Mouse ultrasonic vocalizations are used as proxies to model the genetic bases of vocal communication deficits in mouse models for neuropsychiatric disorders. The present protocol describes three experimental contexts that reliably elicit ultrasonic vocalizations from pups (throughout development) and adult mice (same-sex interactions, male-estrus female interactions).
Mice emit ultrasonic vocalizations in different contexts throughout development and in adulthood. These vocal signals are now currently used as proxies for modeling the genetic bases of vocal communication deficits. Characterizing the vocal behavior of mouse models carrying mutations in genes associated with neuropsychiatric disorders such as autism spectrum disorders will help to understand the mechanisms leading to social communication deficits. We provide here protocols to reliably elicit ultrasonic vocalizations in pups and in adult mice. This standardization will help reduce inter-study variability due to the experimental settings. Pup isolation calls are recorded throughout development from individual pups isolated from dam and littermates. In adulthood, vocalizations are recorded during same-sex interactions (without a sexual component) by exposing socially motivated males or females to an unknown same-sex conspecific. We also provide a protocol to record vocalizations from adult males exposed to an estrus female. In this context, there is a sexual component in the interaction. These protocols are established to elicit a large amount of ultrasonic vocalizations in laboratory mice. However, we point out the important inter-individual variability in the vocal behavior of mice, which should be taken into account by recording a minimal number of individuals (at least 12 in each condition). These recordings of ultrasonic vocalizations are used to evaluate the call rate, the vocal repertoire and the acoustic structure of the calls. Data are combined with the analysis of synchronous video recordings to provide a more complete view on social communication in mice. These protocols are used to characterize the vocal communication deficits in mice lacking ProSAP1/Shank2, a gene associated with autism spectrum disorders. More ultrasonic vocalizations recordings can also be found on the mouseTube database, developed to favor the exchange of such data.
Neuropsychiatric विकारों के साथ मरीजों को आमतौर पर सामाजिक संचार में घाटा प्रदर्शित (जैसे, आत्मकेंद्रित स्पेक्ट्रम विकार, मानसिक असंतुलन, या अल्जाइमर रोग के साथ रोगियों) 1। आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों रहे हैं और अधिक से अधिक बार इन विकारों 2 के आनुवंशिक कारणों मॉडल करने के लिए इस्तेमाल किया। इन माउस मॉडल में सामाजिक संचार के अध्ययन के आनुवंशिक परिवर्तन असामान्य सामाजिक रोग के लिए अग्रणी के तंत्र को समझने के लिए और नए उपचारों के परीक्षण के लिए उच्च ब्याज की है। चूंकि चूहों सामाजिक जानवर हैं और घ्राण, स्पर्श, दृश्य और ध्वनिक संकेतों का उपयोग एक दूसरे के साथ संवाद, वे उपयुक्त मॉडल सामाजिक संचार मूल्यांकन करने के लिए कर रहे हैं।
माउस अल्ट्रासोनिक vocalizations अब वर्तमान में, मुखर संचार घाटा 3,4 (लेकिन इस प्रजाति अभी भी बहस हो रही है 5,6 में मुखर सीखने के अस्तित्व के आनुवंशिक ठिकानों मॉडलिंग के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं, भले ही सबसे हाल ही के अध्ययन arguमुखर सीखने 7) की अनुपस्थिति के लिए ई। प्रयोगशाला के चूहों मां-शिशु रिश्तों में अल्ट्रासोनिक vocalizations फेंकना, पुरुष-महिला सामाजिक-यौन संबंधों में, एक ही लिंग के सामाजिक संबंधों में पाया गया है (संदर्भ में समीक्षा की 8) और किशोर-किशोर सामाजिक संबंधों 9 में। माउस पिल्ले अपने जीवन के पहले दो हफ्तों के दौरान अलगाव कॉल फेंकना जब बांध और littermates 10 से पृथक। नर जब (से उसे या मूत्र संकेतों) 11,12 एक मद महिला की उपस्थिति में अल्ट्रासोनिक vocalizations फेंकना। पुरुषों और महिलाओं अल्ट्रासोनिक वोकलिज़ेशन फेंकना जब एक ही लिंग 13,14 के एक अज्ञात सजातीय के साथ बातचीत। संगठन और इन स्वरों के उच्चारण के कार्यों को पूरी तरह से स्पष्ट नहीं कर रहे हैं और आगे की जांच की जरूरत है। कार्यात्मक पहलू पर वर्तमान ज्ञान पिल्ला अलगाव कॉल, वयस्क पुरुष vocalizat की ओर वयस्क महिलाओं की निकटता की सुविधा सुनवाई माताओं में पुनः प्राप्ति के व्यवहार के निकालना तक सीमित हैआयनों 15 और वयस्क पुरुषों वयस्क महिला vocalizations 16 सुनवाई की वृद्धि की खोजपूर्ण व्यवहार।
neuropsychiatric विकारों के माउस मॉडल में मुखर संचार में असामान्यताएं निस्र्पक प्रयोगात्मक शर्तों का प्रमुख योगदान बाहर शासन करने के लिए मानकीकृत की स्थिति में आयोजित किया जाना चाहिए। इस तरह के अभिलक्षण, एक साथ सामाजिक संबंधों और neurobiological अध्ययन, विभिन्न आनुवंशिक मॉडल में मूल्यांकन के साथ संयुक्त माउस अल्ट्रासोनिक संचार के विभिन्न पहलुओं के लिए आनुवंशिक योगदान पर हमारे ज्ञान में सुधार करना चाहिए। एक लंबे समय में, यह मानव में सामाजिक संचार के कुछ neurobiological ठिकानों पर आगे प्रकाश देना चाहिए। हम वर्तमान में सरल प्रोटोकॉल उपलब्ध कराने मज़बूती से विकास के दौरान और प्रयोगशाला में दोनों नर और मादा चूहों के लिए वयस्कता में अल्ट्रासोनिक vocalizations प्रकाश में लाना करने के उद्देश्य। ऐसे प्रोटोकॉल रिकॉर्डिंग अधिक मज़बूती ultr की तुलना करने के मानकीकरण को कम करना चाहिएतनाव और प्रयोगशालाओं के बीच asonic वोकलिज़ेशन उत्सर्जन। यह भी माउस अल्ट्रासोनिक vocalizations रिकॉर्डिंग के साथ कोई पूर्व अनुभव होने प्रयोगशालाओं में इस तरह की रिकॉर्डिंग की स्थापना की सुविधा चाहिए। हम यह भी वयस्क चूहों में सामाजिक संबंधों के दौरान एक साथ एकत्र, सामाजिक विकृतियों पर और साथ ही अल्ट्रासोनिक स्वरों के उच्चारण के उत्सर्जन के संदर्भ पर महत्वपूर्ण जानकारी प्राप्त करने के लिए विस्तृत व्यवहार डेटा के साथ अल्ट्रासोनिक vocalizations डेटा गठबंधन करने के लिए मौजूदा संभावना पर प्रकाश डाला। इस तरह के विश्लेषण संगठन और माउस अल्ट्रासोनिक स्वरों के उच्चारण के कार्यों पर नया प्रकाश डाला जाएगा। अंत में, हम भी mouseTube डेटाबेस (http://mousetube.pasteur.fr) पर पूरे वैज्ञानिक समुदाय के साथ अल्ट्रासोनिक वोकलिज़ेशन रिकॉर्डिंग साझा करने की संभावना को विज्ञापित। ऑडियो रिकॉर्डिंग डेटा के लिए खुला पहुँच वैज्ञानिकों अन्य LABO में दर्ज अल्ट्रासोनिक स्वरों के उच्चारण के साथ अपने स्वयं के डेटा की तुलना करने की अनुमति देकर माउस अल्ट्रासोनिक संचार पर ज्ञान को बढ़ावा देने चाहिएratories (समान या विभिन्न प्रकारों / प्रोटोकॉल के साथ), और / या अलग अलग परिस्थितियों में दर्ज की गई फ़ाइलों के साथ अपने विश्लेषण के तरीकों को चुनौती देने के लिए।
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल प्रयोगशाला में माउस अल्ट्रासोनिक vocalizations इकट्ठा करने के लिए मानकीकृत और विश्वसनीय तरीके सुझाता है। ये बहुत ही विवश स्थितियों मानकीकरण का लाभ प्रस्तुत करते हैं। वे उपभेदों 18,19,26,27 भीतर उपभेदों या जीनोटाइप तुलना करने के लिए सफलता के साथ इस्तेमाल कर रहे हैं। जैसा प्रतिनिधि परिणामों में प्रस्तुत किया है, इन तरीकों Shank2, आत्मकेंद्रित स्पेक्ट्रम विकारों के साथ जुड़े एक जीन के लिए उत्परिवर्तित चूहों में असामान्य सामाजिक संचार की पहचान की अनुमति। माउस उपभेदों, प्रयोगशालाओं अलग संदर्भों के बीच या यहां तक कि बीच बीच तुलना mouseTube डेटाबेस पर बड़े डेटासेट की उपलब्धता से शुरू हो जाएगा। यह उपकरण बहुभिन्नरूपी विश्लेषण की अनुमति देकर माउस अल्ट्रासोनिक vocalizations पर अध्ययन को बढ़ावा देने चाहिए।
के रूप में यह मॉडलिंग आनुवंशिक सी अध्ययन के बहुमत में किया जाता है प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित है, एक तनाव के भीतर अलग जीनोटाइप के चूहों का परीक्षण करने के लिए अनुकूलित कर रहे हैंneuropsychiatric विकारों को ontribution। यह प्रयोगात्मक प्रत्येक अध्ययन डिजाइन करने के लिए सबसे अच्छा संभव नियंत्रण करने के लिए सिफारिश की है। दरअसल, कूड़े प्रभाव नकाब या कृत्रिम रूप से आनुवंशिक प्रभाव 28,29 बढ़ सकता है। यह इसलिए प्रत्येक जीनोटाइप के लिए littermate नियंत्रण शामिल करने की सलाह दी जाती है। प्रजनन विषमयुग्मजी माता-पिता इसलिए, इष्ट किया जाना चाहिए, क्योंकि यह एक कूड़े के भीतर उत्परिवर्ती और नियंत्रण चूहों का सही मिलान की अनुमति देगा। यह पंजा टैटू सभी पिल्ले के अंकन (जीनोटाइप को अंधा) रिकॉर्डिंग के दौरान हर दो दिन व्यक्तियों को ट्रैक करने के लिए सही ठहराते हैं। जीनोटाइपिंग प्रातः पर किया जाता है, पूंछ के नमूने लेने के द्वारा। जब पिल्ला पर अलगाव कॉल की रिकॉर्डिंग p2 से, हम पिल्ले में पहले से ही पूंछ के नमूने लेने के बाद से इस आपरेशन अनुपूरक हेरफेर और तनाव एक रिकॉर्डिंग सत्र के लिए समय में बहुत करीबी शामिल सिफारिश नहीं होगा।
प्रोटोकॉल यहाँ का सुझाव दिया वयस्कों में अल्ट्रासोनिक vocalizations बटोर ईएमआई की स्पष्ट पहचान की अनुमति नहीं हैस्वरों के उच्चारण के tter। यह बताते हैं कि क्यों हम परीक्षण जानवर की प्रेरणा हेरफेर। दरअसल, परीक्षण चूहों अलग कर रहे हैं और न नया आनेवाला और परीक्षण जानवरों ही सेक्स बातचीत के दौरान परीक्षण पिंजरे में एक लंबे समय के लिए अभ्यस्त। पुरुष-महिला बातचीत में पेश किया महिला से अलग-थलग नहीं है और परीक्षण पुरुष कम समय प्रेरणा इस यौन संदर्भ में अधिक हो सकता है, क्योंकि लिए habituates। प्रेरणा के इन जोड़तोड़ परीक्षण माउस स्वरों के उच्चारण और नहीं शुरू की गई एक उत्सर्जन की संभावना को अधिकतम करना चाहिए। एक यौन संदर्भ में पुरुष अल्ट्रासोनिक स्वरों के उच्चारण रिकॉर्ड करने के लिए, ताजा (यानी, जमे हुए नहीं) एक मद महिला के मूत्र के साथ एक सरल कपास झाड़ू भी पिंजरे 30 में पेश किया जा सकता है। इस विधि 100% निश्चितता के साथ परीक्षण के पुरुष के लिए अल्ट्रासोनिक स्वरों के उच्चारण के काम की अनुमति देता है, लेकिन यह इन स्वरों के उच्चारण के उत्सर्जन की वास्तविक सामाजिक संदर्भ के बारे में कोई विशेष जानकारी इकट्ठा करने से रोकता है। इसलिए, हम protoco के पक्ष मेंएल यहाँ वर्णित (एक स्वतंत्र रूप से चलती मद महिला के साथ)। हम भी जब एक उत्परिवर्ती तनाव से चूहों का परीक्षण हमेशा ही तनाव से शुरू चूहों का उपयोग करने के लिए और vocalizing चूहों की एक जोड़ी के रूप में डेटा का विश्लेषण करने की सलाह देते हैं। एक ताजा अध्ययन में triangulation का उपयोग emitter 31 स्थानीयकरण करने के लिए बढ़ावा देता है। इस अध्ययन में, महिलाओं को भी एक पुरुष के साथ मुठभेड़ों के दौरान अल्ट्रासोनिक vocalizations फेंकना करने के लिए पाए गए। यह सच है कि वे रिकॉर्डिंग सत्र से पहले कम से कम दो सप्ताह के लिए अलग थे द्वारा समझाया जा सकता है। triangulation इस अध्ययन में प्रस्तावित के उपयोग के सामान्यीकरण फिर भी ज्यादातर मामलों में स्वरों के उच्चारण के emitter की पहचान की अनुमति चाहिए अगर वीडियो रिकॉर्डिंग ठीक से सिंक हो जाती हैं।
विकास के दौरान दर्ज की गई पिल्ले से अलगाव कॉल बिस्तर से पृष्ठभूमि शोर से परेशान नहीं हैं। आमतौर पर एक स्वचालित विश्लेषण बहुत अच्छी तरह से काम करता है मुख्य चर निकालने के लिए। इसके विपरीत, वयस्कों से दर्ज vocalizations घबिस्तर में चलती जानवरों से पृष्ठभूमि शोर से isturbed। स्वचालित विश्लेषण असफल हो सकता है, और इसलिए मैनुअल विश्लेषण किया जाना चाहिए। फिर भी, परीक्षण पिंजरे में बिस्तर जोड़ने की स्थिति है कि नंगे मिट्टी से जानवरों के लिए कम तनावपूर्ण (कि चूहों की तरह नहीं है) कर रहे हैं प्रदान करना चाहिए। समुदाय में इसके अतिरिक्त प्रयास, यहां तक कि उन जिसका अर्थ पृष्ठभूमि शोर विभिन्न शर्तों के तहत अल्ट्रासोनिक vocalizations का स्वत: पता लगाने में सुधार लाने पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं। उदाहरण के लिए, आवाज सॉफ्टवेयर vocalizations कि मैन्युअल पृष्ठभूमि शोर 32 की अनुपस्थिति के लिए चयनित किया गया था विश्लेषण करने के लिए अनुमति देता है। इस सॉफ्टवेयर में, ध्वनिक चर की निकासी स्वचालित है लेकिन प्रारंभिक मैनुअल चयन की जरूरत है।
यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अंतर-व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता चूहों के मुखर व्यवहार में बहुत महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, एक मद महिला की उपस्थिति में वयस्क पुरुषों की कॉल दर बहुत (चित्रा 1) वितरित किया जाता है। हम सुइन मानकीकृत प्रोटोकॉल GGEST प्रयोगात्मक संदर्भ से संबंधित परिवर्तनशीलता को सीमित करने का पहले से ही अल्ट्रासोनिक vocalizations प्रकाश में लाना। फिर भी, हम छोटे आकार 33 के नमूनों में अलग-अलग अंक डेटा के लिए न केवल मतलब और SEM पेश करने के महत्व को बाहर बात करना चाहते हैं, लेकिन सबसे महत्वपूर्ण बात। यदि आवश्यक हो तो नहीं – – यह भी बहुत प्रासंगिक है प्रतिनिधि डेटा इकट्ठा करने के लिए प्रत्येक समूह / जीनोटाइप के कम से कम 12 व्यक्तियों रिकॉर्ड करने के लिए। कई मामलों में, अंतर-व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता (आमतौर पर यह नहीं हो सकता है) छिपा हुआ नहीं होना चाहिए, और यह व्यक्तियों आनुवंशिक उत्परिवर्तन का अध्ययन ले जा रहा है, लेकिन किसी भी असामान्य लक्षण प्रारूप प्रदर्शित नहीं की पहचान करने के लिए उच्च महत्व का हो सकता है। ऐसे व्यक्तियों को मुआवजा, जो आनुवांशिक विकारों के उपचार के लिए नए रास्ते खोल सकती है के बारे में सुराग दे सकती है।
neuropsychiatric विकारों, मुखर व्यवहार और सामाजिक संपर्क के लिए माउस मॉडल की सबसे व्यवहार अभिलक्षण में विचार कर रहे हैंएड के अलावा (जैसे, 19,27,34,35)। हाल के विश्लेषण के तरीकों अब एक बातचीत (उदाहरण के लिए MiceProfiler उपयोग करते हुए) 36, साथ ही ऑडियो रिकॉर्डिंग से डेटा के साथ इस विश्लेषण गठबंधन की संभावना के दौरान सामाजिक घटनाओं और घटनाओं के दृश्यों की एक अर्द्ध स्वचालित विस्तृत लक्षण वर्णन प्रदान करते हैं। इस विधि का मुख्य लाभ एएसडी के माउस मॉडल में सामाजिक संचार के लिए एक व्यापक दृष्टिकोण प्रदान करने के लिए, और अधिक ठीक पहचान करने के लिए जो सामाजिक संचार के पहलुओं को प्रभावित कर रहे हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल में तुल्यकालन अभी भी मैनुअल है, लेकिन इस ऑडियो रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर के माध्यम से वीडियो रिकॉर्डिंग ट्रिगर द्वारा सुधार किया जा सकता है। विश्लेषण के इस प्रकार के neuropsychiatric विकारों के माउस मॉडल में सामाजिक संचार घाटे के एक अधिक व्यापक दृष्टिकोण प्रदान करने के लिए मानक बन जाना चाहिए। इसके अलावा, अब, मुखर संकेतों ज्यादातर emitter तरफ से विश्लेषण कर रहे हैं (यानी, परीक्षण vo के उत्सर्जन के पक्ष में करने के लिए निर्मित कर रहे हैंपरीक्षण किया माउस द्वारा कैलोरी का संकेत है, वर्तमान प्रोटोकॉल के रूप में)। ध्यान अब भी बेहतर इन ध्वनिक संकेतों के कार्यों की पहचान करने के लिए इन संकेतों के रिसीवर पर स्थापित किया जाना चाहिए। यह भी वयस्कों में मौजूद प्रोटोकॉल में नए आनेवाला चूहों के व्यवहार (उदाहरण के लिए MiceProfiler उपयोग करते हुए) 36 मूल्यांकन, प्लेबैक प्रयोगों 16 का उपयोग करके द्वारा किया जाना चाहिए, या नए प्रोटोकॉल की स्थापना करके। दरअसल, वर्तमान प्रोटोकॉल बहुत विवश स्थितियों है कि चूहों में वोकलिज़ेशन उत्सर्जन की सटीक ethological की स्थिति को प्रतिबिंबित नहीं हो सकता है प्रदान करते हैं। अल्ट्रासोनिक vocalizations की सहज उत्सर्जन लगातार ऑडियो और वीडियो रिकॉर्डिंग का उपयोग चूहों की सहज मुखर व्यवहार पर और अधिक प्रकाश डाला बेहतर होती जा करना होगा।
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Fondation de France; by the ANR FLEXNEURIM [ANR09BLAN034003]; by the ANR [ANR- 08-MNPS-037-01-SynGen]; by Neuron-ERANET (EUHF-AUTISM); by the Fondation Orange; by the Fondation FondaMentale; by the Fondation de France; by the Fondation Bettencourt-Schueller. The research leading to this article has also received support from the Innovative Medicine Initiative Joint Undertaking under grant agreement no. 115300, resources of which are composed of financial contribution from the European Union’s Seventh Framework Program (FP7/2007-2013) and EFPIA companies’ in kind contribution. We thank Julie Lévi-Strauss for helpful comments on the manuscript and six anonymous reviewers whose comments noticeably improved the manuscript.
needles 0.3 x 13 mm [30G 1/2"] | BD Microlance | 304000 | – |
green tattoo paste | Ketchum Manufacturing Inc., Ottawa, Canada | 329AA | – |
thermometer | Fisherbrand, Waltham, USA | 4126 (W255NA) | – |
self-made soundproof chamber (pups) | Institut Pasteur, Paris | – | acoustic foam + plexiglas; inside dimensions (W x H x D): 32 x 33 x 32 cm |
small surface thermister + single probe thermocouple | Harvard Apparatus | 599814 + 601956 | – |
smell-less pen | for instance: Giotto | – | ink made with water, washable: these pens are designed for babies |
Ethanol absolute (100%) | Sigma Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France | 24103 | diluted 1/10 |
Condenser ultrasound microphone Avisoft-Bioacoustics CM16/CMPA | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #40011 | furnished with extension cables by the Avisoft company |
Ultrasound Gate 416H | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #34163 | sound card |
Avisoft Recorder USGH | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #10301; #10302 | recording software for Windows Vista, 7 and 8 |
Avisoft SASLab Pro | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #10101, 10111; #10102, 10112; | Windows 10, 8.1, 8, 7 or Vista including Intel-based Apple Macintosh running Boot Camp, Parallels or similar virtualization software. |
Laptop or Apple Macintosh running Boot Camp | – | – | running Windows 10, 8.1, 8, 7 or Vista; for the Apple Macintosh, Boot Camp is preferred to virtualizations softwares such as Parallels due to memory constraints |
plastic recipient (pup recordings) | Lock & Lock, Chatswood, USA | HPL932D | Lock & Lock Stackable Airtight Container Round 700ml; use without the cover; dimensions: 9 cm diameter, 10 cm height |
PBS 1X (pH=7.4) | Gibco (Life Technologies) | 10010-023 | – |
slides | Menzel-Gläser, Thermo Scientific | J1800AMNZ | Superfrost Plus |
May-Grünwald solution 500 ml | RAL Réactifs, Martillac, France | 320070-0500 | – |
Giemsa R 500 ml | RAL Réactifs, Martillac, France | 720-1107 | diluted 1/20 in phosphate buffer solution |
phosphate buffer solution (self-made) | – | – | pH=7, 0.1 M: 39 ml NaH2PO4 0.2 M + 61 ml Na2HPO4 0.2 M + 100 ml H2O (final volume: 200 ml) |
test cage | Institut Pasteur, Paris | – | 50 x 25 cm, 30 cm height; Plexiglas |
self-made soundproof chamber (adult recordings) | Institut Pasteur, Paris | – | acoustic foam + PVC; inside dimensions (W x H x D): 66 x 90 x 46 cm |
video camera | From Noldus Information Technologies, Wageningen, The Netherlands | – | high-resolution CamTech Super-Hi-Res video camera; 25 fps |
EthoVision XT | Noldus Information Technology, Wageningen, The Netherlands | http://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt | video acquisition software |
Mice Profiler Tracker plugin from the ICY platform | Bio Image Analysis, Institut Pasteur, Paris | http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Mice_Profiler_Tracker | tracking software to analyse behavioral events during social interactions |