Mouse ultrasonic vocalizations are used as proxies to model the genetic bases of vocal communication deficits in mouse models for neuropsychiatric disorders. The present protocol describes three experimental contexts that reliably elicit ultrasonic vocalizations from pups (throughout development) and adult mice (same-sex interactions, male-estrus female interactions).
Mice emit ultrasonic vocalizations in different contexts throughout development and in adulthood. These vocal signals are now currently used as proxies for modeling the genetic bases of vocal communication deficits. Characterizing the vocal behavior of mouse models carrying mutations in genes associated with neuropsychiatric disorders such as autism spectrum disorders will help to understand the mechanisms leading to social communication deficits. We provide here protocols to reliably elicit ultrasonic vocalizations in pups and in adult mice. This standardization will help reduce inter-study variability due to the experimental settings. Pup isolation calls are recorded throughout development from individual pups isolated from dam and littermates. In adulthood, vocalizations are recorded during same-sex interactions (without a sexual component) by exposing socially motivated males or females to an unknown same-sex conspecific. We also provide a protocol to record vocalizations from adult males exposed to an estrus female. In this context, there is a sexual component in the interaction. These protocols are established to elicit a large amount of ultrasonic vocalizations in laboratory mice. However, we point out the important inter-individual variability in the vocal behavior of mice, which should be taken into account by recording a minimal number of individuals (at least 12 in each condition). These recordings of ultrasonic vocalizations are used to evaluate the call rate, the vocal repertoire and the acoustic structure of the calls. Data are combined with the analysis of synchronous video recordings to provide a more complete view on social communication in mice. These protocols are used to characterize the vocal communication deficits in mice lacking ProSAP1/Shank2, a gene associated with autism spectrum disorders. More ultrasonic vocalizations recordings can also be found on the mouseTube database, developed to favor the exchange of such data.
Pasienter med nevropsykiatriske lidelser vanligvis vise underskudd i sosial kommunikasjon (for eksempel pasienter med autismespekterforstyrrelser, schizofreni, eller Alzheimers sykdom) 1. Genmodifisert mus mer og mer hyppig brukt til å modellere genetiske årsaker til disse lidelsene 2. Studerer sosial kommunikasjon i disse musemodeller er av stor interesse for å forstå mekanismene for genetiske mutasjoner som fører til atypiske sosiale dysfunksjoner og for utprøving av nye behandlingsformer. Siden mus er sosiale dyr og kommunisere med hverandre ved hjelp av lukte, taktile, visuelle og akustiske signaler, de er egnede modeller for å evaluere sosial kommunikasjon.
Muse ultralyd vocalizations er nå i dag brukt som en proxy for å modellere de genetiske grunnlaget for stemmekommunikasjons underskudd 3,4 (men eksistensen av vokal læring i denne arten er fortsatt debattert 5,6, selv om de fleste nyere studier argue for fraværet av vokal læring 7). Laboratoriet mus har blitt funnet å avgi ultralydvokaliseringer i mor-spedbarn relasjoner, i mann-kvinne sosio-seksuelle interaksjoner, i samme kjønn sosiale interaksjoner (anmeldt i referanse 8) og i ungdoms-ungdoms sosiale interaksjoner 9. Muse valper avgir isolasjon samtaler i løpet av sine to første ukene av livet da isolert fra demningen og kullsøsken 10. Hanner avgir ultralyd lyder når du er i nærvær av en estrus kvinnelig (eller urin signaler fra henne) 11,12. Menn og kvinner avgir ultralyd vokalisering når vi samhandler med en ukjent conspecific av samme kjønn 13,14. Organisasjonen og funksjonene til disse lyder er ikke helt klare, og trenger nærmere undersøkelser. Nåværende kunnskap om det funksjonelle aspektet er begrenset til utløsning av henting atferd hos mødre høre valpen isolasjon samtaler, tilrettelegging av nærhet til voksne kvinner mot voksen hann vocalizationer 15 og den økte utforskende oppførsel av voksne menn hørsels voksne kvinnelige vokaliseringer 16.
Karakterisere unormalt i vokal kommunikasjon i musemodeller av nevropsykiatriske lidelser bør gjennomføres i standardiserte forhold for å utelukke stort bidrag av forsøksbetingelsene. Slike karakteristikker, kombinert med evalueringen av samtidige sosiale interaksjoner og nevrobiologiske studier, i ulike genetiske modeller bør forbedre vår kunnskap om den genetiske bidrag til de forskjellige aspektene av mus ultralyd kommunikasjon. Over en lang sikt, bør det gi ytterligere lys over noen nevrobiologiske grunnlaget for sosial kommunikasjon hos mennesker. Vi i dag tar sikte på å gi enkle protokoller for pålitelig lokke fram ultralyd lyder under utvikling og i voksen alder for både mannlige og kvinnelige mus i laboratoriet. Slike protokoller bør lette standardisering av opptakene for å sammenligne mer pålitelig UltrAsonic vokaliseringskommandoer utslipp mellom stammer og laboratorier. Det bør også legge til rette for etablering av slike opptak i laboratorier har ingen tidligere erfaring med muse ultralyd lyder opptak. Vi markerer også gjeldende muligheten til å kombinere ultralyd lyder data med detaljerte atferds data samlet inn samtidig i løpet av sosiale interaksjoner i voksen mus, for å få viktig informasjon om sosiale vansker så vel som på sammenheng med utslipp av ultralyd lyder. Slike analyser vil kaste nytt lys over organisering og funksjoner av muse ultralyd lyder. Til slutt, vi annonserer også muligheten til å dele ultralyd vokaliseringskommandoer opptak med hele forskningsmiljøet på mouseTube database (http://mousetube.pasteur.fr). Åpen tilgang til lydopptak data skal øke kunnskapen om mus ultralyd kommunikasjon ved å tillate forskere å sammenligne sine egne data med ultralyd lyder tatt opp i andre Laborier (med tilsvarende eller forskjellige stammer / protokoller), og / eller for å utfordre sine analysemetoder med filer tatt opp under forskjellige forhold.
Protokollen presenteres her gir standardiserte og pålitelige måter å samle muse ultralyd lyder i laboratoriet. Disse meget begrensede situasjoner presentere fordelen av standardisering. De brukes med hell til å sammenligne stammer eller genotyper innen stammer 18,19,26,27. Som presentert i de representative resultater, disse metodene tillater identifisering av atypisk sosial kommunikasjon i mus muterte for Shank2, et gen assosiert med autismespekterforstyrrelser. Sammenligninger mellom musestammer, mellom ulike kontekster eller mellom laboratorier vil bli utløst av tilgjengeligheten av større datasett på mouseTube database. Dette verktøyet bør øke studier på mus med ultralyd lyder ved at multivariate analyser.
Protokollen beskrevet her, er optimalisert for å teste mus av forskjellige genotyper i en stamme, som det er gjort i de fleste studier modellere den genetiske contribution til nevropsykiatriske lidelser. Det anbefales å eksperimentelt designe hver undersøkelse å ha de beste kontrollene mulig. Faktisk kan søppel effekter maskere eller kunstig blåse genetiske effekter 28,29. Det er derfor tilrådelig å inkludere kull kontroller for hver genotype. Avl heterozygote foreldre bør derfor foretrekkes, fordi det vil tillate riktig matching av muterte og kontroll mus i et kull. Dette begrunner pote tatovering merking av alle valpene (blindet for genotype) for å spore individer gjennom opptakene hver dag. Genotyping utføres ved avvenning, ved å ta haleprøver. Når du tar opp valpen isolasjon samtaler fra P2 på, vil vi ikke anbefale å ta halen prøver allerede i unger, siden denne operasjonen omfatter supplerende manipulasjon og stress svært nær i tid til et opptak.
Protokollene som foreslås her å lokke fram ultralydvokaliseringer hos voksne tillater ikke entydig identifisering av emitter av lyder. Dette forklarer hvorfor vi manipulere motivasjon av forsøksdyr. Faktisk er testmusene isolert og ikke den ny-comer og testdyrene tilvenne for en lang tid på prøve buret i løpet av samme kjønn interaksjoner. I mann-kvinne interaksjoner, er det innført kvinnelig ikke isolert og testen mannlige habituates for kortere tid siden motivasjon kan være høyere i denne seksuell sammenheng. Disse manipulasjoner av motivasjon bør maksimere sannsynligheten for test musen emitting de lyder og ikke innført ett. For å ta opp mannlige ultralyd lyder i en seksuell sammenheng, kan en enkel bomullsdott med fersk (dvs. ikke frosne) urin fra en estrus kvinnelig også bli innført i buret 30. Denne metoden gjør at tildeling av ultrasoniske lyder på prøve hannhund med 100% sikkerhet, men det hindrer innsamling av noen spesifikk informasjon om den faktiske sosiale sammenheng med utslipp av disse lyder. Derfor foretrekker vi den protokollen,l beskrevet her (med et fritt bevegelige brunst kvinne). Vi anbefaler også å alltid bruke innført mus fra samme stamme når du tester mus fra en mutant belastning og for å analysere dataene som et par mus vocalizing. En fersk studie fremmer bruk av triangulering å lokalisere emitter 31. I denne studien ble kvinner funnet å også avgir ultralyd lyder under møter med en mannlig. Dette kan forklares ved det faktum at de ble isolert i minst to uker før innspillingen. Generalisering av bruken av triangulering foreslått i denne studien bør likevel tillate identifikasjon av emitteren av de lyder i de fleste tilfeller om video-opptak er riktig synkronisert.
Isolasjons samtaler fra valpene er tatt under utvikling blir ikke forstyrret av bakgrunnsstøy fra sengetøy. Vanligvis en automatisk analyse fungerer veldig bra for å trekke ut de viktigste variablene. I kontrast, lyder spilt inn fra voksne er disturbed av bakgrunnsstøy fra dyrene beveger seg i sengetøy. Automatisk analyse kan mislykkes, og derfor bør brukes manuell analyse. Likevel legger sengetøy i testen bur bør gi forhold som er mindre stressende for dyrene enn nakne jord (som mus ikke liker). Ytterligere innsats i samfunnet er konsentrert på å forbedre automatisk registrering av ultrasoniske lyder under ulike forhold, selv de som innebærer bakgrunnsstøy. For eksempel lar stemmen programvare for å analysere lyder som hadde blitt valgt for fravær av bakgrunnsstøy 32 manuelt. I denne programvaren, er utvinning av de akustiske variablene automatisk, men trenger den innledende manuelt valg.
Det skal bemerkes at den interindividuell variasjon er meget viktig i den vokale oppførselen til mus. For eksempel er det takst av voksne menn i nærvær av en estrus kvinnelig svært fordelt (Figur 1). Vi suggest disse standardiserte protokoller for å frembringe ultrasoniske vokaliseringer allerede å begrense variasjonen i forbindelse med den eksperimentelle sammenheng. Likevel ønsker vi å påpeke viktigheten av å presentere ikke bare gjennomsnitt og SEM for data, men viktigst de enkelte punktene i prøver av liten størrelse 33. Det er også svært relevant – om ikke nødvendig – for å spille minst 12 personer i hver gruppe / genotype å samle representative data. I mange tilfeller bør den inter-individuelle variabiliteten ikke skjules (vanligvis det ikke kan være), og det kan være av stor betydning for å identifisere enkeltpersoner som bærer genetisk mutasjon studert, men ikke viser noe atypisk fenotype. Slike personer kan gi hint om kompensasjon, som kan åpne nye veier for behandling av genetiske sykdommer.
I de fleste atferds karakterisering av musemodeller for nevropsykiatriske lidelser, vokal atferd og sosiale kontakter er vurdereed hverandre (for eksempel 19,27,34,35). Nye analysemetoder nå gi en halvautomatisk detaljert karakterisering av de sosiale arrangementer og sekvenser av hendelser i løpet av en interaksjon (ved hjelp MiceProfiler for eksempel) 36, samt muligheten til å kombinere denne analysen med data fra lydopptak. Den største fordelen med denne metoden er å gi et helhetlig syn på sosial kommunikasjon i musemodeller av ASD, mer presist identifisere hvilke aspekter av sosial kommunikasjon er berørt. I den foreliggende protokoll synkroniseringen er fortsatt manuell, men dette kan forbedres ved å utløse videoopptak gjennom lydopptak programvare. Denne typen analyser bør bli standard for å gi et mer helhetlig syn på sosial kommunikasjon underskudd i musemodeller av nevropsykiatriske lidelser. I tillegg har opp til nå, stemmesignaler blir stort sett analysert fra emitter side (dvs. testene er bygget for å favorisere utslipp av vocal signaler ved testet mus, som i dagens protokoller). Fokuset skal nå også settes på mottakeren av disse signalene, for å bedre identifisere funksjonene til disse akustiske signaler. Dette bør gjøres ved å evaluere også atferden til ny-comer mus i dagens protokoller hos voksne (med MiceProfiler for eksempel) 36, ved hjelp av avspillings eksperimenter 16, eller ved å sette opp nye protokoller. Faktisk dagens protokoller gir svært begrenset situasjoner som kanskje ikke reflekterer den nøyaktige etologiske forhold vokalisering utslipp i mus. Den spontane utslipp av ultralyd lyder må bedre karakterisert ved hjelp av kontinuerlig lyd- og videoopptak for å kaste mer lys over den spontane vokale atferd mus.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Fondation de France; by the ANR FLEXNEURIM [ANR09BLAN034003]; by the ANR [ANR- 08-MNPS-037-01-SynGen]; by Neuron-ERANET (EUHF-AUTISM); by the Fondation Orange; by the Fondation FondaMentale; by the Fondation de France; by the Fondation Bettencourt-Schueller. The research leading to this article has also received support from the Innovative Medicine Initiative Joint Undertaking under grant agreement no. 115300, resources of which are composed of financial contribution from the European Union’s Seventh Framework Program (FP7/2007-2013) and EFPIA companies’ in kind contribution. We thank Julie Lévi-Strauss for helpful comments on the manuscript and six anonymous reviewers whose comments noticeably improved the manuscript.
needles 0.3 x 13 mm [30G 1/2"] | BD Microlance | 304000 | – |
green tattoo paste | Ketchum Manufacturing Inc., Ottawa, Canada | 329AA | – |
thermometer | Fisherbrand, Waltham, USA | 4126 (W255NA) | – |
self-made soundproof chamber (pups) | Institut Pasteur, Paris | – | acoustic foam + plexiglas; inside dimensions (W x H x D): 32 x 33 x 32 cm |
small surface thermister + single probe thermocouple | Harvard Apparatus | 599814 + 601956 | – |
smell-less pen | for instance: Giotto | – | ink made with water, washable: these pens are designed for babies |
Ethanol absolute (100%) | Sigma Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France | 24103 | diluted 1/10 |
Condenser ultrasound microphone Avisoft-Bioacoustics CM16/CMPA | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #40011 | furnished with extension cables by the Avisoft company |
Ultrasound Gate 416H | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #34163 | sound card |
Avisoft Recorder USGH | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #10301; #10302 | recording software for Windows Vista, 7 and 8 |
Avisoft SASLab Pro | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #10101, 10111; #10102, 10112; | Windows 10, 8.1, 8, 7 or Vista including Intel-based Apple Macintosh running Boot Camp, Parallels or similar virtualization software. |
Laptop or Apple Macintosh running Boot Camp | – | – | running Windows 10, 8.1, 8, 7 or Vista; for the Apple Macintosh, Boot Camp is preferred to virtualizations softwares such as Parallels due to memory constraints |
plastic recipient (pup recordings) | Lock & Lock, Chatswood, USA | HPL932D | Lock & Lock Stackable Airtight Container Round 700ml; use without the cover; dimensions: 9 cm diameter, 10 cm height |
PBS 1X (pH=7.4) | Gibco (Life Technologies) | 10010-023 | – |
slides | Menzel-Gläser, Thermo Scientific | J1800AMNZ | Superfrost Plus |
May-Grünwald solution 500 ml | RAL Réactifs, Martillac, France | 320070-0500 | – |
Giemsa R 500 ml | RAL Réactifs, Martillac, France | 720-1107 | diluted 1/20 in phosphate buffer solution |
phosphate buffer solution (self-made) | – | – | pH=7, 0.1 M: 39 ml NaH2PO4 0.2 M + 61 ml Na2HPO4 0.2 M + 100 ml H2O (final volume: 200 ml) |
test cage | Institut Pasteur, Paris | – | 50 x 25 cm, 30 cm height; Plexiglas |
self-made soundproof chamber (adult recordings) | Institut Pasteur, Paris | – | acoustic foam + PVC; inside dimensions (W x H x D): 66 x 90 x 46 cm |
video camera | From Noldus Information Technologies, Wageningen, The Netherlands | – | high-resolution CamTech Super-Hi-Res video camera; 25 fps |
EthoVision XT | Noldus Information Technology, Wageningen, The Netherlands | http://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt | video acquisition software |
Mice Profiler Tracker plugin from the ICY platform | Bio Image Analysis, Institut Pasteur, Paris | http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Mice_Profiler_Tracker | tracking software to analyse behavioral events during social interactions |