Mouse ultrasonic vocalizations are used as proxies to model the genetic bases of vocal communication deficits in mouse models for neuropsychiatric disorders. The present protocol describes three experimental contexts that reliably elicit ultrasonic vocalizations from pups (throughout development) and adult mice (same-sex interactions, male-estrus female interactions).
Mice emit ultrasonic vocalizations in different contexts throughout development and in adulthood. These vocal signals are now currently used as proxies for modeling the genetic bases of vocal communication deficits. Characterizing the vocal behavior of mouse models carrying mutations in genes associated with neuropsychiatric disorders such as autism spectrum disorders will help to understand the mechanisms leading to social communication deficits. We provide here protocols to reliably elicit ultrasonic vocalizations in pups and in adult mice. This standardization will help reduce inter-study variability due to the experimental settings. Pup isolation calls are recorded throughout development from individual pups isolated from dam and littermates. In adulthood, vocalizations are recorded during same-sex interactions (without a sexual component) by exposing socially motivated males or females to an unknown same-sex conspecific. We also provide a protocol to record vocalizations from adult males exposed to an estrus female. In this context, there is a sexual component in the interaction. These protocols are established to elicit a large amount of ultrasonic vocalizations in laboratory mice. However, we point out the important inter-individual variability in the vocal behavior of mice, which should be taken into account by recording a minimal number of individuals (at least 12 in each condition). These recordings of ultrasonic vocalizations are used to evaluate the call rate, the vocal repertoire and the acoustic structure of the calls. Data are combined with the analysis of synchronous video recordings to provide a more complete view on social communication in mice. These protocols are used to characterize the vocal communication deficits in mice lacking ProSAP1/Shank2, a gene associated with autism spectrum disorders. More ultrasonic vocalizations recordings can also be found on the mouseTube database, developed to favor the exchange of such data.
Los pacientes con trastornos neuropsiquiátricos suelen mostrar déficits en la comunicación social (por ejemplo, los pacientes con trastornos del espectro del autismo, la esquizofrenia o la enfermedad de Alzheimer) 1. Modificaron genéticamente ratones son cada vez más frecuentemente utilizados para modelar las causas genéticas de estos trastornos 2. El estudio de la comunicación social en estos modelos de ratón es de gran interés para la comprensión de los mecanismos de mutaciones genéticas que conducen a disfunciones sociales atípicas y para probar nuevas terapias. Dado que los ratones son animales sociales y se comunican entre otros usando olfativo, táctil, señales visuales y acústicas, que son modelos adecuados para evaluar la comunicación social.
Vocalizaciones ultrasónicas ratón ahora se utilizan actualmente como un proxy para el modelado de las bases genéticas de déficit de comunicación vocal 3,4 (pero la existencia de aprendizaje vocal en esta especie aún se debate 5,6, aunque la mayoría de los estudios recientes ARGUe por la ausencia de aprendizaje vocal 7). Los ratones de laboratorio se han encontrado para emitir vocalizaciones ultrasónicas en las relaciones madre-hijo, en las interacciones socio-sexuales entre hombres y mujeres, en las interacciones sociales del mismo sexo (revisado en referencia 8) y en las interacciones sociales juveniles-juvenil 9. Las crías de ratón emiten llamadas de aislamiento durante sus dos primeras semanas de vida cuando se aíslan de la presa y sus compañeros de camada 10. Los machos emiten vocalizaciones ultrasónicas cuando está en presencia de una hembra estro (o señales urinarios de ella) 11,12. Los machos y las hembras emiten vocalización ultrasónica al interactuar con una misma especie desconocida del mismo sexo 13,14. La organización y funciones de estas vocalizaciones no son del todo claras y necesitan más investigaciones. El conocimiento actual sobre el aspecto funcional se limita a la obtención de un comportamiento de recuperación en las madres escuchar las llamadas de aislamiento de las crías, la facilitación de la proximidad de las hembras adultas hacia vocalizat varón adultoiones 15 y el aumento de la conducta exploratoria de los varones adultos auditivos para adultos vocalizaciones femeninas 16.
La caracterización de las alteraciones en la comunicación vocal en modelos de ratón de los trastornos neuropsiquiátricos debe llevarse a cabo en condiciones estandarizadas para descartar la importante contribución de las condiciones experimentales. Tales caracterizaciones, en combinación con la evaluación de las interacciones sociales simultáneas y estudios neurobiológicos, en diferentes modelos genéticos deberían mejorar nuestro conocimiento sobre la contribución genética a los diferentes aspectos de la comunicación ultrasónica del ratón. Durante un largo plazo, debe dar más luz sobre algunas bases neurobiológicas de la comunicación social en los seres humanos. actualmente Nuestro objetivo es proporcionar protocolos sencillos para obtener de forma fiable las vocalizaciones ultrasónicas durante el desarrollo y en la edad adulta, tanto para ratones macho y hembra en el laboratorio. Dichos protocolos deberían facilitar la normalización de las grabaciones para comparar de manera más fiable ultrlas emisiones de vocalización Asonic entre las cepas y laboratorios. También debería facilitar la creación de tales grabaciones en laboratorios que no tienen experiencia previa con vocalizaciones ultrasónicas grabaciones de ratón. También destacamos la posibilidad actual para combinar los datos de vocalizaciones ultrasónicas con los datos detallados de comportamiento recogidos de forma simultánea durante las interacciones sociales en ratones adultos, para obtener información crucial sobre deficiencias sociales, así como en el contexto de la emisión de vocalizaciones ultrasónicas. Tales análisis arrojen nueva luz sobre la organización y funciones de las vocalizaciones ultrasónicas de ratón. Por último, también publicidad de la posibilidad de compartir las grabaciones de vocalización ultrasónica con toda la comunidad científica sobre la base de datos mouseTube (http://mousetube.pasteur.fr). El acceso abierto a los datos de grabación de audio debe aumentar el conocimiento sobre la comunicación ultrasónica del ratón, permitiendo a los científicos comparar sus propios datos con vocalizaciones ultrasónicas registradas en otras laboratorios (con cepas / protocolos similares o diferentes), y / o para desafiar a sus métodos de análisis con archivos grabados en diferentes condiciones.
El protocolo presentado aquí proporciona formas estandarizadas y fiables para recoger las vocalizaciones ultrasónicas de ratones en el laboratorio. Estas situaciones muy restringidas presentan la ventaja de la normalización. Se utilizan con éxito para comparar cepas o genotipos dentro de cepas 18,19,26,27. Como se presenta en los resultados representativos, estos métodos permiten la identificación de la comunicación social atípica en ratones mutados para SHANK2, un gen asociado con trastornos del espectro autista. Las comparaciones entre las cepas de ratón, entre los diferentes contextos o incluso entre laboratorios se desencadenan por la disponibilidad de grandes conjuntos de datos en la base de datos mouseTube. Esta herramienta debería impulsar estudios sobre las vocalizaciones ultrasónicas ratón, permitiendo el análisis multivariado.
Los protocolos descritos aquí están optimizados para poner a prueba los ratones de diferentes genotipos dentro de una cepa, como se hace en la mayoría de los estudios de modelado de la c genéticaONTRIBUCIÓN a los trastornos neuropsiquiátricos. Se recomienda diseñar cada estudio experimental para tener los mejores controles posibles. De hecho, los efectos de camada pueden enmascarar o artificialmente inflar efectos genéticos 28,29. Por tanto, es aconsejable incluir controles de la misma camada para cada genotipo. Por lo tanto, la cría de los padres heterocigotos se debe favorecer, ya que permitirá la correcta adecuación de los ratones mutantes y de control dentro de una camada. Esto justifica el marcado de todos los cachorros del tatuaje de la pata (sin conocer el genotipo) para realizar un seguimiento de las personas a través de las grabaciones cada dos días. El genotipado se realiza en el destete, tomando muestras de la cola. Al grabar las llamadas de aislamiento de las crías en P2, que no recomendaría la toma de muestras de la cola ya en las crías, ya que esta operación incluye la manipulación adicional y el estrés muy cerca en el tiempo para una sesión de grabación.
Los protocolos sugeridos aquí para provocar vocalizaciones ultrasónicas en los adultos no permite una identificación clara de la EMItter de las vocalizaciones. Esto explica por qué manipulamos la motivación del animal de ensayo. De hecho, los ratones de prueba están aislados y no el recién llegado y los animales de ensayo se habitúan durante mucho tiempo a la jaula de prueba durante las interacciones del mismo sexo. En las interacciones hombre-mujer, la hembra introducido no es aislado y el macho se habitúa prueba por el tiempo más corto ya que la motivación podría ser mayor en este contexto sexual. Estas manipulaciones de la motivación deben maximizar la probabilidad de que el ratón de prueba de emisión de las vocalizaciones y no la introducida. Para grabar vocalizaciones ultrasónicas macho en un contexto sexual, un hisopo de algodón sencilla con la orina (es decir, no congelado) fresco de una hembra estro también se puede introducir en la jaula 30. Este método permite la asignación de vocalizaciones ultrasónicas a la masculina prueba con 100% de certeza pero impide recoger cualquier información específica sobre el contexto social actual de emisión de estas vocalizaciones. Por lo tanto, estamos a favor de la protocol describe aquí (con una hembra estro libremente en movimiento). También recomendamos utilizar siempre los ratones introducido de la misma cepa al probar los ratones de una cepa mutante y analizar los datos como un par de ratones que vocalizan. Un estudio reciente promueve el uso de la triangulación para localizar el emisor 31. En este estudio, se encontró que las hembras también para emitir vocalizaciones ultrasónicas durante los encuentros con un macho. Esto podría explicarse por el hecho de que se aislaron durante al menos dos semanas antes de la sesión de grabación. Sin embargo, la generalización del uso de la triangulación propuesto en este estudio debe permitir la identificación del emisor de las vocalizaciones en la mayoría de los casos, si las grabaciones de vídeo se sincronizan correctamente.
Las llamadas de aislamiento de cachorros registrados durante el desarrollo no se vean perturbadas por el ruido de fondo de la ropa de cama. Por lo general, un análisis automático funciona muy bien para extraer las variables principales. Por el contrario, las vocalizaciones grabadas de los adultos son disturbed por el ruido de fondo de los animales que se mueven en la ropa de cama. Análisis automático puede fallar, y por lo tanto el análisis manual debe ser utilizado. Sin embargo, la adición de ropa de cama en la jaula de ensayo deberá proporcionar condiciones que son menos estresante para los animales que el suelo desnudo (que los ratones no les gusta). Más esfuerzos en la comunidad se concentran en mejorar la detección automática de vocalizaciones ultrasónicas en diversas condiciones, incluso aquellas que implican ruidos de fondo. Por ejemplo, el software de voz permite analizar las vocalizaciones que habían sido seleccionados de forma manual por la ausencia de ruido de fondo 32. En este software, la extracción de las variables acústicas es automática sino que necesita la selección manual inicial.
Cabe señalar que la variabilidad inter-individual es muy importante en el comportamiento vocal de los ratones. Por ejemplo, el tipo de interés de los hombres adultos en presencia de una hembra estro está muy distribuido (Figura 1). nos Doggest estos protocolos estandarizados para provocar vocalizaciones ultrasónicas ya de limitar la variabilidad relacionada con el contexto experimental. Sin embargo, nos gustaría señalar la importancia de presentar no sólo la media y SEM para los datos, pero lo más importante los puntos individuales en muestras de pequeño tamaño 33. También es muy relevante – si no es necesario – para registrar al menos 12 individuos de cada grupo / genotipo para reunir datos representativos. En muchos casos, la variabilidad interindividual no debe ser ocultada (por lo general no puede ser), y que podría ser de gran importancia para identificar a las personas que llevan la mutación genética estudiada pero no exhiben ningún fenotipo atípico. Tales individuos podrían proporcionar pistas sobre las compensaciones, lo que podría abrir nuevas vías para tratamientos de trastornos genéticos.
En la mayoría de las caracterizaciones del comportamiento de los modelos de ratón para los trastornos neuropsiquiátricos, comportamiento vocal y contactos sociales son considerared aparte (por ejemplo, 19,27,34,35). Métodos de análisis recientes proporcionan ahora una caracterización detallada semi-automático de los eventos sociales y secuencias de eventos durante una interacción (usando MiceProfiler por ejemplo) 36, así como la posibilidad de combinar este análisis con datos de grabaciones de audio. La principal ventaja de este método es proporcionar una visión global de la comunicación social en modelos de ratón de TEA, para identificar con mayor precisión lo que se ven afectados los aspectos de la comunicación social. En el presente protocolo de la sincronización es todavía manual, pero esto puede ser mejorado mediante la activación de la grabación de vídeo a través del software de grabación de audio. Este tipo de análisis debe convertirse en el estándar para proporcionar una visión más completa de los déficits de comunicación social en modelos de ratón de los trastornos neuropsiquiátricos. Además, hasta ahora, las señales vocales se analizan sobre todo desde el lado emisor (es decir, las pruebas se construyen para favorecer la emisión de voseñales de cal por el ratón probado, como en los protocolos actuales). La atención debe centrarse ahora también se puede ajustar en el receptor de estas señales, para identificar mejor las funciones de estas señales acústicas. Esto debe hacerse mediante la evaluación también el comportamiento de los ratones nuevos productores en los protocolos actuales en adultos (usando MiceProfiler por ejemplo) 36, mediante el uso de experimentos de reproducción 16, o mediante la creación de nuevos protocolos. De hecho, los protocolos actuales proporcionan situaciones muy restringidas que podrían no reflejar las condiciones etológicas exactas de las emisiones de vocalización en ratones. La emisión espontánea de vocalizaciones ultrasónicas tendrá que ser mejor caracterizados usando grabaciones de audio y de video continuo para arrojar más luz sobre el comportamiento vocal espontánea de ratones.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Fondation de France; by the ANR FLEXNEURIM [ANR09BLAN034003]; by the ANR [ANR- 08-MNPS-037-01-SynGen]; by Neuron-ERANET (EUHF-AUTISM); by the Fondation Orange; by the Fondation FondaMentale; by the Fondation de France; by the Fondation Bettencourt-Schueller. The research leading to this article has also received support from the Innovative Medicine Initiative Joint Undertaking under grant agreement no. 115300, resources of which are composed of financial contribution from the European Union’s Seventh Framework Program (FP7/2007-2013) and EFPIA companies’ in kind contribution. We thank Julie Lévi-Strauss for helpful comments on the manuscript and six anonymous reviewers whose comments noticeably improved the manuscript.
needles 0.3 x 13 mm [30G 1/2"] | BD Microlance | 304000 | – |
green tattoo paste | Ketchum Manufacturing Inc., Ottawa, Canada | 329AA | – |
thermometer | Fisherbrand, Waltham, USA | 4126 (W255NA) | – |
self-made soundproof chamber (pups) | Institut Pasteur, Paris | – | acoustic foam + plexiglas; inside dimensions (W x H x D): 32 x 33 x 32 cm |
small surface thermister + single probe thermocouple | Harvard Apparatus | 599814 + 601956 | – |
smell-less pen | for instance: Giotto | – | ink made with water, washable: these pens are designed for babies |
Ethanol absolute (100%) | Sigma Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France | 24103 | diluted 1/10 |
Condenser ultrasound microphone Avisoft-Bioacoustics CM16/CMPA | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #40011 | furnished with extension cables by the Avisoft company |
Ultrasound Gate 416H | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #34163 | sound card |
Avisoft Recorder USGH | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #10301; #10302 | recording software for Windows Vista, 7 and 8 |
Avisoft SASLab Pro | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #10101, 10111; #10102, 10112; | Windows 10, 8.1, 8, 7 or Vista including Intel-based Apple Macintosh running Boot Camp, Parallels or similar virtualization software. |
Laptop or Apple Macintosh running Boot Camp | – | – | running Windows 10, 8.1, 8, 7 or Vista; for the Apple Macintosh, Boot Camp is preferred to virtualizations softwares such as Parallels due to memory constraints |
plastic recipient (pup recordings) | Lock & Lock, Chatswood, USA | HPL932D | Lock & Lock Stackable Airtight Container Round 700ml; use without the cover; dimensions: 9 cm diameter, 10 cm height |
PBS 1X (pH=7.4) | Gibco (Life Technologies) | 10010-023 | – |
slides | Menzel-Gläser, Thermo Scientific | J1800AMNZ | Superfrost Plus |
May-Grünwald solution 500 ml | RAL Réactifs, Martillac, France | 320070-0500 | – |
Giemsa R 500 ml | RAL Réactifs, Martillac, France | 720-1107 | diluted 1/20 in phosphate buffer solution |
phosphate buffer solution (self-made) | – | – | pH=7, 0.1 M: 39 ml NaH2PO4 0.2 M + 61 ml Na2HPO4 0.2 M + 100 ml H2O (final volume: 200 ml) |
test cage | Institut Pasteur, Paris | – | 50 x 25 cm, 30 cm height; Plexiglas |
self-made soundproof chamber (adult recordings) | Institut Pasteur, Paris | – | acoustic foam + PVC; inside dimensions (W x H x D): 66 x 90 x 46 cm |
video camera | From Noldus Information Technologies, Wageningen, The Netherlands | – | high-resolution CamTech Super-Hi-Res video camera; 25 fps |
EthoVision XT | Noldus Information Technology, Wageningen, The Netherlands | http://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt | video acquisition software |
Mice Profiler Tracker plugin from the ICY platform | Bio Image Analysis, Institut Pasteur, Paris | http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Mice_Profiler_Tracker | tracking software to analyse behavioral events during social interactions |