Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörlerinin Değerlendirilmesi için Basit Biyoassay

Published: March 15, 2016 doi: 10.3791/53867
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Tumour Angiogenesis Program, Peter MacCallum Cancer Centre

Summary

Biz, tespit miktarının ve ligandların vasküler endotelyal büyüme faktörü ailesinin üyelerinin aktivitesini izlemek için basit bir hücre bazlı biyolojik tayini açıklamaktadır. Deney ligand ile reseptör ve çapraz bağlama bir yarı-nicel veya kantitatif bir değerlendirmesini sağlamak için bir faktör bağımlı hücre hattı içinde ilave kimerik reseptörler kullanır.

Abstract

vasküler biyolojide rol oynayan reseptör tirozin kinazlar ve bunların etkileşime giren ligandlar analizi ilişkili reseptörlerin ilgili ligandların geniş bir yelpazesi ve özel bir endotel hücrelerinin primer kültürleri ile ilgili zorluk ailesine yapısal ifadesi genellikle zordur. Burada, vasküler endotel büyüme faktörü reseptör-2 (VEGFR-2), anjiyogenez ve lenfanjiyogenezin teşvik sinyallerin önemli bir transdüktör ligandların belirlenmesi için bir biyolojik tayini açıklamaktadır. transmembran ve eritropoietin reseptörü (EPOR) sitoplazmik bölgeleri ile VEGFR-2'nin hücre dışı (ligand bağlayıcı) bölgesinin bir füzyonunu kodlayan bir cDNA faktör bağımlı hücre çizgisi Ba / F3 olarak ifade edilir. Bu hücre hattı, 24 saat içinde hücrelerin ölümü ile interlökin-3 (IL-3) ve bu etken sonuçların çekilmesine mevcudiyetinde artmaktadır. VEGFR-2 / EPOR reseptör füzyon ekspresyonu hayatta kalma ve potentia teşvik etmek için alternatif bir mekanizma sağlarbağlanması ve füzyon proteini (yani, bir olabilir çapraz bağlantı VEGFR-2 hücre dışı bölgesi) hücre dışı kısmının çapraz bağlama yeteneğine sahip bir ligand mevcudiyetinde kararlı bir şekilde transfekte edilmiş Ba / F3 hücrelerinin lly çoğalması. ligand ve küçük hücre hacimleri, 24 saat hızlı bir sonucu imkan veren bir yarı-kantitatif bir yaklaşım, bir canlı hücre sayısı temsili göstergeler içeren kantitatif bir yaklaşım: deney iki yolla gerçekleştirilebilir. deney yapmak için nispeten kolaydır, bilinen VEGFR-2 ligandları yüksek ölçüde duyarlı ve VEGFR-2 gibi reseptör veya ligand ve çözülebilir bağ trans monoklonal antikorlar gibi sinyal hücre dışı inhibitörleri barındırabilir.

Introduction

salgılanan protein, büyüme faktörleri ve aynı kökenli hücre yüzeyi reseptörlerinin, vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF) ailesinin eriyebilir ligandların ve membrana gömülü reseptörler, hücre membranları üzerinde işaretlerinin transdüklenmesinden sırasıyla bu işlev önemli ve farklı bir gruptur. Bu endotel hücreleri, aynı zamanda epitel kaynaklı hücreler ve bağışıklık sistemi 1,2 kişilerce temel olarak işlev görür. sık görülen klinik kullanımda bunları hedefleyici ligand ile aktive edilen VEGF reseptörleri (VEGFR), yaşa bağlı makula dejenerasyonu ve kanser gibi önemli hastalığı, kritiktir ve terapötik tarafından angaje sinyal yollannın (örn, VEGF-A hedef monoklonal antikoru bevakizumab) 3,4.

VEGF ailesinin karmaşıklığını bir doğada bulunan çözülebilir ligandlan (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, parapox virüs ailesi ORF ve yılan zehiri VEGF, artı diğer tarafından kodlanan VEGF proteinlerinin çeşitliliğidir inhibitörVEGF-A) 2 izoformları.

Bu ligandlar yani reseptör tirozin kinaz ailesinin üç üyesi, VEGFR-1, VEGFR-2 ve VEGFR-3 ile etkileşim. Bu reseptörler değişken, farklı hücre tiplerinde ifade edilir fakat genellikle tüm boyutları 5, kan ve lenf damarları kaplayan endotel hücrelerinin yüzeyi üzerinde birlikte ifade edilmiştir. VEGFR-2, memeli VEGF-A 6, VEGF-C ve VEGF-7 D 8,9 olarak orf VEGF 10 ve yılan zehiri VEGF 11 ligandlarına bağlanabildiği. VEGFR-2 anjiyojenez, embriyonik gelişme (daha önceden mevcut damarlardan yeni kan damarlarının büyümesi), yara iyileşmesi, kanser ve göz hastalıkları sürüş önemli bir rol oynar. Bu bağlamda, bu tür VEGF-A, -C ve D bir bağ olarak ve ligandlar, kan damar endotel hücreleri 12-15 reseptörünü aktive eder. Lenfatik endotel hücreleri üzerinde VEGFR-2 lenfanjiyogenezin rol yeni lenfatik damarların 16 oluşumunu oynar. VEGFR-2 de dilatasyon ve sağlıklı doku ve hastalık 17 büyük arterlerin ve lenfatiklerden genişlemesini teşvik edebilir. VEGFR-2'nin tam bir anlayış: ligand etkileşimleri anjiojen bağımlı hastalıklar 18 iyileştirilmesinde kullanım için inhibitörlerin geliştirilmesi için önemlidir. VEGFR-2'ye, VEGF-A bağlama en izoformlar, VEGF-C ve VEGF-D proteolitik bölünme VEGFR-2 19,20 yüksek afıniteli bağlanma sergiler VEGF-homoloji alanı kapsayan bir fragman serbest bırakmak için gerekli olsa da.

Biz 21 (özel ortam gerektiren) birincil endotel pasaja teknik olarak zor olan hücreler, satın almak için pahalı ve kültür ihtiyacını aşmak için tasarlanmıştır VEGFR-2'nin ligandlar izlemek için bir biyoassay geliştirilen ve çoklu VEGFR'yi ifade ve ko- ilişkili olan 22 reseptörleri. saplama amacıyla, diğer VEGF reseptörleri ya da ko-reseptörleri ile VEGFR-2'nin heterodimerizasyon istenmeyen karmaşıklık neden olabilirY çift reseptör-ligand etkileşimleri, spesifik bir reseptöre bağlanabilir etkinliğini ya da önleyici reaktifler etkisini değerlendirmek. 23. biyo-deney hücre membranında ilgili alıcı hareketliliğini koruyan ve bir ligand en bağlanma yeteneği ve çapraz-link VEGFR-2 hücre dışı bölgesinin değerlendirme sağlar.

biyo-deney (bu durumda, VEGFR-2), bir VEGF reseptörünün hücre dışı bölgesi transmembran ve eritropoietin reseptörü (EPOR), sitokin reseptör ailesinin bir üyesi hücre içi bölgeleri ile birleştirildiği edildiği bir kimerik reseptörünün oluşturulması dayanır 8,24. Bu füzyon proteini daha sonra, faktör bağımlı ön-B hücre hattı Ba / F3 olarak ifade edilir bağlanması ve reseptörün hücre dışı alanı edebilen sitoplazmik efektör bölge aktivasyonuna neden olan çapraz bağlama yeteneğine sahip bir ligand ile bu stimülasyon üzerine hücreyi tanıtmak için Janus kinazlar (JAK) aracılığıyla bir hayatta kalma sinyal nakletmehayatta kalması ve / veya çoğalması. Bunun aksine, ligand ile tam uzunlukta VEGFR-2, aynı hücre tipinde ve stimülasyon sentezleme, VEGFR-2 yolunun yakın sinyal efektörleri, bu hücre tipinde uygun olmadıklarını gösteren hücre hayatta kalma ve proliferasyon teşvik etmez.

Bu yeni VEGFR-2 ligand 10,19,20,24-29 bağlanmasını keşfetmek için bağlamlarda çeşitli tahlili kullanılmıştır. Bir VEGFR-3-EPOR-Ba / F3 tahlili ile birlikte, bağlayıcı ve VEGFR-2 ve VEGFR-3 30 çapraz bağlama için göreceli VEGF-C'nin etkinliklerini ve VEGF-D büyüme faktörleri karşılaştırılmıştır. Deney VEGFR-2 veya VEGF-D, çözülebilir VEGFR-2 tutucu ve VEGF ailesi 31 hedefleme peptidomimetikleri monoklonal antikorların nötralize edici inhibitör aktivitesinin karakterize edilmesi için kullanılmıştır. Tahlil, aynı zamanda primer endotel hücreleri bağlanan farklı orf soylarından VEGF'lerinde yeteneğini ve çapraz bağ VEGFR-2, test öncesi göstermek için kullanılan 25 ya da temizleme büyüme değerlendirmek protokolleri 27 faktörleri sunulmadan önce hızlı bir şekilde aktivitesi için değerlendirilebilir VEGF'lerinde mutantlarının süratle taranması için özellikle yararlıdır.

Bu tarif deney uygulaması kolaydır, ve yarı-kantitatif versiyonu büyüme faktörleri, antikorlar ya da başka deneyler için çözünebilir reseptör alanlarının üretim veya saflaştırma takip bazen gereklidir pratik belirlemeleri için izin verir. tahlilinde kullanım kolaylığı spesifik dokular veya organ sistemleri ile kan veya lenf damarları türetilen primer endotel hücreleri ile yapılan daha fazla ve daha eksiksiz çalışmalar için ideal bir tamamlayıcısı yapar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

IL-3 ve Preparasyon kaynak WEHI-3B-koşullandınlmış madde

Not: Fare granülositik lösemi hücre hattı WEHI-3B, IL-3 ihtiva eden bir koşullu ortam üretmek üzere kültürlenir.

  1. Dulbecco Modifiye Kartal ortamında kültive WEHI-3B (DMEM),% 10 fetal sığır serumu (FBS),% 1 glutamin, uzun ömürlü bir ek 50 ug / ml gentamisin. Bir T175 cm3 doku kültürü şişesi içinde, taze kültür ortamına 50 ml büyüme log fazında 5 x 10 6 hücre inoküle ila yaklaşık 7 gün süreyle büyümeye ya da hücreleri, yaklaşık 24 ile büyüme bunların log fazına geçene kadar - 48 saat (kültür içinde aşırı hücre ölümünü önlemek). 500 ml aynı anda üretilebilir - 200 toplu halde şekilde koşullu ortam, -20 ° C'de birden fazla yıl boyunca saklanabilir olma yeteneğine sahiptir.
  2. 15 dakika hücrelerin ve hücre artıklarının kaldırmak için 1000 x g'de şişeleri ve spin sıvı ve hücre süzün. Süpernatant üst% 90 çıkarmakatant. 0.22 um filtre birimi ile filtre.
  3. 1 ml, 50 ml, -20 ° C'de depolama için 200 mi hacim ya da -70 ° içine kısım WEHI-3B koşullandırılmış ortam (CM). Daha küçük alikotları, uzun süreli depolama için deney hazırlanması, faktör bağımlı hücre çizgilerinin geçişi için kültür ortamı yapmak için ara hacim ve daha büyük miktarlar için de yararlıdır. IL-3, steril koşullar altında kullanılan bu yüzden çözülmüş ortam birkaç hafta muhafaza edilebilir, 4 ° C de, nispeten kararlıdır.
  4. Seçenek olarak ise, bir 0.22 um filtre birimi ile filtrelenmiştir sonra, kültür ortamında seyreltilmiştir 50 ng / ml'lik seviyelerde rekombinant fare IL-3 kullanımı.

VEGFR-2-Epor-Ba / F3 ve Kontrol Ba / F3 Hücre Hatlarında 2. Kültür ve Değerlendirme

  1. DMEM kültür kontrolü Ba / F3 hücreleri,% 10 FBS, 50 ug / ml gentamisin ve penisilin / streptomisin takviyesi,% 1 L-glutamin ve% 10 WEHI-3B-CM stabilize. hücrelerinden her üç günde bir oranının yaklaşık 1:15 ilâ seyreltilerde Geçiş hücrelerilog fazında büyüyor.
  2. DMEM kültür VEGFR2-EPOR-Ba / F3 hücreleri,% 10 FBS, 50 ug / ml gentamisin,% 1 L-glutamin ve% 10 WEHI-3B-sm ve 1 mg / ml G418 stabilize. log fazında büyüyen hücrelerden 01:15 seyreltilerde Passage hücreleri. Kimerik reseptörün yapımı ve ifade hakkında daha fazla bilgi için 24 Bkz.
  3. orta log-faz kültürlerinden hasat kontrol Ba / F3 veya VEGFR2-Epor-Ba / F3 hücreleri. Yavaşça şişenin tabanından bu yapışmayan hücreler çıkarıldı pipetle. Orta IL-3 ihtiva eden kaldırma (hücre pelletini kurtarmak için 5 dakika boyunca 750 x g 'de 10 ml santrifüj), fare toniklik fosfat tamponlu tuzlu su, pH 7.3 (PBS) ile üç kez yıkanır.
  4. 10,000 hücre başına, daha sonra yıkama WEHI-3B-CM veya rekombinant IL-3 olmaksızın tek DMEM ve katkı maddeleri ile birlikte hücreler, ve 7.4 x 10 4 hücre / ml (yani, 13.5 ul 1.000 hücre konsantrasyonunda bu ortam içinde tekrar süspansiyon bir hemasitometre kullanarak saymak suretiyle tespit edildiği üzere 135 ul) içinsırasıyla, tahlilde yarı-nicel veya nitel versiyonları kullanın.
  5. Mavi Tripan çıkışı (DİKKAT) tarafından canlılığı hücreleri değerlendirin. hücre popülasyonu ile 1 ve bir hemositometrede 100 hücre az sayısı: PBS (% 0,4) 1 Tripan Mavisi karıştırın. boya alma Hücreler ölü ya da ölmekte kabul edilir. 98'den% canlılığı deneyi gerçekleştirmek için gereklidir.

3. Yarı kantitatif Deneyi

  1. Oda sıcaklığında 72 oyuklu mikro plaka oyuklarına, IL-3-eksikli ortam 13.5 ul içinde ihtiva yıkanmış hücreler (1.000 hücre) ekleyin. yerçekimi önyargı hücre konsantrasyonunu değil hücre çökmesini sağlamak için aliquotting sırasında hücre süspansiyonu karıştırmak için özen gösterin. iyi kalibre P20 otomatik pipet ve otoklava ipuçlarını kullanın.
  2. Bir kalibre edilmiş P20 pipet ya da tercihen P2 pipet kullanarak (oyuk başına 1.000 hücre içeren 15 ul'lik bir son hacim yapmak 1.5 ul),% 10 hacminde kuyucuklara test örnekleri ve kontrol ekleyin. ca alRe örnekleri pH, tuz ve diğer sitostatik / potansiyel sitotoksik maddeler açısından Ba ​​/ F3 hücreleri için kültür koşulları ile uyumlu olmasını sağlamak için. Mümkün olan yerlerde, uygun bir ortam kullanmak ya da tampon (örneğin DMEM veya PBS sırasıyla) veya orta ya da tampon içerisinde seyreltilir. Aynı ucu ile öğütme karıştırma sağlayacaktır.
  3. Kontrol örnekleri için, (i) tek başına ortam ihtiva eden dahil herhangi bir IL-3,; (Ii) WEHI-3BD-CM,% 10 nihai hacim de, tek başına ortam ilave edilir; ve / veya (iii) VEGF-A Resim IL-3 ihtiva eden, tek başına ortam içinde 100 ng / ml olacak şekilde seyreltilmiştir.
  4. steril su, PBS veya ortam ile mikro plaka kullanılmayan kuyu doldurun ve izin gaz değişimi (su kağıt mendil ıslatılmış) ile nemlendirilmiş bir kap içinde plaka yerleştirin. % 10 CO2 bulunan nemli bir atmosferde kaplar içinde hücreler inkübe edin. Test örnekleri ve ortam bileşenleri mevcut ise, bu deney, konforlu bir kişi tarafından, 3 saat içinde ayarlanabilir.
  5. tipik olarak 16 saat sonra plakalar değerlendirilmesiİnkübasyon bu pozitif ve negatif numuneler arasındaki zaman ayrım belirgindir. Hücreler kültür içinde nasıl göründüğünü örnekleri için bakınız Şekil 3. 100 × büyütme - 40 standart ters faz-kontrast mikroskop kullanılarak plakaları analiz edin.
    Not: Wells yuvarlak ve yarı saydam görünür hücreler içeren örneğin IL-3 veya VEGF-A destekleyici büyüme faktörleri ihtiva etmektedir. Destekleyici büyüme faktörleri olmaksızın veya tek başına ortam maddesi ile Wells yuvarlak hücre, hem de ölü veya ölmekte hücrelerin ve hücre artıklarının (ör Şekil 3C) sayısı azaltılmış olacaktır. 24-48 saat sonra inkübasyon de tahlil değerlendirilmesi hassasiyet için optimum olduğunu.

4. Kantitatif Biyoassay

  1. Oda sıcaklığında, bir standart 96 oyuklu mikrotiter plakasının oyuklarına IL-3-eksikli ortam içinde yıkanmış hücreler (135 ul 10,000 hücre) ekleyin. ce etkilemez yerçekimi tarafından hücre çökmesini sağlamak için aliquotting sırasında hücre süspansiyonu karıştırmak için özenll konsantrasyonu.
  2. % 10 hacim (15 ul) kalibre edilmiş bir pipet (P20) kullanarak kuyulara test örnekleri ve kontrolleri ekleyin. Numuneler pH, tuz veya diğer sitostatik / potansiyel sitotoksik maddeler açısından Ba ​​/ F3 hücreleri için kültür koşulları ile uyumlu olmasını sağlamak için özen gösterin. Mümkün olan yerlerde, uygun bir ortam kullanmak ya da tampon (örn., DMEM ya da PBS) veya orta ya da tampon içerisinde seyreltilir. Filtre 0.22 mikron gözenek selüloz asetat santrifüj tüp filtre ünitesi kullanılarak küçük hacimlerde sterilize edin.
  3. 48 saat süre ile,% 10 CO2 içeren nemlendirilmiş bir atmosferde hücreleri, büyüme faktörleri ve / veya önleyici ajanların karışımını inkübe edin. su ile ıslatılmış kağıt mendil vardır ve gaz alışverişini sağlayan nemlendirilmiş bir kap içinde tahlil gerçekleştirin. de viyabl hücre sayısının temsili göstergeler Kuluçka süresinin tamamlanmasından sonra, aşağıda belirtilen alternatif yöntemlerden birini kullanarak tahlil değerlendirilmesi bulunmaktadır.
  4. Alternatif # 1: 3H-thymidine Ortaklığın
    Not: Bu miktar, 96 gözlü plaka formatında için tasarlanmıştır.
    1. 37 ° C (oyuk başına 150 ul hacim) 48 saat için deney plakalarının inkübasyondan sonra, (IL-3 / WEHI-3B CM olmayan Ba / F3 kültür ortamı) deney ortamı 50 ul bir hacim içinde, 3H-timidin ekleme oyuk başına 1 uCi nihai dozu verecek şekilde de 20 uCi / ml'lik bir konsantrasyonda başına.
    2. Bir hücre hasat cihazı kullanılarak hücrelerin hasat edilmesinden önce 37 ° C'de bir 4 saat inkübe edin. sintilasyon filtreleri yerleştirerek bireysel örnekler ayıklamak ve bir sıvı sintilasyon sayacı ile miktarı belirlenir.
  5. Alternatif 2: Hücresel ATP Biyoparlaklık Tespiti
    Not: Bu yaklaşım popülasyonunda canlı hücreler yansıtan bir biyolüminesans sinyali üretebilir hücreleriyle birlikte bir ATP izleme ayıracı kullanır.
    1. Hücreleri, ATP ayıklamak ve üretmek için bir ATP İzleme Reaktifini kullanmak içinüreticinin talimatlarına uygun olarak lüminesan sinyal. 96 oyuklu bir plaka formatı ile uyumlu bir luminometre kullanılarak ışık yayılması okuyun.
  6. Alternatif # 3: Canlı hücreler tarafından Gösterge Boya enzimatik Azaltma
    Not: Resazurin dayalı tahliller hücre canlılığı iyi bir korelasyon göstermektedir.
    1. resazurin göre boya ile kültürlenen hücreler birleştirin ve üreticinin talimatlarına göre bir floresan plaka okuyucu kullanarak tahlilleri ölçmek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu bölümde, bir VEGFR-2-EPOR-Ba / F3 biyoassay (tahlilinde ilkelerine Şekil 1 e bakınız) temel özelliklerini gösteren bir deneyin sonuçlarını gösterir. Diğer Çalışmalar, alternatif bir VEGFR-2 ligandları mutan VEGF molekülleri ve inhibitör monoklonal antikorlar 8,10,19,24-30 tahlilinin daha geniş bir uygulama göstermektedir.

Burada sunulan veriler, VEGFR-2-EPOR-Ba / F3 biyo-analizi, üç rekombinant insan ligand (VEGF-A 165, VEGF-C ve VEGF-D) VEGFR için spesifikliği olan etkinliğini ölçmek için kullanılan bir deney temsil -2 bir engelleyici monoklonal antikor (bevacizumab) varlığında VEGF-A 165 veri VEGF-A 165, tek başına (Şekil 2) karşılık karşı normalize edilmiştir. Beklendiği gibi, bevacizumab VEGF-A deneyde 165 etkisini bloke ancakVEGF-C ve VEGF-D aktivitesi üzerinde bir etkisi olmamıştır.

Testin gelişimi hakkında değerli bilgiler sağlayabilir standart ters faz mikroskobu kullanılarak tahlil inceleyen, gelişimi sırasında tahlil gözlemleyerek zaman testinin yarı-kantitatif versiyonu veya. VEGFR-2, örneğin, VEGF-A, orta, IL-3 ihtiva eden ya da ligand ile inkübe bir deneyde (Şekil 3) bir analizi, VEGFR-2-EPOR-Ba / F3 biyoassay hücrelerinin iyi viyabiliteyi gösterir. Bu hücreler, büyük ve saydam ve kültürde hücre sitoplazma ya da hücre enkaz ayrıntı için hiç ya da çok az kanıt vardır. iyi hiçbir ek büyüme faktörleri ile azalmış hücre sayıları ve birkaç sağlıklı hücrelerin kanıt var zaten. Bu hücreler sitoplazmalarında önemli ayrıntı ve hücre döküntüsü kültürünün tutarlı bir özelliktir. 48 saat sonra canlı hücreler hiçbir iz yoktur.


VEGFR-2-EPOR-Ba / F3 biyoassay ilkelerini anlatan Şekil 1 şematik diyagramı. (A) Ba / F3 hücreleri faktör bağımlı ve bu şekilde bir ekzojen büyüme faktörünü gerektiren, IL-3 ile hücre büyümesi / uygunluğu uyarma endojen IL-3 reseptörleri ve JAK sinyal yolu. EPOR bu hücrelerin kurtarma ifade edilirse, aynı zamanda JAK yolu ile gerçekleşebilir. örneğin VEGFR-2 aktivasyonu akış aşağısında hedefler olarak az sinyallemesinde VEGFR-2 sonuçları gibi tam boyda bir reseptör tirosin kinazın ifadesi JAK yolu olmamaktadır. Ba / F3 hücreleri içine transfekte edilmiş ve zaman EPOR transmembran ve sitoplazmik bölgeleri ile birleştirildiği VEGFR-2'nin hücre dışı bölgesi ile bir kimerik reseptörü, spesifik VEGFR-2 ligandları ile uyarılan, JAK yolu aktive hücreyi tahrik edebilenhayatta kalma ve çoğalma. (B), VEGFR-2-EPOR-Ba / F3 hücreleri akış sitometrisi kullanılarak belirlenebilir kimerik VEGFR-2-EPOR reseptörünün önemli düzeylerde ifade eder. Bir kez IL-3, içeren bir maddenin üzerinden yıkandı, hücreler hücre hayatta kalma / çoğalmasını ya sürücü kültür koşulları, çeşitli yerleştirilir. Untransfected Ba / F3 hücreleri veya VEGFR-2-Epor-Ba / F3 hücreleri belirli büyüme faktörleri olmadan / büyümek hayatta başarısız. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2

Şekil 2, bir fare, VEGFR-2-EPOR kimera ifade VEGFR-2-EPOR-Ba / F3 Biyo., IL-3 bağımlı Ba / F3 hücreleri VEGFR-2 ligand değerlendirilmesi haricinde (IL-3 olmaksızın ortama ekildi için+ IL-3, bir alt kümesi, belirtilen) artı insan VEGF 165 gibi VEGF-CΔNΔC (VC) (bu merkezi bölge oluşur ve N ve C-terminal propeptidlerinin hariç VEGF-C'nin bir şekilde) ya da VEGF-DΔNΔC (bu merkezi bölge içerir ve hariç VEGF-D, bir şekilde, N ve C-terminal propeptidlerinin (VD)) bağlanan ve VEGF-a inhibe 100 ng / ml ve hümanize bir nötrleyici monoklonal antikoru bevasizumab de ( ancak VEGF-C ve VEGF-D) ya da 0.75 uM 'de gösterildiği gibi, antikor, trastuzumab olmayan nötralize edici kontrol eder. hiçbir ek büyüme faktörlerini içeren NF = medium. Kırk sekiz saat sonra, görece canlı hücre sayısı hücresel ATP biyoluminesans bulgulamasına kullanılarak nicelleştirilmiştir. Dikey çubuklar ve üç bağımsız deneyler ortalama standart hata (tek başına VEGF-A 165, ilk bar tepki karşısında normalize) araçları temsil etmektedir. V için tıklayınızBu rakamın daha büyük bir versiyonunu iew.

Şekil 3,

Şekil 3. VEGFR-2-EPOR-Ba / F3 hücreleri, hayatta kalmak için harici Büyüme Faktörleri bağımlıdır. VEGFR-2-EPOR-Ba / F3 biyoassay örnekleri, IL-3 bağımlı Ba / F3 hücreleri fare eksprese VEGFR- 2-EPOR kimera,% 10 WEHI-3B, IL-3, (B) = 100 ng / ml insan VEGF-A 165 (IL-3), veya (C) bir ortam sağlar ortamı içeren şartlandırılmış ortam (A) tohumlanmıştır Resim, IL-3 ya da daha fazla büyüme faktörleri. Kültür, IL-3 (A) ya da VEGF-A 165 (B) 'nin mevcudiyetinde, yüksek canlı hücreleri gösteren testte 24. saat resmedilir Resim, IL-3 ya da ek büyüme faktörleri (C) hücre ölümü ile kültür ve kırmızıuced canlılığı açıkça ortadadır. Çubuklar 100 mikron olan teraziler. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada tarif edilen deney, büyüme faktörleri bağlı olan yüksek canlılığının hücreleri kullanılarak dayanır. Hücreler, bu yüzden faktör bağımlı olmasını sağlamak, ve kimerik reseptörünün ekspresyonunu korumak için dikkatli bir şekilde kültüre edilmesi gerekebilir. orta taze yapılmış ve aşırı uzun süre ve WEHI-3D ​​CM önemli derece aktif olduğunu depolanmaz sağlanması. Hücreler, iyice tahlisiye ligandlarına hücrelerin maruz zaman kalıntı, IL-3 tahlili kontamine olmasını sağlamak için deney ortamına, IL-3 içeren ortamda yıkanabilir gerekir. ligandlar, farklı şekillerde bir dizi gelecek gibi, bakımı deneyleri için bu hazırlanırken alınması gerekir. Koruyucular, anti-bakteriyel ajanlar, tuz ya da farklı pH tamponları tahlil etkileyebilir ve untransfected Ba / F3 hücrelerinin paralel test tamponu ile ilgili konular hakkında bilgilendirmek nedeni budur.

İkimiz de yarı-kantitatif ve kantitatif protokollerini kullanır. yarı kantitatif birziyaretinde deney öncesi daha fazla zaman ve örnek gerektiren tamamen sayısal tahlile işlediği numune aktivitesinin hızlı değerlendirme sağlar. yayın için veri oluştururken nicel yöntem sadece kullanılır. Kültür canlılığını saptanması için alternatif yöntemler nispeten basittir. Kantitatif analiz çoğalmasının ölçülmesi için farklı biçimlerde adapte edilmiştir, ve kullanmıştır (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolyum bromür) MTT 30 hücresel ATP (yayınlanmamış), resazurin bazlı boya (Şekil 2) ve başarı ile, 3H-timidin 31 biyoluminesans bulgulamasına. Son yıllarda biz biyolüminesans yaklaşımları uyum radyasyon kullanımı uzak geliştiğini ve maliyet-etkililik nedeniyle resazurin tabanlı boya kullandık. yaklaşımların hepsi uygun sonuçlar verir ve seçim reaktif kullanılabilirliği ve a bağlı olabilirÖzellikle yaklaşımlar ile verilen bir laboratuvar / enstitü veya aşinalık uzman plaka okuyucular ssociated.

Sorun Giderme testinin üç ana bileşenden, i), IL-3 CM, ii) VEGFR-2-Epor-Ba / F3 hücreleri ve iii) uyarıcı ligandlar faaliyet etrafında döner. nedeniyle ilk kültüründe yetersiz WEHI 3D hücreleri, kötü depolama koşulları, aşırı donma-çözülme döngüleri veya tahlil engel olacaktır kötü büyüyen kültürleri oluşturabilir çok yüksek bir seyreltme kullanarak IL-3 CM Poor seviyeleri. hücre popülasyonlarının normal parlak ve yuvarlak bir görünüm kaybetme, yavaş büyüyen bu genellikle kontrol kuyuları tespit edilir. uzun süre kültür içinde muhafaza edilmesi durumunda VEGFR-2-EPOR-Ba / F3 hücreleri deney zaman kimerik yapının hücre yüzey ekspresyonunu kaybedebilir. sıvı azot stoklarının iyi numaralarını bakımı son derece kimerik reseptörünü ifade eden hücrelerin taze kültürleri her zaman kullanılabilir olmasını sağlar. Gerekirse yüksek popülasyonu olabilirVEGFR-2 ligandları hücrelerin büyümesi ve sıralama flow sitometri ile kimerik reseptörünün yüksek seviyelerde ifade eden popülasyonu seçilerek elde. Bu hücreler daha sonra dondurma kültür içinde genişletilir.

tekniği VEGFR-2 hücre dışı alanı ile etkileşimlerini analiz etmek için uygun ve basit bir alternatif ise primer endotel hücreleri üzerinde yerel reseptörü için diğer VEGFR'yi, ko-reseptörleri, örneğin, mevcudiyetinde incelenir daha gelişmiş deneyler yerine görülemez neuropilins. Bu deney dayandığı hücreler (B hücreleri), endotel hücrelerinden farklı olan ve bu nedenle, endotelyal hücrelerde VEGFR-2 aktivasyonuna yanıt sitoplazmik sinyal yollar ve transkripsiyon faktörlerinin çalışma kullanılmamalıdır. Bununla birlikte, yöntem, hareketsizleştirilmiş recep bir ligand etkileşimini inceleyen bir basit bağlanma tahlilinde arasında uzanan reseptör-ligand etkileşimini analiz etmek için yararlı bir yaklaşım sağlartor ve reseptör analizi ve primer endotel hücrelerine bağlanma tahlilleri görülen alt etkileri (örneğin çözünür bir reseptörü hücre dışı bölgesinin veya immünoglobülin kaynaşmış bir alıcı hücre dışı bölge olarak) oluşturmak. Bu reseptörlerin bağlanma ve çapraz bağlama, ilk iki kademeli olan birçok reseptör-tipi tirosin kinazlar yaygın olarak sinyal iletim akışını başlatabilir izin vermek için bir sistem sağlar. akademik ve ticari bir takım ayarları uygulanışı varyantı ligandlar veya reseptör-ligand etkileşiminin önleyicilerinin değerlendirilmesi, özellikle bu, bağlanma özelliklerini incelemek için yararlı bir tahlil olarak kabul edilen göstermiştir.

Tahlil, aynı zamanda reseptörünün hücre dışı alanının veya bunun ligandları yeni inhibitörleri analizi için yararlıdır. Deney da insan ge bulundu (kalıtsal ve somatik) hızlı bir şekilde genomik mutasyonlar bağlamında da ligandlar ya da reseptörü hücre dışı bölgeleri varyantlarını taranması için kullanılabilirkanser 32,33 gibi hastalıklarda Nes fonksiyonel sonucu belirlenmesi. Bu nedenle, bu VEGFR-2 deneyinde uygulamaları ileride genişletmek muhtemeldir. Bundan başka, bu tahlili temelinde yatan genel yaklaşım daha geniş sağlık ve hastalık sinyal molekülleri büyük ve önemli bir aile oluştururlar, hücre yüzeyi reseptör tirosin kinazlar için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Steven A. İstifleme ve Marc M. Achen Sirkadiyen Technologies Ltd., büyüme faktörleri VEGF ailesi hedefleyerek terapötikler gelişmekte bir şirkette pay sahibi olan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trypan Blue Sigma-Aldrich T8154 0.4% solution in PBS is used 1:1 with cell suspensions to measure viable cells. Hazard-may cause cancer
G418 Sulphate (Geneticin) Invivogen ant-gn-5 Agent for selecting transfected eukaryotic cells. Hazard-may cause allergy or asthma symptoms or breathing difficluties.
3H-Thymidine PerkinElmer NET-027 This radioactive nucleoside is incorporated into chromosomal DNA during mitosis. Hazard-radiation
Vialight Plus Kit Lonza LT07-221 Bioluminescent detection of cellular ATP to quantify viability, using ATP Monitoring Reagent
Prestoblue Cell Viability Reagent Invitrogen A13261 Resazurin-based indicator of cell viability. Turns red in color in the reducing environment of the cell
Nunc Minitray with Nunclon Delta Surface (72 well) Thermo Scientific 136528 Small microtitre plate
96 well Tissue Culture Plate Falcon, Corning Inc. 353072
DMEM (1X) Gibco 11965-92
GlutaMAX (100X) Gibco 35050-061
Fetal Bovine Serum Gibco  10099-141
Cell Harvester Tomtec Life Sciences Tomtec Harvester, 96 Mach 3M Cell Harvester
Liquid Scintillation Counter LKB Wallac 1205 LKB Wallac 1205 Betaplate Scintillation Counter
UniFilter-96 GF/B Perkin Elmer 6005177 White 96-well Barex Microplate with GF/B filterof 1 µm poresize
Gentamicin Gibco, Life Technologies 15750-060
Penicillin/Streptomycin Gibco, Life Technologies 15140-122
0.22 um pore cellulose acetate centrifuge tube filter unit Costar, Corning Inc. 8160 Centrifuge tube filters have a 0.22 µm pore CA membrane-containing filter unit within a 500 µl capacity polypropylene microcentrifuge tube.
Fluorescence Reader BioTek BioTek Synergy 4 Hybrid Microplate Reader 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ferrara, N., Gerber, H. P., LeCouter, J. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med. 9, 669-676 (2003).
  2. Achen, M. G., Stacker, S. A. Vascular endothelial growth factor-D:signalling mechanisms, biology and clinical relevance. Growth Factors. 5, 283-296 (2012).
  3. Ferrara, N., Mass, R. D., Campa, C., Kim, R. Targeting VEGF-A to treat cancer and age-related macular degeneration. Annu Rev Med. 58, 491-504 (2007).
  4. Ferrara, N., Hillan, K. J., Gerber, H. P., Novotny, W. Discovery and development of bevacizumab, an anti-VEGF antibody for treating cancer. Nat Rev Drug Discov. 3, 391-400 (2004).
  5. Korpelainen, E. I., Alitalo, K. Signaling angiogenesis and lymphangiogenesis. Curr Opin Cell Biol. 10, 159-164 (1998).
  6. Senger, D. R., et al. Tumour cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascities fluid. Science. 219, 983-985 (1983).
  7. Joukov, V., et al. A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt-4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases. EMBO J. 15, 290-298 (1996).
  8. Achen, M. G., et al. Vascular endothelial growth factor D (VEGF-D) is a ligand for the tyrosine kinases VEGF receptor 2 (Flk1) and VEGF receptor 3 (Flt4). Proc Natl Acad Sci USA. 95, 548-553 (1998).
  9. Leppanen, V. M., et al. Structural determinants of vascular endothelial growth factor-D receptor binding and specificity. Blood. 117, 1507-1515 (2011).
  10. Wise, L. M., et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF)-like protein from orf virus NZ2 binds to VEGFR2 and neuropilin-1. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 3071-3076 (1999).
  11. Yamazaki, Y., Takani, K., Atoda, H., Morita, T. Snake venom vascular endothelial growth factors (VEGFs) exhibit potent activity through their specific recognition of KDR (VEGF receptor 2). J Biol Chem. 278, 51985-51988 (2003).
  12. Stacker, S. A., Achen, M. G., Jussila, L., Baldwin, M. E., Alitalo, K. Lymphangiogenesis and cancer metastasis. Nat Rev Cancer. 2, 573-583 (2002).
  13. Stacker, S. A., et al. VEGF-D promotes the metastatic spread of tumor cells via the lymphatics. Nat Med. 7, 186-191 (2001).
  14. Skobe, M., et al. Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancer metastasis. Nat Med. 7, 192-198 (2001).
  15. Mandriota, S. J., et al. Vascular endothelial growth factor-C-mediated lymphangiogenesis promotes tumour metastasis. EMBO J. 20, 672-682 (2001).
  16. Stacker, S. A., et al. Lymphangiogenesis and lymphatic vessel remodelling in cancer. Nat Rev Cancer. 14, 159-172 (2014).
  17. Karnezis, T., et al. VEGF-D promotes tumor metastasis by regulating prostaglandins produced by the collecting lymphatic endothelium. Cancer Cell. 21, 181-195 (2012).
  18. Folkman, J. Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 6, 273-286 (2007).
  19. Stacker, S. A., et al. Biosynthesis of vascular endothelial growth factor-D involves proteolytic processing which generates non-covalent homodimers. J Biol Chem. 274, 32127-32136 (1999).
  20. McColl, B. K., et al. Plasmin activates the lymphangiogenic growth factors VEGF-C and VEGF-D. J Exp Med. 198, 863-868 (2003).
  21. Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52, 2745-2756 (1973).
  22. Shibuya, M., Claesson-Welsh, L. Signal transduction by VEGF receptors in regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis. Exp Cell Res. 312, 549-560 (2006).
  23. Pacifici, R. E., Thomason, A. R. Hybrid tyrosine kinase/cytokine receptors transmit mitogenic signals in response to ligand. J Biol Chem. 269, 1571-1574 (1994).
  24. Stacker, S. A., et al. A mutant form of vascular endothelial growth factor (VEGF) that lacks VEGF receptor-2 activation retains the ability to induce vascular permeability. J Biol Chem. 274, 34884-34892 (1999).
  25. Davydova, N., Roufail, S., Streltsov, V. A., Stacker, S. A., Achen, M. G. The VD1 neutralizing antibody to vascular endothelial growth factor-D: binding epitope and relationship to receptor binding. J Mol Biol. 407, 581-593 (2011).
  26. Wise, L. M., et al. Viral vascular endothelial growth factors vary extensively in amino acid sequence, receptor-binding specificities, and the ability to induce vascular permeability yet are uniformly active mitogens. J Biol Chem. 278, 38004-38014 (2003).
  27. Davydova, N., et al. Preparation of human vascular endothelial growth factor-D for structural and preclinical therapeutic studies. Protein Expr. Purif. 82, 232-239 (2012).
  28. Baldwin, M. E., et al. Multiple forms of mouse vascular endothelial growth factor-D are generated by RNA splicing and proteolysis. J. Biol. Chem. 276, 44307-44314 (2001).
  29. Baldwin, M. E., et al. The specificity of receptor binding by vascular endothelial growth factor-D is different in mouse and man. J. Biol. Chem. 276, 19166-19171 (2001).
  30. Makinen, T., et al. Isolated lymphatic endothelial cells transduce growth, survival and migratory signals via the VEGF-C/D receptor VEGFR-3. EMBOJ. 20, 4762-4773 (2001).
  31. Achen, M. G., et al. Monoclonal antibodies to vascular endothelial growth factor-D block its interactions with both VEGF receptor-2 and VEGF receptor-3. Eur J Biochem. 267, 2505-2515 (2000).
  32. Bamford, S., et al. The COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) database and website. Br J Cancer. 91, 355-358 (2004).
  33. Pleasance, E. D., et al. A comprehensive catalogue of somatic mutations from a human cancer genome. Nature. 463, 191-196 (2010).

Tags

Cellular Biology Sayı 109 reseptör VEGF ligand inhibitör sinyal çözünür reseptörler protein büyüme faktörü biyo-deney monoklonal antikor
Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörlerinin Değerlendirilmesi için Basit Biyoassay
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stacker, S. A., Halford, M. M.,… More

Stacker, S. A., Halford, M. M., Roufail, S., Caesar, C., Achen, M. G. A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors. J. Vis. Exp. (109), e53867, doi:10.3791/53867 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter