saat elektroporasyon 10 sonra PMES IRES-GFP yapı ile GFP sinyali Anlatım 6 açıktır.

Yerinde hibridizasyon ve immünohistokimya RNA 3. Embriyo Hasat ve Doku İşleme

  1. forseps kullanarak embriyolar hasat. Soğuk 1x PBS embriyo durulayın. onun boynundan başını keserek, embriyoların başkanları kaldır4 ° C 'de% 4 paraformaldehid O / N olarak kafaları forseps kullanılarak ve yerleştirin. kafasının içinde% 4 paraformaldehit girmesine izin vermek üzere, bir forsepsle kullanarak beyin delikler.
  2. 4 ° C'de O / N (1X PBS)% 30 sukroz içinde kafaları kurutmak.
  3. kuru buz ve metilbütan (2-metilbütan) içindeki bir bulamacı içinde hızlı dondurulması ile kriyokoruyucu ortam içinde kafa monte edin. Alternatif olarak, hızlı sıvı azot ile kriyokoruyucu ortamda başlarını dondurma. -80 ° C de monte kafaları saklayın.
  4. 12 mikron kalınlığında doku bölüme başlarını cryosection ve superfrosted mikroskop cam slaytlar üzerine tüm iç kulak içeren doku bölümleri toplamak.
  5. Daha önce 4,21 açıklandığı gibi in situ hibridizasyon ve immünohistokimya standart RNA gerçekleştirin ve kit üreticisi tarafından sağlanan protokol izlenerek edu hücre çoğalması için analiz edin.
    NOT: Saç hücreleri tavşan poliklonal kullanılarak tespit edilebilir a-MyosinVIIa (Myo7a) birtibody (1: 1,000, Proteus Biosciences) ile ve floresan etiketli ikincil antikor (1: 250, keçi anti-tavşan AlexaFluor 488; Invitrogen).

4. Görüntü Yakalama ve İşleme

  1. dijital görüntüleme ekipmanları ile görüntü alabilir. Standart bir floresan mikroskop ve (5x gelen büyütme 40x arasında değişen) standart geniş alan mikroskobu kullanarak in situ sonuçları ile görüntü immünhistokimya sonuçları.
  2. Görüntü işleme yazılımı kullanarak görüntüleri işlemek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

yeşil floresan protein içeren bu yöntem, kağıt plazmid DNA içinde (GFP) ifade kasetleri ~ bir sonuçta 12 V ve 4 100 milisaniye darbe süresi ile bakliyat ve 200 milisaniye aralıklarla optimize parametreleri ile gelişmekte olan tavuk baziler papilla (BP) içine hedef aldı % 50 embriyo sağkalım oranı ve BP içine hedefleme plazmid-DNA etkinliği. (Beyaz ok Şekil 1, EE ') ve GFP tanımı bir süre boyunca takip edilebilir embriyoların geliştirilmesinde ana GFP tanımının Floresan Görüntüleme elektroporasyon Bu yöntem, tercihen, BP neden olur otocyst ön-ventral, hedef gösterdi yaklaşık ~ 4 gün öncesine kadar (Şekil 1 EH). In situ hibridizasyon (ISH) RNA elektroporasyon başarıyla gelişen iç kulağın işitme bölümünü hedef olup olmadığını belirlemek için kullanılmıştır. GFP işitsel tarafından alındı ​​olup olmadığını belirlemek içinduyusal ataları, ISH deneyleri komşu BP bölümler yapıldı. Gelişmekte olan BP duyu progenitörlerin Sox2 (Şekil 1, K ve K) ve kanadını (Lfng) (Şekil 1 J) kendi ifadesi ile belirlenmiştir içinde. Ve apeks (Şekil 1 L, siyah dirsek), başarıyla hedef ve elektroporasyon 68 saat (Şekil 1 I sonra GFP ifade edildi; bu deneyler gelişmekte BP boyunca duyusal ataları, tabanı (siyah braket Şekil 1 I) gösterildiği gibi göstermek ve L, siyah parantez). (; Kırmızı oklar Şekil 1 I ve L) ve işitsel ganglion (Şekil 1i ve L, ag, sarı oklar) yanı sıra, GFP olmayan duyu epitel hücrelerinde duyusal etki alanı dışında ifade edildi Neurod1 ifade ile işaretlenmiş (Şekil 1M) . Tipik bir deney GFP (Şekil 1 H) için kalıcı; Bu araştırmacı gelişmekte BP duyusal progenitör hücre döngüsü çekilmesi ve farklılaşma mekansal ve zamansal desen analiz etmeyi sağlar. Duyusal progenitörlerin proliferatif davranışını tespit etmek için, timidin analog edu E4 elektroporasyon anda ilave edildi. Dört gün sonra, gelişmekte olan BP edu şirketleşme kimya "klik" kullanarak doku kesitlerinde analiz edildi. HC-spesifik bir protein MyosinVIIa (Myo7a) için immuno-etiketleme geliştirme BP farklılaşan HCS tespit etmek için kullanıldı. Baz sadece birkaç Myo7a + HCS edu (Şekil 1 OO dahil oysa, '; O'; BP Myo7a apikal kısmında + HCS sık sık eğitim + ( 'beyaz oklar' P 'Şekil 1 PP) idi', beyaz oklar), E4 edu ekleme sırasında öne, duyu probaz genitörleridir zaten büyük ölçüde mitotik sonrası vardır. Bu sonuçlar civciv BP 6,7 hücre döngüsü çıkış ve HC farklılaşma degradeler karşı önceki çalışmalar doğrulamaktadır.

Şekil 1
Ovo Elektroporasyon ve Ovo Hücre Proliferasyon Tahlili Şekil 1.. (AD), elektroporasyon yöntemi aydınlık ve görüntüler. Ovo mikro enjeksiyonu, elektrot sağ kulak vezikül (B) ve yerleşimi mikro enjeksiyon sonrası ön-ventral alan hedefleme otik vezikül (C). Mikro-enjeksiyon ve elektroporasyon (; yeşil kulak vezikül, siyah ok D) sonra sahneye HH24-25 embriyo. Elektroporasyondan sonra (EH), yeşil flüoresan protein (GFP) ifadesi. ( (E ') 18 saatte GFP (otik vezikül, beyaz ok). (FH) Beyaz oklar 40 saat (F, otik vezikül), 68 saat (G, BP) de GFP işaret ve 88 saatte (H, BP). BP (IN) bitişiğinde koklear doku kesitleri 68 saat. Lfng (J, siyah dirsek) ve Sox2 (K ve N, siyah dirsek) de in situ hibridizasyon RNA GFP, Lfng, Sox2 ve Neurod1 transkript nedeniyle tahkikat işareti duyusal epitel ve Neurod1 (M), işitsel ganglion (ag) işaretler. GFP duyu içinde (I ve L, siyah dirsek) ve non-duyusal doku (I ve L, kırmızı oklar) ve a ifade ediliruditory ganglion (I ve L, san oklar). (OP '') MyosinVIIa (Myo7a) Floresan görüntüleri / edu etiketleme. (O'-O ' "ve P'-P'), o ve p'nin yüksek büyütme. 'Üssünde daha (beyaz braket (O (O' ve P '), etiketleme tepesinde duyu epitel içinde mevcut edu Daha P)' beyaz dirsek). O 've P' ') floresan görüntüler Birleştirilmiş, beyaz oklar apeks (P '') ve taban (O '') de Myo7a (+) / edu (+) saç hücreleri işaret. Daha Edu (+) hücre tabanının (O, ag) olduğundan daha apeks (P ag) işitsel ganglion içinde bulunurlar. (kese; O'da kesecik). Paneller B (A, Ön ve V, Ventral veE). Ölçek 100 mikron barlar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ovo mikro-elektroporasyon burada anlatılan yöntem geliştirilmesi işitsel organ haline gen transferi için optimize edilmiştir. Tipik olarak, gen fonksiyonu / ifade işlemek için kullanılan plazmid DNA bazlı ekspresyon vektörleri ile uyumludur. E4 elektroporasyon zamanlaması işitsel organında HC geliştirme odaklanmak araştırmalar için en uygunudur. En kritik adımlar iğne ile çok derin gidiyor ve otik vezikül zarar vermeden otik vezikül lümenine DNA mikro-enjekte otik vezikül ön-ventral alanı tarafından içine DNA hedef (Şekil. 1A-D bakınız) özellikle olası işitsel hedefleme için - (4 ug / ml ~ 3.5) uygun şekilde elektrodlar yerleştirmek Bu elektroporasyon parametrelerini optimize edilmiş ve plazmid DNA konsantrasyonu optimize edilmiş 12 V 4 pals optimize elektroporasyon parametrelerini sağlayan (. Şekil 1C bakınız) ve E4 organ. Başlangıçta biz başladık out hiçbir floresan sinyalleri vermiştir 6 V, en electroporations yürütülmesi. Gerilim aşamalı olarak 12 V optimum olmak üzere 8 V ve 10 V ile artmıştır. Benzer şekilde, darbe sayısı teslim etmek ve darbe süreleri ve bakliyat aralığı optimize edilmiştir. 12 V, 100 milisaniye süre ve 200 msn aralıkla 4 bakliyat idealdir. Bu parametreler, sadece E4 verimli gen transferi elde etmek için idealdir, ama aynı zamanda, yaklaşık ~% 50 embriyo hayatta kalma oranı için idealdir. Resim flüoresan sinyal elektroporasyon 24 saat içinde elde edilmektedir, aşağıdaki hususlar dikkate alınmalıdır: 1.) plazmid DNA konsantrasyonu, en az 3.5 mg / ml olduğundan emin olun. 2.) inkübasyon süresi 117 saat olan E4 (HH24-25) aşamasında embriyoların elde edilmesi ile ilgili olarak 10 veya 14 V, örneğin, 2 V elektroporasyon parametresini (bakınız Şek. 1B), yumurta kuluçka sıcaklığı gerektiği incu daha fazla veya daha az saat 39 ° C - 37 arasında optimizetutan ve farklı laboratuvarlarda arasında farklı inkübatör kullanarak sıcaklıkları çalışan farklılıklar vardır çünkü lenme süresi, kullanılan sıcaklığa bağlı olarak 117 saat daha gerekli. BrdU (5-Bromo-2'-deoksiüridin) ya da edu dahil olmak üzere çeşitli timidin analogları ovo hücre çoğalmasının çalışma için kullanılabilir. bileşik çok hücre / embriyo canlılığı toksik kanıtlar ve bileşik çok az etkili kanıtladığı gibi Ancak, her iki bileşiğin, her gelişim aşaması için optimize edilmiş olması gerekir. Bu yöntem / ml, özellikle ileriye E4 hücre çoğalması ve hücre döngüsü çıkış okuyan ovo bütün embriyo üzerinde 50 ul olarak tatbik 0.25 mg bir konsantrasyonda edu optimize kullanımını tarif eder.

Ovo elektroporasyon gen manipülasyonu bir yöntem bazı sınırlamalar olduğu gibi. Yumurta nispeten büyük bir sayıda uygun kontrol yapıları ile E4 elektroporasyon ve experimenta için gereklidirl koşulları. Bu, yaklaşık, yumurta oranında kaynaklanmaktadır ~% 27, bağlı döllenme eksikliği, gelişimsel kusur ve embriyonik ölüm kombinasyonuna elektroporasyon için kullanmak mümkün. Dikkate alınması gereken diğer önemli faktör elektroporasyon sonra embriyoların hayatta kalma oranı olduğunu. sağkalım oranı yaklaşık ~% 50'dir. Bu E4 eski embriyolar manipüle sonra iyi hayatta yok aslında nedeniyle; genç embriyolar daha esnek ve daha iyi manipüle ediliyor tahammül. E4 elektroporasyon sonra ilgi genlerin İfadeler fokal olmayan duyusal ve duyusal dokuya yanı sıra işitsel ganglion dahil olmak üzere tüm koklear kanal boyunca lokalize bulunmaktadır. Elektroporasyon hedef E4 olası, gelişmemiş işitsel organdır çünkü tavuk işitsel organı E5 dışarı büyümeye başlar ve ~ E9 1 ile karakteristik orak biçimli forma uzar önce daha fazla odak ve yerelleştirilmiş ifade nedeni, . Son olarak, incie yöntemi burada kullanılan ilgili genler, genomu içine entegre çünkü sentezleme sinyallerinin sadece ~ 4 gün devam geçicidir. Bununla birlikte, yöntem, genomuna entegre yeteneği var Uygun plazmidi tabanlı bir sentezleme konstruktları ile birlikte kullanılabilir.

elektroporasyon yöntemi Mastering tavuk embriyoları ile çalışan bazı pratik, eğitimli gözleri ve elleri ve uzmanlık gerektirir. iç kulak gelişimi ve tavuk gelişimsel atlaslar için sağlanan başvurular acemi için iyi bir başlangıç ​​noktalarını iyi kılavuzları hizmet ve vardır. Bu optimize edilmiş elektroporasyon parametrelerle yöntemi hakim sonra, yöntem ~ E4.5 E2'nin kapalı otik vezikül manipülasyonlar için kullanılabilir. E2 ve E3 electroporating için, 10 V tadil edilmiş elektroporasyon parametreleri ile kulak ve otik fincan, özel platin elektrotları hedefleme E1 elektroporasyon için 12 V yerine kullanılabilir gerekse de kullanılabilir 8-10 geliştirilmesi de dahil olmak üzere otik gelişiminde önceki olayları incelemek için kullanılabilir. işitsel organ gelişimini inceleyerek ek olarak, bu yöntem aynı zamanda innerve işitsel ganglion gelişimini incelemek için oldukça rahat. Electroporated örneklerin GFP analizi, özellikle ön-ventral otik vezikül hedefleme sadece nöral-duyusal yetkili (NSDAP) epitel içinde duyusal etki alanını hedefleyen, aynı zamanda NSDAP içinde ikamet nöronal nüfusu hedef ortaya koydu. Afferent nöronlar vestibüler ve işitsel duyu organları öncelikle otik placodal kökenlidir innerve. yoğun hücre çoğalmasını geçiren Nöroblastlar sürekli E (otik fincan (~ E1.5) ve otik vezikül NSDAP epitelinden tabakalara ayırmak ~ civciv, içinde E4.5 - nörogenez ~ E1.5 yaklaşık uzun bir süre boyunca ortaya çıkar2.5 - E4.5) ve nöronların koklear-vestibüler ganglion (CVG farklılaşan olarak doldurmak; VIII kranial sinir) 8,10,13,22.

Ayrıca, bazı modifikasyonlarla, vestibüler organlar sunulan yöntem ile hedeflenebilir. Örneğin, olası ön crista ön-ventral NSDAP 9 dorsal anterior ucunda yatıyor E3, hedef olabilir. Ön-ventral otik vezikül verimleri duyu vestibüler organları, yani kristalarında ve utricluar ve sakküler makuladan tüm duyusal ve olmayan duyu dokusu içinde henüz sağlam GFP transkript ifadeleri fokal hedefleyen E4 electroporating (veriler gösterilmemiştir).

Sonuç olarak, burada sunulan de ovo yöntem yürütmek için spesifik kazanç ve E4 başlayan işlevler ve gelişmekte olan tavuk işitsel organ çoğalması ve farklılaşması incelemek için-kaybı. Ayrıca, bu metod başka çalışmak için adapte edilebilirner kulak iç kulak nörogenez ve vestibüler organların gelişimi de dahil olmak üzere gelişimsel olaylar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Biz ifade plazmaları ve in situ sondaları Dr. Doris K. Wu teşekkür Duyu Biyoloji görüntüleme tesisi için Johns Hopkins Üniversitesi Merkezi ve İşitme ve Denge Merkezi. Bu çalışma LE NIDCD Grant T32 DC000023 tarafından desteklenen

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile 1x PBS pH 7.4 gibco 10010-023
Fast Green FCF Powder Sigma F7252-5G
EdU Powder Invitrogen E10187
Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit Invitrogen C10338
HiSpeed Plasmid Midi Kit (25) Qiagen 12643
ECM 830 ElectroSquarePorator  BTX Harvard Apparatus
Banana to Micrograbber Cable Kit BTX Harvard Apparatus 45-0216
Right Handed & Left Handed Micromanipulators World Precision Instruments Inc.  M3301R & M3301L
Two 12 mm Magnetic Holding Device Stages with 7 inch vertical posts World Precision Instruments Inc.  M10
Metal Steel Base Plate 12x24 inch World Precision Instruments Inc.  5479
Scissors for Eggs 12 cm long curved, 12 mm extrafine blades; Spring Scissors World Precision Instruments Inc.  14120
Micropippette Puller for pulling needles Sutter Instrument Co. P-97
2.5x2.5 mm Box Platinum Heating Filament Sutter Instrument Co.
Glass Capillary Tubes/Needles/No Fiber/Borosil 1 mm FHC 27-30-0
Hamilton Glass Syringe 100 μl Hamilton 80601 Model 710LT
Mineral Oil (Heavy) for Hamilton Glass Syringe Fisher Scientific O122-1
Polyethylene Tubing for connecting the Glass Syringe and Glass Cappillary Needles/ Non Toxic Becton Dickinson and Company (BD) 427420 Intramedic Clay Adams Brand
3 cc Disposable Syringes Becton Dickinson and Company (BD) 309657
Disposable 21 Gauge Needles Becton Dickinson and Company (BD) 305122
One pair of 2 mm Platinum Electrodes Bulldog Bio. / Nepagene CUY611P3-2
Electrode Holder Bulldog Bio. / Nepagene CUY580
One pair of Dumont fine forceps number 5 Fine Science Tools (FST)
Matte finish invisible tape for sealing eggs Office Depot 520-928
Cotton-Tipped Swabs Fisher Scientific 23-400-101
Sterile filter tips

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken. The Journal of comparative neurology. 368, 620-630 (1996).
  2. Cantos, R., Cole, L. K., Acampora, D., Simeone, A., Wu, D. K. Patterning of the mammalian cochlea. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 11707-11713 (2000).
  3. Whitfield, T. T. Development of the inner ear. Current opinion in genetics & development. 32, 112-118 (2015).
  4. Raft, S., et al. Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development. Development. 134, 4405-4415 (2007).
  5. Satoh, T., Fekete, D. M. Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear. Development. 132, 1687-1697 (2005).
  6. Katayama, A., Corwin, J. T. Cell production in the chicken cochlea. The Journal of comparative neurology. 281, 129-135 (1989).
  7. Cotanche, D. A., Sulik, K. K. The development of stereociliary bundles in the cochlear duct of chick embryos. Brain Res. 318, 181-193 (1984).
  8. Alsina, B., et al. FGF signaling is required for determination of otic neuroblasts in the chick embryo. Developmental biology. 267, 119-134 (2004).
  9. Chang, W., et al. Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements. PLoS genetics. 4, e1000050 (2008).
  10. Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3879-3890 (2013).
  11. Freeman, S., Chrysostomou, E., Kawakami, K., Takahashi, Y., Daudet, N. Tol2-mediated gene transfer and in ovo electroporation of the otic placode: a powerful and versatile approach for investigating embryonic development and regeneration of the chicken inner ear. Methods in molecular biology. 916, 127-139 (2012).
  12. Kamaid, A., Neves, J., Giraldez, F. Id gene regulation and function in the prosensory domains of the chicken inner ear: a link between Bmp signaling and Atoh1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 11426-11434 (2010).
  13. Neves, J., Kamaid, A., Alsina, B., Giraldez, F. Differential expression of Sox2 and Sox3 in neuronal and sensory progenitors of the developing inner ear of the chick. The Journal of comparative neurology. 503, 487-500 (2007).
  14. Neves, J., Uchikawa, M., Bigas, A., Giraldez, F. The prosensory function of Sox2 in the chicken inner ear relies on the direct regulation of Atoh1. PLoS One. 7, 30871 (2012).
  15. Das, R. M., et al. A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon. Developmental biology. 294, 554-563 (2006).
  16. Wu, C. Y., Hooper, R. M., Han, K., Taneyhill, L. A. Migratory neural crest cell alphaN-catenin impacts chick trigeminal ganglia formation. Developmental biology. 392, 295-307 (2014).
  17. Kumar, M. S., et al. Suppression of non-small cell lung tumor development by the let-7 microRNA family. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3903-3908 (2008).
  18. Jacques, B. E., Dabdoub, A., Kelley, M. W. Fgf signaling regulates development and transdifferentiation of hair cells and supporting cells in the basilar papilla. Hearing research. 289, 27-39 (2012).
  19. Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. Journal of visualized experiments: JoVE. e306 (2007).
  20. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of morphology. 88, 49-92 (1951).
  21. Oh, S. H., Johnson, R., Wu, D. K. Differential expression of bone morphogenetic proteins in the developing vestibular and auditory sensory organs. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 6463-6475 (1996).
  22. Bell, D., et al. Spatial and temporal segregation of auditory and vestibular neurons in the otic placode. Developmental biology. 322, 109-120 (2008).
Tavuk İşitsel Organ gen Transferi tarafından<em&gt; Ovo olarak</em&gt; Mikro-elektroporasyon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation. J. Vis. Exp. (110), e53864, doi:10.3791/53864 (2016).More

Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation. J. Vis. Exp. (110), e53864, doi:10.3791/53864 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter