Mouse ultrasonic vocalizations are used as proxies to model the genetic bases of vocal communication deficits in mouse models for neuropsychiatric disorders. The present protocol describes three experimental contexts that reliably elicit ultrasonic vocalizations from pups (throughout development) and adult mice (same-sex interactions, male-estrus female interactions).
Mice emit ultrasonic vocalizations in different contexts throughout development and in adulthood. These vocal signals are now currently used as proxies for modeling the genetic bases of vocal communication deficits. Characterizing the vocal behavior of mouse models carrying mutations in genes associated with neuropsychiatric disorders such as autism spectrum disorders will help to understand the mechanisms leading to social communication deficits. We provide here protocols to reliably elicit ultrasonic vocalizations in pups and in adult mice. This standardization will help reduce inter-study variability due to the experimental settings. Pup isolation calls are recorded throughout development from individual pups isolated from dam and littermates. In adulthood, vocalizations are recorded during same-sex interactions (without a sexual component) by exposing socially motivated males or females to an unknown same-sex conspecific. We also provide a protocol to record vocalizations from adult males exposed to an estrus female. In this context, there is a sexual component in the interaction. These protocols are established to elicit a large amount of ultrasonic vocalizations in laboratory mice. However, we point out the important inter-individual variability in the vocal behavior of mice, which should be taken into account by recording a minimal number of individuals (at least 12 in each condition). These recordings of ultrasonic vocalizations are used to evaluate the call rate, the vocal repertoire and the acoustic structure of the calls. Data are combined with the analysis of synchronous video recordings to provide a more complete view on social communication in mice. These protocols are used to characterize the vocal communication deficits in mice lacking ProSAP1/Shank2, a gene associated with autism spectrum disorders. More ultrasonic vocalizations recordings can also be found on the mouseTube database, developed to favor the exchange of such data.
Patienter med neuropsykiatriske lidelser normalt få underskud i social kommunikation (f.eks patienter med autisme spektrum forstyrrelser, skizofreni eller Alzheimers sygdom) 1. Gensplejsede mus mere og mere hyppigt anvendt til at modellere genetiske årsager til disse lidelser 2. Studere social kommunikation i disse musemodeller er af stor interesse for at forstå mekanismerne i genetiske mutationer, der fører til atypiske sociale dysfunktioner og for afprøvning af nye behandlingsformer. Da mus er sociale dyr og kommunikere med hinandens hjælp olfaktoriske, taktile, visuelle og akustiske signaler, de er egnede modeller til at vurdere den sociale kommunikation.
Mus ultralyd vokaliseringer nu i øjeblikket anvendes som en proxy til modellering de genetiske baser til mundtlig kommunikation underskud 3,4 (men eksistensen af vokal læring i denne art er stadig debatteret 5,6, selv om de fleste nyere undersøgelser nærmest skændese for fravær af vocal læring 7). Laboratorie mus har vist sig at udsende ultralyd vocalizations i mor-spædbarn relationer, i mand-kvinde socio-seksuelle interaktioner, i samme køn sociale interaktioner (revideret i henvisning 8) og i juvenile-juvenile sociale interaktioner 9. Mus hvalpe udsender isolation opkald i løbet af deres første to uger af livet, når isoleret fra dæmningen og søskende 10. Hanner udsender ultralyd vokaliseringer når i tilstedeværelse af en brunst kvindelige (eller urin stikord fra hende) 11,12. Hanner og hunner udsender ultralyd vokalisering når interagere med et ukendt conspecifikt af samme køn 13,14. Organisationen og funktioner af disse vokaliseringer er ikke helt klart, og har brug for yderligere undersøgelser. Aktuel viden om funktionelle aspekt er begrænset til fremkaldelse af hentning adfærd i mødre høre hvalp isolation opkald, lettelse af nærhed af voksne kvinder mod voksne mænd vocalizationer 15 og den øgede udforskende adfærd af voksne hanner høre voksen kvindelige vokaliseringer 16.
Karakterisering af abnormiteter i mundtlig kommunikation i musemodeller af neuropsykiatriske lidelser bør gennemføres i standardiserede betingelser for at udelukke stort bidrag af de eksperimentelle betingelser. Sådanne beskrivelser kombineret med vurderingen af samtidige sociale interaktioner og neurobiologiske studier, i forskellige genetiske modeller skal forbedre vores viden om den genetiske bidrag til de forskellige aspekter af mus ultralyd kommunikation. Over en lang sigt, bør det give yderligere lys over nogle neurobiologiske grundlag for social kommunikation i mennesker. Vi i øjeblikket sigter mod at give simple protokoller til pålideligt fremkalde ultralyd vocalizations under udvikling og i voksenalderen for både mandlige og kvindelige mus i laboratoriet. Sådanne protokoller bør lette standardisering af optagelser til mere pålideligt sammenligne Ultrasonic vokalisering emissioner mellem stammer og laboratorier. Det bør også lette oprettelsen af sådanne optagelser i laboratorier, der har nogen forudgående erfaring med mus ultralyd vocalizations optagelser. Vi fremhæver også den nuværende mulighed for at kombinere ultralyd vokaliseringer data med detaljerede adfærdsmæssige data indsamlet samtidigt under sociale interaktioner i voksne mus, for at få vigtige oplysninger om sociale nedskrivninger samt forbindelse med emission af ultralyds vokaliseringer. Sådanne analyser vil kaste nyt lys over opbygning og funktioner, mus ultralyd vokaliseringer. Endelig vil vi også annoncere muligheden for at dele ultralyd vokalisering optagelser med hele det videnskabelige samfund på mouseTube database (http://mousetube.pasteur.fr). Åben adgang til lydoptagelse data skal øge viden om mus ultralyd kommunikation ved at tillade forskerne at sammenligne egne data med ultralyd vokaliseringer optaget i andre labotorier (med lignende eller forskellige stammer / protokoller), og / eller til at udfordre deres analysemetoder med filer optaget under forskellige forhold.
Protokollen præsenteres her giver standardiserede og pålidelige måder at indsamle mus ultralyd vocalizations i laboratoriet. Disse meget begrænsede situationer er den fordel, at standardisering. De anvendes med succes til at sammenligne stammer eller genotyper i stammerne 18,19,26,27. Som præsenteret i de repræsentative resultater, de kan benyttes til identifikation af atypiske social kommunikation i mus muteret til Shank2, et gen forbundet med autisme spektrum forstyrrelser. Sammenligninger mellem musestammer, mellem forskellige sammenhænge eller endda mellem laboratorier vil blive udløst af tilgængeligheden af større datasæt på mouseTube databasen. Dette værktøj bør sætte skub i undersøgelser af mus ultrasoniske vocalizations ved at tillade multivariate analyser.
De her beskrevne protokoller er optimeret til at teste mus af forskellige genotyper inden for en stamme, som det gøres i de fleste undersøgelser modellere genetiske cIDRAG til neuropsykiatriske lidelser. Det anbefales at eksperimentelt designe hver undersøgelse for at få den bedst mulige kontrol. Faktisk kunne kuld effekter maskere eller kunstigt genetiske virkninger 28,29. Det er derfor tilrådeligt at inkludere kuld kontroller for hver genotype. Opdræt heterozygote forældre bør derfor begunstiget, da det vil give den korrekte matchning af muterede og kontrol mus inden for et kuld. Dette retfærdiggør pote tatovering mærkning af alle hvalpe (blindet til genotype) at spore personer gennem optagelserne hver to dage. Genotypebestemmelse sker ved fravænning, ved at tage hale prøver. Når du optager hvalp isolation opkald fra P2 på, ville vi ikke anbefale at tage hale prøver allerede i hvalpe, da denne operation omfatter supplerende manipulation og stress meget tæt i tiden til en optagelse.
Protokollerne foreslået her for at fremkalde ultralyd vokaliseringer hos voksne tillader ikke klar identifikation af EMItter af vokaliseringer. Det forklarer, hvorfor vi manipulere motivation forsøgsdyret. Faktisk er forsøgsmusene isoleret og ikke det nye-comer, og forsøgsdyrene vænne længe på prøve bur under samme køn interaktioner. I mand-kvinde interaktioner, den indførte kvindelige er ikke isoleret og testen mandlige habituates for kortere tid, da motivation kan være højere i denne seksuel kontekst. Disse manipulationer af motivation bør maksimere sandsynligheden for testen musen udsender de vocalizations og ikke den indførte én. For at optage mandlige ultralyd vocalizations i en seksuel kontekst, kan en simpel vatpind med frisk (dvs. ikke frosne) urin af en brunst kvindelig også indføres i buret 30. Denne metode gør det muligt at tildeling af ultralyd vokaliseringer til test mandlige med 100% sikkerhed, men det forhindrer at indsamle specifikke oplysninger om den faktiske sociale sammenhæng emissionen af disse vokaliseringer. Derfor er vi fremme protocol beskrevet her (med en frit-bevægelige brunst hun). Vi anbefaler også altid at bruge indført mus fra den samme stamme ved test af mus fra en mutant stamme og til at analysere de data som et par af mus vocalizing. En nyere undersøgelse fremmer brugen af triangulering at lokalisere emitter 31. I denne undersøgelse blev hunnerne fundet at også udsende ultralyd vocalizations under møder med en mandlig. Dette kan forklares ved det faktum, at de blev isoleret i mindst to uger før indspilningen. Den almindelige brug af det foreslåede i denne undersøgelse triangulering bør dog tillade identifikation af emitter af vokaliseringer i de fleste tilfælde, hvis videooptagelser er korrekt synkroniseret.
De isolation opkald fra unger registreret under udvikling ikke forstyrres af baggrundsstøj fra strøelse. Sædvanligvis en automatisk analyse fungerer udmærket til at udtrække de vigtigste variabler. I modsætning hertil vocalizations optaget fra voksne er disturbed af baggrundsstøj fra dyrene bevæger sig i sengetøj. Automatisk analyse kunne fejle, og derfor bør anvendes manuel analyse. Ikke desto mindre, tilføjer strøelse i testen buret bør give forhold, der er mindre stressende for dyrene end bar jord (at mus ikke kan lide). Yderligere indsats i samfundet er koncentreret om at forbedre den automatiske registrering af ultralyds vokaliseringer under forskellige forhold, selv de indebærer baggrundsstøj. For eksempel, stemmen software gør det muligt at analysere vokaliseringer, der var blevet manuelt udvalgt for fravær af baggrundsstøj 32. I denne software, udvinding af de akustiske variabler er automatisk, men har behov for indledende manuelt valg.
Det skal bemærkes, at den inter-individuelle variation er meget vigtigt i det vokale opførsel af mus. For eksempel bliver opkaldet på voksne mænd i nærværelse af et østrus kvindelig meget fordelt (figur 1). Vi suggest disse standardiserede protokoller til at fremkalde ultrasoniske vokaliseringer allerede at begrænse variationen relateret til den eksperimentelle kontekst. Ikke desto mindre vil vi gerne påpege vigtigheden af at præsentere ikke kun middelværdien og SEM for dataene, men vigtigst de enkelte punkter i prøver af lille størrelse 33. Det er også meget relevant – hvis ikke nødvendigt – for at optage mindst 12 personer i hver gruppe / genotype at indsamle repræsentative data. I mange tilfælde bør inter-individuel variation ikke skjules (normalt det kan ikke være), og det kan være af stor betydning for at identificere enkeltpersoner, der bærer den genetiske mutation, undersøgt, men ikke viser nogen atypisk fænotype. Sådanne personer kunne give fingerpeg om kompensationer, som kan åbne nye veje for behandlinger af genetiske sygdomme.
I de fleste adfærdsmæssige karakterisering af musemodeller for neuropsykiatriske lidelser, vokal adfærd og sociale kontakter er overvejeed hinanden (f.eks 19,27,34,35). Nylige analysemetoder nu give en halvautomatisk detaljeret karakterisering af de sociale arrangementer og sekvenser af begivenheder i en interaktion (ved hjælp MiceProfiler for eksempel) 36, samt muligheden for at kombinere denne analyse med data fra lydoptagelser. Den største fordel ved denne metode er at give et overblik over den sociale kommunikation i musemodeller af ASD, at mere præcist at identificere, hvilke aspekter af social kommunikation er berørt. I nærværende protokol synkroniseringen er stadig manuelt, men dette kan forbedres ved at udløse videooptagelsen gennem lydoptagelsen software. Denne type af analyser bør være standard for at give en mere omfattende billede af social kommunikation underskud i musemodeller af neuropsykiatriske lidelser. Endvidere indtil nu, vokalsignaler meste analyseret fra emitteren side (dvs. tests er bygget til at favorisere emissionen af vocal signaler ved den testede mus, som i det foreliggende protokoller). bør nu også indstilles fokus på modtageren af disse signaler, for bedre at kunne identificere de funktioner af disse akustiske signaler. Dette bør ske ved at evaluere også adfærd nye-comer mus i de nuværende protokoller hos voksne (ved hjælp MiceProfiler for eksempel) 36, ved hjælp af afspilning eksperimenter 16, eller ved at oprette nye protokoller. Faktisk er de nuværende protokoller giver meget begrænsede situationer, som måske ikke afspejler de nøjagtige etologiske betingelser for vokalisering emission i mus. Den spontane emission af ultralyds vokaliseringer skal bedre karakteriseres ved hjælp af kontinuerlig lyd- og videooptagelser til at kaste mere lys over den spontane vokal opførsel af mus.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Fondation de France; by the ANR FLEXNEURIM [ANR09BLAN034003]; by the ANR [ANR- 08-MNPS-037-01-SynGen]; by Neuron-ERANET (EUHF-AUTISM); by the Fondation Orange; by the Fondation FondaMentale; by the Fondation de France; by the Fondation Bettencourt-Schueller. The research leading to this article has also received support from the Innovative Medicine Initiative Joint Undertaking under grant agreement no. 115300, resources of which are composed of financial contribution from the European Union’s Seventh Framework Program (FP7/2007-2013) and EFPIA companies’ in kind contribution. We thank Julie Lévi-Strauss for helpful comments on the manuscript and six anonymous reviewers whose comments noticeably improved the manuscript.
needles 0.3 x 13 mm [30G 1/2"] | BD Microlance | 304000 | – |
green tattoo paste | Ketchum Manufacturing Inc., Ottawa, Canada | 329AA | – |
thermometer | Fisherbrand, Waltham, USA | 4126 (W255NA) | – |
self-made soundproof chamber (pups) | Institut Pasteur, Paris | – | acoustic foam + plexiglas; inside dimensions (W x H x D): 32 x 33 x 32 cm |
small surface thermister + single probe thermocouple | Harvard Apparatus | 599814 + 601956 | – |
smell-less pen | for instance: Giotto | – | ink made with water, washable: these pens are designed for babies |
Ethanol absolute (100%) | Sigma Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France | 24103 | diluted 1/10 |
Condenser ultrasound microphone Avisoft-Bioacoustics CM16/CMPA | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #40011 | furnished with extension cables by the Avisoft company |
Ultrasound Gate 416H | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #34163 | sound card |
Avisoft Recorder USGH | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #10301; #10302 | recording software for Windows Vista, 7 and 8 |
Avisoft SASLab Pro | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #10101, 10111; #10102, 10112; | Windows 10, 8.1, 8, 7 or Vista including Intel-based Apple Macintosh running Boot Camp, Parallels or similar virtualization software. |
Laptop or Apple Macintosh running Boot Camp | – | – | running Windows 10, 8.1, 8, 7 or Vista; for the Apple Macintosh, Boot Camp is preferred to virtualizations softwares such as Parallels due to memory constraints |
plastic recipient (pup recordings) | Lock & Lock, Chatswood, USA | HPL932D | Lock & Lock Stackable Airtight Container Round 700ml; use without the cover; dimensions: 9 cm diameter, 10 cm height |
PBS 1X (pH=7.4) | Gibco (Life Technologies) | 10010-023 | – |
slides | Menzel-Gläser, Thermo Scientific | J1800AMNZ | Superfrost Plus |
May-Grünwald solution 500 ml | RAL Réactifs, Martillac, France | 320070-0500 | – |
Giemsa R 500 ml | RAL Réactifs, Martillac, France | 720-1107 | diluted 1/20 in phosphate buffer solution |
phosphate buffer solution (self-made) | – | – | pH=7, 0.1 M: 39 ml NaH2PO4 0.2 M + 61 ml Na2HPO4 0.2 M + 100 ml H2O (final volume: 200 ml) |
test cage | Institut Pasteur, Paris | – | 50 x 25 cm, 30 cm height; Plexiglas |
self-made soundproof chamber (adult recordings) | Institut Pasteur, Paris | – | acoustic foam + PVC; inside dimensions (W x H x D): 66 x 90 x 46 cm |
video camera | From Noldus Information Technologies, Wageningen, The Netherlands | – | high-resolution CamTech Super-Hi-Res video camera; 25 fps |
EthoVision XT | Noldus Information Technology, Wageningen, The Netherlands | http://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt | video acquisition software |
Mice Profiler Tracker plugin from the ICY platform | Bio Image Analysis, Institut Pasteur, Paris | http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Mice_Profiler_Tracker | tracking software to analyse behavioral events during social interactions |