Mouse ultrasonic vocalizations are used as proxies to model the genetic bases of vocal communication deficits in mouse models for neuropsychiatric disorders. The present protocol describes three experimental contexts that reliably elicit ultrasonic vocalizations from pups (throughout development) and adult mice (same-sex interactions, male-estrus female interactions).
Mice emit ultrasonic vocalizations in different contexts throughout development and in adulthood. These vocal signals are now currently used as proxies for modeling the genetic bases of vocal communication deficits. Characterizing the vocal behavior of mouse models carrying mutations in genes associated with neuropsychiatric disorders such as autism spectrum disorders will help to understand the mechanisms leading to social communication deficits. We provide here protocols to reliably elicit ultrasonic vocalizations in pups and in adult mice. This standardization will help reduce inter-study variability due to the experimental settings. Pup isolation calls are recorded throughout development from individual pups isolated from dam and littermates. In adulthood, vocalizations are recorded during same-sex interactions (without a sexual component) by exposing socially motivated males or females to an unknown same-sex conspecific. We also provide a protocol to record vocalizations from adult males exposed to an estrus female. In this context, there is a sexual component in the interaction. These protocols are established to elicit a large amount of ultrasonic vocalizations in laboratory mice. However, we point out the important inter-individual variability in the vocal behavior of mice, which should be taken into account by recording a minimal number of individuals (at least 12 in each condition). These recordings of ultrasonic vocalizations are used to evaluate the call rate, the vocal repertoire and the acoustic structure of the calls. Data are combined with the analysis of synchronous video recordings to provide a more complete view on social communication in mice. These protocols are used to characterize the vocal communication deficits in mice lacking ProSAP1/Shank2, a gene associated with autism spectrum disorders. More ultrasonic vocalizations recordings can also be found on the mouseTube database, developed to favor the exchange of such data.
Patienter med neuropsykiatriska funktionsnedsättningar visar vanligtvis underskott i social kommunikation (t.ex. patienter med autismspektrumstörningar, schizofreni, eller Alzheimers sjukdom) 1. Genetiskt modifierade möss allt oftare används för att modellera genetiska orsakerna till dessa sjukdomar 2. Studera social kommunikation i dessa musmodeller är av stort intresse för att förstå mekanismerna för genetiska mutationer som leder till atypiska sociala dysfunktioner och för att testa nya terapier. Eftersom möss är sociala djur och kommunicerar med varandra med hjälp av lukt, taktil, visuella och akustiska signaler, de är lämpliga modeller för att utvärdera social kommunikation.
Mus ultraljud vocalizations nu för närvarande används som en proxy för att modellera de genetiska grunderna för talkommunikation underskott 3,4 (men förekomsten av sång lärande i denna art är fortfarande diskuteras 5,6, även om de flesta nya studier argUe för frånvaron av vokala inlärning 7). Laboratoriemöss har visat sig avge ultraljud vocalizations i mor-spädbarn relationer, i män och kvinnor socio sexuella interaktioner i samkönade sociala interaktioner (översikt i referens 8) och juvenil juvenil sociala interaktioner 9. Mus valpar avger isolerings samtal under de första två veckorna i livet när isolerade från dammen och syskon 10. Manlig avger ultraljud läten när i närvaro av en brunst kvinnliga (eller urin signaler från henne) 11,12. Hanar och honor avger ultraljuds läte när de interagerar med en okänd conspecific av samma kön 13,14. Organisationen och funktioner av dessa vocalizations är inte helt klar och behöver ytterligare undersökningar. Aktuell kunskap om den funktionella aspekten är begränsad till framkallande av hämtnings beteende hos mödrar höra valp isolerings samtal, underlättande av närhet av vuxna kvinnor mot vuxna manliga vocalizatjoner 15 och den ökade undersökande beteende vuxna män hörsel vuxna kvinnliga läten 16.
Karakterisera avvikelser i talkommunikation i musmodeller av neuropsykiatriska störningar bör ske i standardiserade förhållanden för att utesluta betydande bidrag av experimentella betingelser. Sådana karakteriseringar, i kombination med utvärdering av samtidiga sociala interaktioner och neurobiologiska studier i olika genetiska modeller bör förbättra vår kunskap om den genetiska bidrag till de olika aspekterna av mus ultraljud kommunikation. Under en lång sikt bör det ge ytterligare ljus över vissa neurobiologiska grunderna för social kommunikation hos människor. Vi strävar nu till att ge enkla protokoll för att på ett tillförlitligt sätt framkalla ultraljud vocalizations under utveckling och i vuxen ålder för både manliga och kvinnliga möss i laboratoriet. Sådana protokoll bör underlätta standardiseringen av inspelningarna till mer tillförlitligt jämföra Ultrasonic utsläpp vocalization mellan stammar och laboratorier. Det bör också underlätta inrättandet av sådana inspelningar i laboratorier som inte har någon tidigare erfarenhet med mus ultraljud läten inspelningar. Vi belyser också den nuvarande möjligheten att kombinera ultraljud läten data med detaljerade beteendemässiga data som samlas in samtidigt under sociala interaktioner hos vuxna möss, för att få viktig information om sociala funktionsnedsättningar samt samband med utsläpp av ultraljud läten. Sådana analyser kommer att kasta nytt ljus över organisationen och funktioner mus ultraljud vocalizations. Slutligen, vi annonserar också möjligheten att dela ultraljud läten inspelningar med hela forskarsamhället på mouseTube databasen (http://mousetube.pasteur.fr). Fri tillgång till ljudinspelning uppgifter bör öka kunskapen om musen ultraljud kommunikation genom att tillåta forskare att jämföra sina egna data med ultraljud läten som spelats in i andra laborier (med liknande eller olika stammar / protokoll), och / eller att utmana sina analysmetoder med filer inspelade under olika förhållanden.
Protokollet presenteras här ger standardiserade och tillförlitliga sätt att samla mus ultraljud vocalizations i laboratoriet. Dessa mycket begränsade situationer har fördelen av standardisering. De används med framgång för att jämföra stammar eller genotyper inom stammar 18,19,26,27. Som framgår av de representativa resultat, de kan användas för identifiering av atypiska social kommunikation hos möss muterade för Shank2, en gen associerad med autismspektrum. Jämförelser mellan musstammar, mellan olika sammanhang eller ens mellan laboratorier kommer att utlösas av tillgången på större datamängder på mouseTube databasen. Detta verktyg bör öka studier på mus ultraljud vocalizations genom att multivariata analyser.
De protokoll som beskrivs här är optimerade för att testa möss av olika genotyper inom en stam, som det görs i de flesta studier modellering genetiska contribution till neuropsykiatriska störningar. Det rekommenderas att experimentellt utforma varje undersökning för att få de bästa kontrollerna möjliga. I själva verket kan strö effekter mask eller artificiellt blåsa genetiska effekter 28,29. Det är därför lämpligt att inkludera kull kontroller för varje genotyp. Avels heterozygota föräldrar bör därför gynnas, eftersom det kommer att möjliggöra rätt matchning av muterade och kontrollmöss inom en kull. Detta motiverar tass tatuering märkning av alla valpar (blinda för genotyp) för att spåra personer under inspelningarna varannan dag. Genotypning sker vid avvänjning, genom att svansprover. Vid inspelning valp isolerings samtal från P2 på, skulle vi inte rekommendera att ta svans prov redan i valpar, eftersom denna operation tilläggsinformation manipulation och stress mycket nära i tiden till en inspelning.
De protokoll som föreslås här för att framkalla ultraljud vocalizations hos vuxna inte tillåter tydlig identifiering av EMItter av läten. Detta förklarar varför vi manipulera motivation försöksdjuret. I själva verket är de testmöss isolerades och inte det nya-comer och försöksdjuren vänja sig under en lång tid till testburen under samma kön interaktioner. I män och kvinnor interaktioner, är den införda kvinnliga inte isolerade och test manliga habituates för kortare tid eftersom motivation kan vara högre i denna sexuella sammanhang. Dessa manipulationer av motivation bör maximera sannolikheten för testet musen avger de läten och inte infört ett. Att spela manliga ultraljud vocalizations i ett sexuellt sammanhang, kan en enkel bomullstopp med färsk (dvs inte fryst) urin från en brunst kvinnliga också införas i buren 30. Denna metod gör det möjligt att tilldelningen av ultraljud vocalizations på prov hane med 100% säkerhet, men det förhindrar att samla någon specifik information om den faktiska sociala sammanhang för utsläpp av dessa läten. Därför föredrar vi protocol som beskrivs här (med en fritt rörliga brunst hona). Vi rekommenderar också att alltid använda infört möss från samma stam vid provning möss från en mutant stam och att analysera data som ett par möss vocalizing. En färsk studie främjar användningen av triangulering för att lokalisera sändaren 31. I denna studie var honor visade sig också avge ultraljud läten under möten med en hane. Detta kan förklaras av det faktum att de var isolerade i minst två veckor innan inspelningen. Generaliseringen av användningen av triangulering föreslås i denna studie bör dock möjliggöra identifiering av sändaren av läten i de flesta fall om videoinspelningar är ordentligt synkroniseras.
Isolerings samtal från valpar som registrerats under utveckling inte störs av bakgrundsljud från sängkläder. Vanligtvis en automatisk analys fungerar mycket bra för att extrahera de viktigaste variablerna. I motsats, läten som spelats in från vuxna är disturbed av bakgrundsljud från djuren rör sig i sängkläder. Automatisk analys kan misslyckas, och därför manuell analys bör användas. Ändå bör lägga sängkläder i testburen föreskriver villkor som är mindre stressande för djuren än bar mark (att möss inte gillar). Ytterligare insatser i samhället är koncentrerade på att förbättra den automatiska detekteringen av ultraljud läten under olika förhållanden, även de som innebär bakgrundsljud. Till exempel tillåter Voice att analysera läten som hade manuellt valda för frånvaron av bakgrundsbrus 32. I detta program, är utvinning av de akustiska variabler automatisk men behöver den inledande manuellt val.
Det bör noteras att den interindividuella variabiliteten är mycket viktigt i den vokala beteendet hos möss. Till exempel är samtalsfrekvens av vuxna män i närvaro av en brunst kvinnlig mycket distribuerade (Figur 1). vi suggest dessa standardiserade protokoll för att framkalla ultraljud vocalizations redan att begränsa variationen i samband med den experimentella sammanhang. Icke desto mindre skulle vi vilja påpeka att det är viktigt att presentera inte bara medelvärdet och SEM för data, men viktigast de enskilda punkterna i prover av liten storlek 33. Det är också mycket relevant – om det är nödvändigt – för att spela minst 12 personer i varje grupp / genotyp att samla representativa uppgifter. I många fall bör interindividuella variabiliteten inte gömmas (oftast inte kan vara), och det kan vara av stor betydelse för att identifiera individer som bär den genetiska mutationen studeras men inte uppvisar någon atypisk fenotyp. Sådana personer kan ge ledtrådar om ersättningar, vilket kan öppna nya vägar för behandlingar av genetiska sjukdomar.
I de flesta beteende karakteriseringar av musmodeller för neuropsykiatriska störningar, sång beteende och sociala kontakter är övervägaEd isär (t.ex. 19,27,34,35). Nya analysmetoder nu ge en halvautomatisk detaljerad karakterisering av de sociala evenemang och händelseförlopp under en interaktion (med MiceProfiler till exempel) 36, samt möjligheten att kombinera denna analys med data från ljudinspelningar. Den största fördelen med denna metod är att ge en heltäckande bild av social kommunikation i musmodeller av ASD, att mer exakt identifiera vilka aspekter av social kommunikation påverkas. I det nuvarande protokollet synkroniseringen är fortfarande manuellt, men detta kan förbättras genom att utlösa videoinspelningen genom ljudinspelning programvara. Denna typ av analyser bör bli standard för att ge en mer heltäckande bild av den sociala kommunikations underskott i musmodeller av neuropsykiatriska störningar. Dessutom kan upp till nu, vokala signaler oftast analyseras från emittern sidan (dvs tester är byggda för att gynna utsläpp av vocal signaler från testade musen, som i förevarande protokoll). Fokus bör nu också ställas in på mottagaren av dessa signaler, för att bättre identifiera funktionerna för dessa ljudsignaler. Detta bör ske genom att utvärdera även beteendet hos de nya hörn möss i de nuvarande protokoll hos vuxna (med MiceProfiler till exempel) 36, genom att använda uppspelningsexperiment 16, eller genom att inrätta nya protokoll. Faktum är att de nuvarande protokoll ger mycket Constrained situationer som kanske inte exakt etologiska villkoren för vocalization utsläpp i möss. Den spontana emission av ultraljud vocalizations måste bättre karakteriseras med användning av kontinuerliga ljud- och videoinspelningar för att sprida mer ljus över den spontana sång beteende hos möss.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Fondation de France; by the ANR FLEXNEURIM [ANR09BLAN034003]; by the ANR [ANR- 08-MNPS-037-01-SynGen]; by Neuron-ERANET (EUHF-AUTISM); by the Fondation Orange; by the Fondation FondaMentale; by the Fondation de France; by the Fondation Bettencourt-Schueller. The research leading to this article has also received support from the Innovative Medicine Initiative Joint Undertaking under grant agreement no. 115300, resources of which are composed of financial contribution from the European Union’s Seventh Framework Program (FP7/2007-2013) and EFPIA companies’ in kind contribution. We thank Julie Lévi-Strauss for helpful comments on the manuscript and six anonymous reviewers whose comments noticeably improved the manuscript.
needles 0.3 x 13 mm [30G 1/2"] | BD Microlance | 304000 | – |
green tattoo paste | Ketchum Manufacturing Inc., Ottawa, Canada | 329AA | – |
thermometer | Fisherbrand, Waltham, USA | 4126 (W255NA) | – |
self-made soundproof chamber (pups) | Institut Pasteur, Paris | – | acoustic foam + plexiglas; inside dimensions (W x H x D): 32 x 33 x 32 cm |
small surface thermister + single probe thermocouple | Harvard Apparatus | 599814 + 601956 | – |
smell-less pen | for instance: Giotto | – | ink made with water, washable: these pens are designed for babies |
Ethanol absolute (100%) | Sigma Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France | 24103 | diluted 1/10 |
Condenser ultrasound microphone Avisoft-Bioacoustics CM16/CMPA | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #40011 | furnished with extension cables by the Avisoft company |
Ultrasound Gate 416H | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #34163 | sound card |
Avisoft Recorder USGH | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #10301; #10302 | recording software for Windows Vista, 7 and 8 |
Avisoft SASLab Pro | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #10101, 10111; #10102, 10112; | Windows 10, 8.1, 8, 7 or Vista including Intel-based Apple Macintosh running Boot Camp, Parallels or similar virtualization software. |
Laptop or Apple Macintosh running Boot Camp | – | – | running Windows 10, 8.1, 8, 7 or Vista; for the Apple Macintosh, Boot Camp is preferred to virtualizations softwares such as Parallels due to memory constraints |
plastic recipient (pup recordings) | Lock & Lock, Chatswood, USA | HPL932D | Lock & Lock Stackable Airtight Container Round 700ml; use without the cover; dimensions: 9 cm diameter, 10 cm height |
PBS 1X (pH=7.4) | Gibco (Life Technologies) | 10010-023 | – |
slides | Menzel-Gläser, Thermo Scientific | J1800AMNZ | Superfrost Plus |
May-Grünwald solution 500 ml | RAL Réactifs, Martillac, France | 320070-0500 | – |
Giemsa R 500 ml | RAL Réactifs, Martillac, France | 720-1107 | diluted 1/20 in phosphate buffer solution |
phosphate buffer solution (self-made) | – | – | pH=7, 0.1 M: 39 ml NaH2PO4 0.2 M + 61 ml Na2HPO4 0.2 M + 100 ml H2O (final volume: 200 ml) |
test cage | Institut Pasteur, Paris | – | 50 x 25 cm, 30 cm height; Plexiglas |
self-made soundproof chamber (adult recordings) | Institut Pasteur, Paris | – | acoustic foam + PVC; inside dimensions (W x H x D): 66 x 90 x 46 cm |
video camera | From Noldus Information Technologies, Wageningen, The Netherlands | – | high-resolution CamTech Super-Hi-Res video camera; 25 fps |
EthoVision XT | Noldus Information Technology, Wageningen, The Netherlands | http://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt | video acquisition software |
Mice Profiler Tracker plugin from the ICY platform | Bio Image Analysis, Institut Pasteur, Paris | http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Mice_Profiler_Tracker | tracking software to analyse behavioral events during social interactions |