Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

En simpel Bioassay for Vurdering af Vascular endotelvækstfaktorer

Published: March 15, 2016 doi: 10.3791/53867
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Tumour Angiogenesis Program, Peter MacCallum Cancer Centre

Summary

Vi beskriver en simpel cellebaseret bioassay til påvisning, kvantificering og overvågning af aktiviteten af ​​medlemmer af den vaskulære endotelvækstfaktor familien af ​​ligander. Assayet anvender kimære receptorer udtrykt i en faktor-afhængig cellelinie at tilvejebringe en semi-kvantitativ eller kvantitativ vurdering af receptorbinding og tværbinding af liganden.

Abstract

Analysen af ​​receptortyrosinkinaser og deres vekselvirkende ligander involveret i vaskulær biologi er ofte en udfordring på grund af den konstitutive ekspression af familier af beslægtede receptorer, en bred vifte af beslægtede ligander og vanskeligheden ved at behandle primære kulturer af specialiserede endotelceller. Her beskriver vi en bioassay til påvisning af ligander til det vaskulære endotel vækstfaktorreceptor-2 (VEGFR-2), et centralt transducer af signaler, der fremmer angiogenese og lymfangiogenese. Et cDNA, der koder en fusion af det ekstracellulære (ligandbindende) region VEGFR-2 med de transmembrane og cytoplasmiske regioner af erythropoietin-receptoren (EPOR) udtrykkes i faktor-afhængige cellelinie Ba / F3. Denne cellelinie vokser i nærvær af interleukin-3 (IL-3) og tilbagetrækning af denne faktor resulterer i celledød inden 24 timer. Ekspression af VEGFR-2 / EPOR receptor fusion giver en alternativ mekanisme til at fremme overlevelse og potentially proliferation af stabilt transficerede Ba / F3-celler i nærvær af en ligand, som kan binde og tværbinding den ekstracellulære del af fusionsproteinet (dvs. en, der kan tværbinde VEGFR-2 ekstracellulære region). Assayet kan udføres på to måder: en semi-kvantitativ tilgang, hvor små volumener af ligand og cellerne tillader et hurtigt resultat i 24 timer, og en kvantitativ fremgangsmåde involverer surrogatmarkører for en levedygtige celler. Assayet er relativt let at udføre, er yderst reagerer på kendte VEGFR-2-ligander og kan rumme ekstracellulære inhibitorer af VEGFR-2 signalering såsom monoklonale antistoffer mod receptoren eller ligander, og opløselige ligand fælder.

Introduction

Det vaskulære endotel vækstfaktor (VEGF) familie af udskilte protein vækstfaktorer og deres beslægtede celleoverfladereceptorer er en vigtig og forskelligartet gruppe af opløselige ligander og membran-embedded receptorer, henholdsvis den funktion på transduktion signaler over cellulære membraner. De fungerer hovedsagelig i endotelceller, men også i celler af epitelial oprindelse og dem af immunsystemet 1,2. Signalveje engageret af ligand-aktiverede VEGF-receptorer (VEGFRs) er kritiske i større patologier, såsom aldersrelateret maculadegeneration og cancer, og terapeutiske målretning dem er i hyppig klinisk anvendelse (f.eks det monoklonale antistof bevacizumab som retter sig mod VEGF-A) 3,4.

En af kompleksiteten i VEGF familien er mangfoldigheden af ​​opløselige ligander til stede i naturen (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF proteiner kodet af parapox virus familien orf og slangegift VEGF, plus andre hæmmendeisoformer af VEGF-A) 2.

Disse ligander interagerer med tre medlemmer af receptortyrosinkinase-familien, nemlig VEGFR-1, VEGFR-2 og VEGFR-3. Disse receptorer er variabelt udtrykkes på forskellige celletyper, men er ofte co-udtrykkes på overfladen af endotelceller, der beklæder blod- og lymfekar i alle størrelser 5. VEGFR-2 kan binde pattedyr ligander VEGF-A 6, VEGF-C 7 og VEGF-D 8,9 samt orf virus VEGF 10 og slangegift VEGF 11. VEGFR-2 spiller en vigtig rolle som drivkraft angiogenese (vækst af nye blodkar fra allerede eksisterende fartøjer) af fosterudviklingen, sårheling, cancer og øjensygdomme. I disse sammenhænge, ​​ligander, såsom VEGF-A, -C og -D binder og aktiverer receptoren på blod vaskulære endotelceller 12-15. På lymfatiske endotelceller, VEGFR-2 spiller en rolle i lymfangiogenese, dannelsen af nye lymfekar 16. VEGFR-2 kan også fremme dilatation og udvidelse af store arterier og lymfekarrene i raske væv og sygdomme 17. En fuldstændig forståelse af VEGFR-2: ligand interaktioner er derfor vigtigt for udviklingen af inhibitorer til anvendelse ved behandling angiogeneseafhængige sygdomme 18. Mens de fleste isoformer af VEGF-A binder til VEGFR-2 er proteolytisk spaltning af VEGF-C og VEGF-D kræves for at frigive et fragment bestående af VEGF-homologi domæne, der udviser høj affinitetsbinding til VEGFR-2 19,20.

Vi har udviklet en bioassay til overvågning ligander af VEGFR-2, der er designet til at omgå behovet for primære endotelceller, som er teknisk vanskeligt at passage, dyrt at købe og kultur (kræver specialiseret medium) 21 og udtrykke flere VEGFRs og tilhørende samarbejde receptorer 22. Heterodimerisering af VEGFR-2 med andre VEGF-receptorer eller co-receptorer kan forårsage uønsket kompleksitet, når der sigtes til study binære receptor-ligand-interaktioner, evaluering aktivitet henføres til en specifik receptor, eller vurdering af effekten af inhiberende reagenser. 23. Bioassayet bevarer mobilitet den relevante receptor i cellemembranen og tillader evaluering af en ligand evne til at binde og tværbinde VEGFR-2 ekstracellulære region.

Bioassayet er afhængig af skabelsen af ​​en kimerisk receptor, hvor den ekstracellulære region af en VEGF-receptor (i dette tilfælde VEGFR-2) er fusioneret til det transmembrane og intracellulære regioner af erythropoietin-receptoren (EPOR), et medlem af cytokinreceptorfamilien 8,24. Dette fusionsprotein udtrykkes derefter i faktor-afhængige pro-B-cellelinje Ba / F3, hvorpå stimulering med en ligand, som kan binde og tværbinding det ekstracellulære domæne af receptoren forårsager aktivering af den cytoplasmiske effektor region, som er i stand af transducere en overlevelse signal via Janus kinaser (Jaks) for at fremme celleoverlevelse og / eller proliferation. I modsætning hertil ekspression af fuldlængde VEGFR-2 i samme celletype, og stimulering med liganden, ikke fremmer celleoverlevelse og proliferation, hvilket viser, at de proximale signalering effektorer af VEGFR-2 reaktionsvejen er ikke tilgængelige i denne celletype.

Vi har brugt assayet i forskellige sammenhænge til at udforske binding af hidtil ukendte VEGFR-2 ligander 10,19,20,24-29. I kombination med en VEGFR-3-EPOR-Ba / F3-assay, har vi sammenlignet de relative aktiviteter af VEGF-C og VEGF-D vækstfaktorer for binding og tværbinding VEGFR-2 og VEGFR-3 30. Assayet er blevet anvendt til at karakterisere den inhiberende aktivitet af neutraliserende monoklonale antistoffer til VEGFR-2 eller VEGF-D, opløselig VEGFR-2 fælde og peptidefterligninger rettet mod VEGF-familien 31. Assayet blev også anvendt til at vise evnen hos VEGF'erne fra forskellige orf virusstammer til at binde og tværbinde VEGFR-2 før afprøvning i primære endotelceller 25 eller ved vurderingen protokoller for oprensning af vækstfaktorer 27.

Assayet beskriver vi er let at udføre, og den semikvantitative versionen giver mulighed for hurtig bestemmelser, der undertiden nødvendige, når overvågning af produktionen eller oprensning af vækstfaktorer, antistoffer eller opløselige receptor-domæner for andre eksperimenter. Brugervenligheden af ​​analysen gør det til et ideelt supplement til yderligere og mere komplette studier udført med primære endotelceller på basis af blod eller lymfekar fra bestemte væv eller organsystemer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Kilde til IL-3 og Udarbejdelse af WEHI-3D-conditioned Medium

Bemærk: Musen granulocytisk leukæmi cellelinie WEHI-3D ​​dyrkes til at frembringe et konditioneret medium indeholdende IL-3.

  1. Kultur WEHI-3D ​​i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM), 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% langtidsholdbar glutamin supplement, 50 ug / ml gentamicin. Der podes 5 × 10 6 celler i log-fase af vækst i 50 ml frisk dyrkningsmedium i en T175 cm3 vævsdyrkningskolbe og vokse i omkring 7 dage eller indtil cellerne har bestået deres log-fase af vækst ved omkring 24 - 48 timer (undgå overdreven celledød i kultur). Konditionerede medier er i stand til at blive opbevaret i flere år ved -20 ° C, så partier af 200 - 500 ml kan fremstilles på én gang.
  2. Dekanteres væske og celler fra kolber og centrifugering ved 1.000 x g i 15 minutter til fjernelse af celler og cellerester. Fjern det øverste 90% af supernatant. Der filtreres gennem et 0,22 um filterenhed.
  3. Alikvot WEHI-3D ​​konditioneret medium (CM) i 1 ml, 50 ml og 200 ml volumener til opbevaring ved -20 ° C eller -70 ° C. Mindre portioner er nyttige til assay forberedelse, mellemliggende volumener til fremstilling dyrkningsmedium til passage af faktor-afhængige cellelinier, og større volumener til langtidsopbevaring. IL-3 er relativt stabil ved 4 ° C så optøet medium kan opbevares i nogle få uger, hvis de anvendes under sterile betingelser.
  4. Alternativt, benytte rekombinant muse IL-3 ved niveauer på 50 ng / ml fortyndet i dyrkningsmedium, efter at være blevet filtreret gennem et 0,22 um filterenhed.

2. Kultur og Evaluering af VEGFR-2-EPOR-Ba / F3 og Kontrol Ba / F3 cellelinier

  1. Kultur kontrol Ba / F3-celler i DMEM, 10% FBS, 50 ug / ml gentamicin eller penicillin / streptomycin supplement, 1% stabiliseret L-glutamin og 10% WEHI-3D-CM. Passage celler på 1:15 fortyndinger hver tredje dag fra cellervokser i log-fase.
  2. Kultur VEGFR2-EPOR-Ba / F3-celler i DMEM, 10% FBS, 50 ug / ml gentamycin, 1% stabiliseret L-glutamin og 10% WEHI-3D-CM og 1 mg / ml G418. Passage cellerne ved 1:15 fortyndinger fra celler, der vokser i log-fase. Se 24 for flere detaljer om konstruktionen og ekspressionen af den kimære receptor.
  3. Harvest kontrol Ba / F3 eller VEGFR2-EPOR-Ba / F3-celler fra midten log-fase kulturer. pipettere forsigtigt for at fjerne disse ikke-adhærente celler fra bunden af ​​kolben. Der vaskes tre gange i muse tonicitet phosphatbufret saltvand, pH 7,3 (PBS), (10 ml, centrifugeres ved 750 x g i 5 minutter for at inddrive cellepellet) for at fjerne medium indeholdende IL-3.
  4. Vask cellerne en gang med DMEM og additiver, uden at WEHI-3D-CM eller rekombinant IL-3 og derefter resuspenderes i dette medium i en koncentration på 7,4 x 10 4 celler / ml (dvs. 1.000 celler pr 13,5 pi; 10.000 celler pr 135 pi som bestemt ved tælling under anvendelse af et hæmocytometer) tilbrug i de semikvantitative eller kvantitative versioner af analysen hhv.
  5. Vurdere celler til levedygtighed ved trypanblåt udstødelse (ADVARSEL). Bland trypanblåt i PBS (0,4%) 1: 1 med cellepopulationen og tælle mindst 100 celler på et hæmocytometer. Celler, der optager farvestoffet anses døde eller døende. Levedygtighed over 98% er påkrævet for at udføre analysen.

3. Semikvantitativ Assay

  1. Tilføj vaskede celler (1.000 celler) indeholdt i 13,5 pi IL-3-deficient medium til brøndene i en 72-brønds plade med mikrobrønde ved stuetemperatur. Vær omhyggelig med at blande cellesuspensionen under aliquotting at sikre celle afvikling af tyngdekraften ikke gør skævhed cellekoncentrationen. Brug et godt kalibreret P20 automatiseret pipette, og autoklaveres tips.
  2. Tilføj testprøver og kontroller til brøndene ved 10% volumen (1,5 pi, hvilket gør et slutvolumen på 15 pi indeholdende 1.000 celler pr brønd) under anvendelse af en kalibreret P20 pipette eller fortrinsvis P2 pipette. Tag care at sikre, at prøverne er forenelige med dyrkningsbetingelser for Ba / F3-celler i form af pH, salt og andre potentielt cytotoksiske / cytostatiske stoffer. Hvor det er muligt, skal du bruge et kompatibelt medium eller buffer (f.eks DMEM eller PBS, henholdsvis) eller fortyndet i en sådan medium eller buffer. Triturering med samme spids vil sikre blanding.
  3. For kontrolprøver, omfatter (i) medium alene indeholdende ingen IL-3; (Ii) WEHI-3BD-CM tilsat til medium alene ved 10% slutvolumen; og / eller (iii) VEGF-A fortyndet til 100 ng / ml i medium alene, uden indhold af IL-3.
  4. Fyld eventuelle ubrugte brønde i mikrobrøndsplade med sterilt vand, PBS eller medium og placere pladen inden en fugtig container (med vand gennemblødt silkepapir) tillader gasudveksling. Inkuber celler inden beholderne i en fugtig atmosfære af 10% CO2. Dette assay kan være komfortabelt oprettet i 3 timer af en person, hvis testprøver og medier komponenter er tilgængelige.
  5. Vurdere plader typisk efter 16 timer afinkubation ved hvilken diskriminering tid mellem positive og negative prøver er indlysende. Se figur 3 for eksempler på, hvordan celler vises i kultur. Analyser plader ved hjælp af en standard omvendt fase-kontrast mikroskop ved 40-100 × forstørrelse.
    Bemærk: Wells indeholdende støttende vækstfaktorer, såsom IL-3 eller VEGF-A vil indeholde celler, som synes runde og gennemskinnelige. Brønde uden understøttende vækstfaktorer eller med medium alene vil have reduceret antal af runde celler, såvel som døde eller døende celler og cellerester (f.eks, figur 3C). Evaluering assayet ved 24-48 timer efter inkubering er den optimale for følsomhed.

4. Kvantitativ bioassay

  1. Tilføj vaskede celler (10.000 celler i 135 pi) i IL-3-deficient medium til brøndene i en standard 96-brønds mikrotiterplade ved stuetemperatur. Vær omhyggelig med at blande cellesuspensionen under aliquotting at sikre celle afvikling af tyngdekraften påvirker ikke cell koncentration.
  2. Tilføj testprøver og kontroller til brøndene ved 10% volumen (15 pi) ved anvendelse af en kalibreret pipette (P20). Vær omhyggelig med at sikre, at prøverne er forenelige med dyrkningsbetingelser for Ba / F3-celler i form af pH, salt eller andre potentielt cytotoksiske / cytostatiske stoffer. Hvor det er muligt, skal du bruge et kompatibelt medium eller buffer (f.eks., DMEM eller PBS) eller fortyndet i en sådan medium eller buffer. Filtersteriliser små volumener under anvendelse af en 0,22 um pore celluloseacetat centrifugerør filterenhed.
  3. Inkuber blandingen af celler, vækstfaktorer og / eller inhibitor midler i en fugtig atmosfære af 10% CO2 i 48 timer. Udføre analysen i en befugtet beholder, der har vand-gennemvædet filtrerpapir og tillader gas-udveksling. Ved afslutningen af ​​inkubationsperioden, evaluere assay under anvendelse af en af ​​de alternative metoder er anført nedenfor som er surrogatmarkører for antallet af levedygtige celler i brønden.
  4. Alternativ # 1: 3 H-thymidine Indbygning
    Bemærk: Denne kvantificering er beregnet til 96-brønds pladeformat.
    1. Efter inkubering af assayplader i 48 timer ved 37 ° C (150 pi volumen per brønd), tilsættes 3H-thymidin i et volumen på 50 pi assaymedium (Ba / F3 dyrkningsmedium uden IL-3 / WEHI-3D ​​CM) per brønd ved en koncentration på 20 uCi / ml, hvilket giver en endelig dosis på 1 uCi per brønd.
    2. Pladerne inkuberes i yderligere 4 timer ved 37 ° C før høst celler under anvendelse af en cellehøster. Uddrag individuelle prøver ved at placere filtrene i scintillationsvæske og kvantificering med en væskescintillationstæller.
  5. Alternativ # 2: Bioluminescens Detection for Cellulær ATP
    Bemærk: Denne fremgangsmåde anvender en ATP overvågning reagens, som, når det kombineres med cellelysatet kan generere en bioluminescens signal, som afspejler de levedygtige celler i populationen.
    1. Lyserer celler til at udtrække ATP og bruge en ATP Monitoring Reagent at generere enluminescerende signal i overensstemmelse med producentens anvisninger. Læs luminescens under anvendelse af et luminometer forenelig med en 96-brønds pladeformat.
  6. Alternativ # 3: Enzymatisk Reduktion af en indikator Dye af levedygtige celler
    Bemærk: Resazurin baserede assays viser god korrelation til cellelevedygtighed.
    1. Kombiner dyrkede celler med resazurin baseret farvestof og kvantificere assays ved anvendelse af en fluorescenspladelæser ifølge producentens anvisninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I dette afsnit viser vi resultaterne af et eksperiment demonstrerer de væsentlige elementer i en VEGFR-2-EPOR-Ba / F3-bioassay (se figur 1 for principperne i assay). Andre offentliggjorte undersøgelser viser bredere anvendelse af analysen for alternative VEGFR-2-ligander, muterede VEGF molekyler og hæmmende monoklonale antistoffer 8,10,19,24-30.

De præsenterede data repræsenterer et assay, hvori VEGFR-2-EPOR-Ba / F3-bioassay anvendes til at kvantificere aktiviteten af de tre rekombinante humane ligander (VEGF-A 165, VEGF-C og VEGF-D) med specificitet for VEGFR -2 i nærvær af et inhibitorisk monoklonalt antistof (bevacizumab) til VEGF-A 165. data er normaliseret versus respons på VEGF-A 165 alene (figur 2). Som forventet bevacizumab blokeret virkningen af VEGF-A 165 i assayet, menhavde ingen virkning på aktiviteten af ​​VEGF-C og VEGF-D.

I semi-kvantitativ version af assayet eller når observere assayet under udviklingen, visning assayet anvendelse af et standard omvendt fase mikroskop kan give værdifuld information om forløbet af assayet. En analyse af et assay (figur 3) viser den gode levedygtighed VEGFR-2-EPOR-Ba / F3 bioassay celler, når inkuberet med medium indeholdende IL-3, eller ligand for VEGFR-2, fx VEGF-A. Disse celler er store og gennemskinnelige, og der er ingen eller minimal tegn på granularitet i det cellulære cytoplasma eller cellerester i kulturen. I brønden uden yderligere vækstfaktorer der allerede er konstateret af reducerede celleantal og få sunde celler. Celler til stede har betydelig granularitet i deres cytoplasma og cellerester er et gennemgående træk i kulturen. Efter 48 timer er der ingen tegn på levedygtige celler.


Figur 1. Skematisk diagram Beskriver principperne for VEGFR-2-EPOR-Ba / F3-bioassay. (A) Ba / F3-celler er faktor-afhængige og kræver en eksogen vækstfaktor, såsom IL-3 til at stimulere cellevækst / levedygtighed via endogene IL-3 receptorer og JAK signalvejen. Hvis EPOR udtrykkes i disse celler redning kan også forekomme via JAK-vejen. Ekspression af en fuld-længde receptortyrosinkinase såsom VEGFR-2 resultater i minimal signalering downstream mål for VEGFR-2-aktivering ikke engagere JAK-vejen. En kimær receptor med den ekstracellulære region af VEGFR-2 fusioneret til de transmembrane og cytoplasmiske regioner i EPOR, når det transficeres ind i Ba / F3-celler og stimuleret med specifikke VEGFR-2 ligander, er stand til at aktivere JAK-vejen og kørsel celleoverlevelse og proliferation. (B) VEGFR-2-EPOR-Ba / F3-celler udtrykker signifikante niveauer af det kimære VEGFR-2-EPOR receptor, som kan kvantificeres ved anvendelse af flowcytometri. Når vasket ud af IL-3, der indeholder medium, anbringes celler i en række forskellige dyrkningsbetingelser, som driver enten overlevelse / proliferation af celler. Utransficerede Ba / F3-celler eller VEGFR-2-EPOR-Ba / F3-celler uden specifikke vækstfaktorer ikke vokser / overleve. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2

Figur 2. Evaluering af VEGFR-2 ligander i de VEGFR-2-EPOR-Ba / F3-bioassay. IL-3-afhængige Ba / F3-celler, der udtrykker et muse VEGFR-2-EPOR kimæren blev podet i medium uden IL-3 (undtagen tilden + IL-3 delmængde, som indikeret) plus human VEGF-A 165, VEGF-CANAC (VC) (dette er en form for VEGF-C, der består af den centrale region og udelukker N- og C-terminale propeptider), eller VEGF-DANAC (dette er en form for VEGF-D, som omfatter det centrale område og udelukker N- og C-terminale propeptider (VD)) ved 100 ng / ml og humaniseret neutraliserende monoklonalt antistof bevacizumab (som binder og inhiberer VEGF-a, men ikke VEGF-C eller VEGF-D), eller kontrol-ikke-neutraliserende antistof trastuzumab, som angivet ved 0,75 uM. NF = medium indeholdende ingen yderligere vækstfaktorer. Otteogfyrre timer senere blev relativ levende celletal kvantificeret ved anvendelse bioluminescens påvisning af cellulær ATP. Lodrette søjler repræsenterer midler (normaliseret versus respons på VEGF-A 165 alene, første bar) og standardafvigelse af gennemsnittet af tre uafhængige forsøg. Klik her for at view en større version af dette tal.

Figur 3

Figur 3. VEGFR-2-EPOR-Ba / F3 Celler er afhængige af ekstern vækstfaktorer for overlevelse. Eksempler på VEGFR-2-EPOR-Ba / F3 bioassay, hvor IL-3-afhængige Ba / F3-celler, der udtrykker en mus VEGFR- 2-EPOR kimæren blev podet i medium (A) indeholdende 10% WEHI-3D ​​konditioneret medium, der giver IL-3, (B) 100 ng / ml human VEGF-A 165 (ingen IL-3), eller (C) medium med ingen IL-3 eller yderligere vækstfaktorer. Kultur er afbildet 24 timer i assayet viser stærkt levedygtige celler i nærværelse af IL-3 (A) eller VEGF-A 165 (B), hvorimod i kulturen uden IL-3 eller yderligere vækstfaktorer (C) celledød og røduced levedygtighed er tydelige. Scales barer er 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den her beskrevne assay er afhængig af at bruge celler af høj levedygtighed, som er afhængige af vækstfaktorer. Celler skal derfor være omhyggeligt dyrket for at sikre, at de er faktor-afhængige, og fastholde udtryk for kimære receptor. Sikring af, at mediet er frisk gjort og ikke opbevares i alt for lang periode, og at WEHI-3D ​​CM er meget aktiv er vigtig. Celler skal vaskes grundigt fra IL-3-holdigt medium i assaymediet at sikre, at ingen residual IL-3 forurener testen, når udsættelse af cellerne for redning ligander. Som ligander kan komme i en række forskellige former, skal tages, når forberedelse af analysering pleje. Konserveringsmidler, antibakterielle midler, salt eller buffere med forskellig pH kan påvirke assayet, og det er derfor parallel prøvning af utransficerede Ba / F3-celler kan oplyse buffer- emner.

Vi bruger både de semikvantitative og kvantitative protokoller. Den semi-quantitative analysen muliggør en hurtig vurdering af aktiviteten af ​​prøverne forud for at forpligte sig til en fuldt kvantitativ assay, som kræver mere tid og prøve. Den kvantitative metode kan udelukkende bruges ved generering af data til offentliggørelse. De alternative metoder til påvisning af levedygtigheden af ​​kulturen er relativt ligetil. Den kvantitative assay er blevet tilpasset til en række forskellige formater til kvantificering af proliferation, og vi har brugt (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid) MTT 30, bioluminescens påvisning af cellulær ATP (upubliceret), resazurin-baseret farvestof (figur 2) og 3H-thymidin 31 med succes. I de seneste år har vi udviklet væk fra brugen af ​​stråling til at tilpasse bioluminescens tilgange og har brugt resazurin-baserede farvestof på grund af sin omkostningseffektivitet. Alle fremgangsmåder giver passende resultater og valget kan afhænge af tilgængeligheden af ​​reagenser og enssociated specialiserede plade læsere i en given laboratorium / institut eller fortrolighed med bestemte metoder.

Fejlmelding kredser om aktiviteten af ​​tre hovedkomponenter i assayet, i) IL-3 CM, ii) VEGFR-2-EPOR-Ba / F3-celler og iii) stimulerende ligander. Dårlige niveauer af IL-3 i CM grund af utilstrækkelige WEHI 3D celler i den oprindelige kultur, dårlige opbevaringsbetingelser, overdrevne fryse-optøningscykler eller ved anvendelse ved en for høj en fortynding kan skabe dårligt voksende kulturer, der vil hæmme assayet. Dette er normalt påvises i kontrolbrønde som cellepopulationer vokser langsomt, mister deres normale lyse og runde udseende. VEGFR-2-EPOR-Ba / F3-assay celler kan miste celleoverfladeekspression af det kimære konstrukt over tid, hvis de holdes i kultur i længere perioder. Opretholdelse gode numre af flydende nitrogen bestande giver friske cellekulturer stærkt udtrykker den kimære receptor at være til rådighed på alle tidspunkter. Hvis det kræves en højt udtrykkende population kan væreopnås ved dyrkning af celler i VEGFR-2-ligander og vælge befolkningen udtrykker høje niveauer af det kimære receptor ved flowcytometri sortering. Disse celler bliver derefter yderligere udvidet i kultur til frysning.

Mens teknikken er en praktisk og forenklet alternativ til analyse interaktioner med VEGFR-2 ekstracellulært domæne kan det ikke ses at erstatte mere sofistikerede eksperimenter, hvor den native receptor på primære endotelceller probet i nærvær af andre VEGFRs, co-receptorer, såsom neuropilins. Cellerne, som dette assay bygger på (B-celler) er forskellige fra endotelceller og bør derfor ikke anvendes til at studere de cytoplasmatiske signalveje og transkriptionsfaktorer, som reagerer på VEGFR-2-aktivering i endotelceller. Alligevel tilvejebringer fremgangsmåden en nyttig metode til at analysere receptor-ligand-interaktion, der ligger mellem en simpel bindingsassay der undersøger interaktion mellem en ligand med et immobiliseret receptor konstruere (såsom en opløselig receptor ekstracellulære region eller en receptor ekstracellulære region fusioneret til immunglobulin), og analysen af ​​receptorbinding og efterfølgende virkninger konstateret i bindingsassays til primære endotelceller. Det tilvejebringer et system til at muliggøre binding og tværbinding af receptorer, de to første etaper i mange receptor-type tyrosinkinaser almindeligvis indlede deres signaltransduktionskaskade. Dens anvendelse i en række akademiske og kommercielle indstillinger har vist det er accepteret som et nyttigt assay for behandlingen bindingskarakteristika, især ved evaluering variant ligander eller inhibitorer af receptor-ligand interaktion.

Assayet er ligeledes nyttig til analyse af nye inhibitorer af receptorens ekstracellulære domæne eller dets ligander. Assayet der yderligere kan anvendes til hurtigt at screene varianter af ligander eller receptor ekstracellulære regioner set i forbindelse med genomiske mutationer (både arvet og somatisk) fundet i human genes i sygdomme, såsom cancer 32,33 at bestemme deres funktionelle konsekvens. Derfor er tilbøjelige til at ekspandere i fremtiden ansøgningerne fra denne VEGFR-2-analysen. Endvidere kan den generelle aspekter ved dette assay anvendes mere bredt til celleoverfladereceptoren tyrosinkinaser, som udgør en stor og vigtig familie af signalmolekyler i sundhed og sygdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Steven A. Stacker og Marc M. Achen er aktionærer i Circadian Technologies Ltd., en virksomhed, der udvikler lægemidler ved at målrette VEGF-familien af ​​vækstfaktorer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trypan Blue Sigma-Aldrich T8154 0.4% solution in PBS is used 1:1 with cell suspensions to measure viable cells. Hazard-may cause cancer
G418 Sulphate (Geneticin) Invivogen ant-gn-5 Agent for selecting transfected eukaryotic cells. Hazard-may cause allergy or asthma symptoms or breathing difficluties.
3H-Thymidine PerkinElmer NET-027 This radioactive nucleoside is incorporated into chromosomal DNA during mitosis. Hazard-radiation
Vialight Plus Kit Lonza LT07-221 Bioluminescent detection of cellular ATP to quantify viability, using ATP Monitoring Reagent
Prestoblue Cell Viability Reagent Invitrogen A13261 Resazurin-based indicator of cell viability. Turns red in color in the reducing environment of the cell
Nunc Minitray with Nunclon Delta Surface (72 well) Thermo Scientific 136528 Small microtitre plate
96 well Tissue Culture Plate Falcon, Corning Inc. 353072
DMEM (1X) Gibco 11965-92
GlutaMAX (100X) Gibco 35050-061
Fetal Bovine Serum Gibco  10099-141
Cell Harvester Tomtec Life Sciences Tomtec Harvester, 96 Mach 3M Cell Harvester
Liquid Scintillation Counter LKB Wallac 1205 LKB Wallac 1205 Betaplate Scintillation Counter
UniFilter-96 GF/B Perkin Elmer 6005177 White 96-well Barex Microplate with GF/B filterof 1 µm poresize
Gentamicin Gibco, Life Technologies 15750-060
Penicillin/Streptomycin Gibco, Life Technologies 15140-122
0.22 um pore cellulose acetate centrifuge tube filter unit Costar, Corning Inc. 8160 Centrifuge tube filters have a 0.22 µm pore CA membrane-containing filter unit within a 500 µl capacity polypropylene microcentrifuge tube.
Fluorescence Reader BioTek BioTek Synergy 4 Hybrid Microplate Reader 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ferrara, N., Gerber, H. P., LeCouter, J. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med. 9, 669-676 (2003).
  2. Achen, M. G., Stacker, S. A. Vascular endothelial growth factor-D:signalling mechanisms, biology and clinical relevance. Growth Factors. 5, 283-296 (2012).
  3. Ferrara, N., Mass, R. D., Campa, C., Kim, R. Targeting VEGF-A to treat cancer and age-related macular degeneration. Annu Rev Med. 58, 491-504 (2007).
  4. Ferrara, N., Hillan, K. J., Gerber, H. P., Novotny, W. Discovery and development of bevacizumab, an anti-VEGF antibody for treating cancer. Nat Rev Drug Discov. 3, 391-400 (2004).
  5. Korpelainen, E. I., Alitalo, K. Signaling angiogenesis and lymphangiogenesis. Curr Opin Cell Biol. 10, 159-164 (1998).
  6. Senger, D. R., et al. Tumour cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascities fluid. Science. 219, 983-985 (1983).
  7. Joukov, V., et al. A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt-4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases. EMBO J. 15, 290-298 (1996).
  8. Achen, M. G., et al. Vascular endothelial growth factor D (VEGF-D) is a ligand for the tyrosine kinases VEGF receptor 2 (Flk1) and VEGF receptor 3 (Flt4). Proc Natl Acad Sci USA. 95, 548-553 (1998).
  9. Leppanen, V. M., et al. Structural determinants of vascular endothelial growth factor-D receptor binding and specificity. Blood. 117, 1507-1515 (2011).
  10. Wise, L. M., et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF)-like protein from orf virus NZ2 binds to VEGFR2 and neuropilin-1. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 3071-3076 (1999).
  11. Yamazaki, Y., Takani, K., Atoda, H., Morita, T. Snake venom vascular endothelial growth factors (VEGFs) exhibit potent activity through their specific recognition of KDR (VEGF receptor 2). J Biol Chem. 278, 51985-51988 (2003).
  12. Stacker, S. A., Achen, M. G., Jussila, L., Baldwin, M. E., Alitalo, K. Lymphangiogenesis and cancer metastasis. Nat Rev Cancer. 2, 573-583 (2002).
  13. Stacker, S. A., et al. VEGF-D promotes the metastatic spread of tumor cells via the lymphatics. Nat Med. 7, 186-191 (2001).
  14. Skobe, M., et al. Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancer metastasis. Nat Med. 7, 192-198 (2001).
  15. Mandriota, S. J., et al. Vascular endothelial growth factor-C-mediated lymphangiogenesis promotes tumour metastasis. EMBO J. 20, 672-682 (2001).
  16. Stacker, S. A., et al. Lymphangiogenesis and lymphatic vessel remodelling in cancer. Nat Rev Cancer. 14, 159-172 (2014).
  17. Karnezis, T., et al. VEGF-D promotes tumor metastasis by regulating prostaglandins produced by the collecting lymphatic endothelium. Cancer Cell. 21, 181-195 (2012).
  18. Folkman, J. Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 6, 273-286 (2007).
  19. Stacker, S. A., et al. Biosynthesis of vascular endothelial growth factor-D involves proteolytic processing which generates non-covalent homodimers. J Biol Chem. 274, 32127-32136 (1999).
  20. McColl, B. K., et al. Plasmin activates the lymphangiogenic growth factors VEGF-C and VEGF-D. J Exp Med. 198, 863-868 (2003).
  21. Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52, 2745-2756 (1973).
  22. Shibuya, M., Claesson-Welsh, L. Signal transduction by VEGF receptors in regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis. Exp Cell Res. 312, 549-560 (2006).
  23. Pacifici, R. E., Thomason, A. R. Hybrid tyrosine kinase/cytokine receptors transmit mitogenic signals in response to ligand. J Biol Chem. 269, 1571-1574 (1994).
  24. Stacker, S. A., et al. A mutant form of vascular endothelial growth factor (VEGF) that lacks VEGF receptor-2 activation retains the ability to induce vascular permeability. J Biol Chem. 274, 34884-34892 (1999).
  25. Davydova, N., Roufail, S., Streltsov, V. A., Stacker, S. A., Achen, M. G. The VD1 neutralizing antibody to vascular endothelial growth factor-D: binding epitope and relationship to receptor binding. J Mol Biol. 407, 581-593 (2011).
  26. Wise, L. M., et al. Viral vascular endothelial growth factors vary extensively in amino acid sequence, receptor-binding specificities, and the ability to induce vascular permeability yet are uniformly active mitogens. J Biol Chem. 278, 38004-38014 (2003).
  27. Davydova, N., et al. Preparation of human vascular endothelial growth factor-D for structural and preclinical therapeutic studies. Protein Expr. Purif. 82, 232-239 (2012).
  28. Baldwin, M. E., et al. Multiple forms of mouse vascular endothelial growth factor-D are generated by RNA splicing and proteolysis. J. Biol. Chem. 276, 44307-44314 (2001).
  29. Baldwin, M. E., et al. The specificity of receptor binding by vascular endothelial growth factor-D is different in mouse and man. J. Biol. Chem. 276, 19166-19171 (2001).
  30. Makinen, T., et al. Isolated lymphatic endothelial cells transduce growth, survival and migratory signals via the VEGF-C/D receptor VEGFR-3. EMBOJ. 20, 4762-4773 (2001).
  31. Achen, M. G., et al. Monoclonal antibodies to vascular endothelial growth factor-D block its interactions with both VEGF receptor-2 and VEGF receptor-3. Eur J Biochem. 267, 2505-2515 (2000).
  32. Bamford, S., et al. The COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) database and website. Br J Cancer. 91, 355-358 (2004).
  33. Pleasance, E. D., et al. A comprehensive catalogue of somatic mutations from a human cancer genome. Nature. 463, 191-196 (2010).

Tags

Cellular Biology Receptor VEGF ligand inhibitor signalering opløselige receptorer protein-vækstfaktor bioassay monoklonalt antistof
En simpel Bioassay for Vurdering af Vascular endotelvækstfaktorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stacker, S. A., Halford, M. M.,… More

Stacker, S. A., Halford, M. M., Roufail, S., Caesar, C., Achen, M. G. A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors. J. Vis. Exp. (109), e53867, doi:10.3791/53867 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter