Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

عزل وتوصيف الخلايا واحدة من اسماك الزرد الأجنة

Published: March 12, 2016 doi: 10.3791/53877
Automatic Translation
1,2, 2,3, 1, 2,3, 2,3
1Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, 2McAllister Heart Institute, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill

Introduction

وتستند معظم الدراسات الحالية من الخلية والبيولوجيا الجزيئية على المعدلات السكانية. ومع ذلك، قد يكون حجب الأحداث البيولوجية الهامة من قبل هذه التحليلات التقليدية القائمة على السكان منذ السكان البسيط يمكن أن تلعب دورا رئيسيا في العمليات البيولوجية ونتيجة المرض. فهم التعبير الجيني في السكان غير متجانسة على مستوى خلية واحدة يمكن (وديه) يؤدي إلى رؤى البيولوجية والسريرية ذات الصلة 1،2. من تهم دراسات التطور الجنيني، في عدد أكبر من السكان من الخلايا، الخلايا الاولية غالبا ما تكون ممثلة تمثيلا ناقصا، مما يجعلها صعبة للكشف عن التغييرات الطفيفة في التعبير الجيني التي تبدأ في نهاية المطاف القرارات مصير الخلية 3. وبالمثل، قد يكون نوع خلية واحدة ملامح التعبير المختلفة ردا على المكروية 4. على سبيل المثال، الخلايا البطانية المقيمين في نفس الجهاز أو في أجهزة مختلفة (على سبيل المثال، الشريان الأورطي أو الكلى) يحمل تجانس كبير على الرغم من اشتراكهم morp المشتركميزات hological وظيفية 5. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن الخلايا السرطانية ملء الورم نفسه أيضا متفاوتة التشكيلات الجزيئية أو الطفرات على مستوى خلية واحدة 6.

في النظم نموذج، transcriptomics في الخلايا واحد وقد حددت بنجاح السكان الخلية الجديدة، تتميز الدول الوسيطة التي تحدث أثناء تمايز الخلايا، وكشفت الاستجابات الخلوية التفاضلية للمنبهات 7،8،9. قد تم ملثمين مثل هذه الأفكار في الدراسات السكانية التقليدية. الأجنة الزرد هي مصدر كبير غير المستغلة الجذعية، السلف، والتفريق خلايا لاستكشاف الأسئلة من عدم التجانس وحيد الخلية والتنظيم الجزيئي الهويات الخلوية خلال التنمية. على نمطية للغاية، خارج الحي التنمية وسهولة التلاعب الجيني جعلها نظام نموذجا ممتازا لهذا النهج 10،11. على وجه التحديد، يشكل قيدا رئيسيا على تفسير خلية واحدة جنرالبيانات البريد التعبير هو أن تحديد موثوق للدول خلية متوسطة جديدة خلال التنمية يتطلب توقيت دقيق للغاية لجمع الأنسجة 9. وهذا أمر ضروري لضمان عدم التجانس بين الخلايا والقبض يمثل عدم التجانس داخل الأنسجة عند نقطة زمنية واحدة بدلا من عدم التجانس في التعبير الجيني التي قدمها تعتمد على سن تمايز الخلايا. بالمقارنة مع الفئران، تطور الجنين الزرد قد تكون متزامنة بدقة عبر عدد كبير من الأجنة 12. بالإضافة إلى ذلك، مع أحجام مخلب كبير والأجنة الزرد يمكن استخدامها كمصدر وفرة من الخلايا الجذعية والسلف.

يصف هذا البروتوكول وسيلة لعزل الخلايا من الأجنة الزرد والتقاط الخلايا واحدة باستخدام الدوائر المتكاملة على microfluidics (IFC) رقاقة وautoprep النظام المتوفرة تجاريا لQRT-PCR تحليل التعبير الجيني. هذا البروتوكول يمكن أن يكون للتحويل السريع إلى أي فحوصات عالية الإنتاجية المتنوعة بما في ذلك كلهالتسلسل Transcriptome على أن يسمح تحليل أكثر شمولا من عدم التجانس الخلوية 13. كما أنها توفر العديد من المزايا لفحوصات الجينات التقليدية. بروتوكول العزلة خلية واحدة تعطي قابلية عالية بعد FACS، مما يقلل من نسبة الخلايا الشبهة التي تم تضمينها في التطبيقات المصب. باستخدام مؤسسة التمويل الدولية، الخلايا والقبض ويمكن ملاحظة مباشرة لتقييم معدلات القبض وتقييم صحة الخلية شكليا. وبالإضافة إلى ذلك، وهذا البروتوكول هو الواجب التطبيق على نطاق واسع في الأوساط البحثية الزرد، لا تتطلب سوى خط الأسماك المعدلة وراثيا وصفت والحصول على التكنولوجيات القبض على خلية ميكروفلويديك.

وكدليل على المبدأ، تم عزل الخلايا واحد مستمد من الأسلاف القلب واستولت على رقاقة مؤسسة التمويل الدولية، ومن ثم تم قياس الوفرة النسبية للعلامات التمايز في القلب من قبل QRT-PCR. تحليل التعبير الجيني على مستوى الخلية واحد يدل على أن الأسلاف القلب تتعايش مع اح بهمذرية ntiating. البصيرة المكتسبة من التنميط وحيدة الخلية من الأسلاف القلب قد تسلط الضوء على الاختلاف في أنماط التعبير الجيني بين الخلايا الاصلية القلب خلال تطوير الفقاريات، التي ربما تكون قد ملثمين في التحليلات التقليدية القائمة على السكان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يتطلب هذا البروتوكول استخدام العيش، الزرد الكبار لإنتاج الأجنة. ويتم حصاد الأجنة لجمع الأنسجة. لا بد من الحصول على موافقة من مجالس المراجعة الأخلاقية المناسبة لإجراء هذه التجربة.

1. الحصول على أجنة نظموا

  1. قبل يوم من التجربة، وإعداد صحي، الزرد الكبار للتربية. وضع رجل واحد وامرأة واحدة على طرفي نقيض من المفرق واضحا في أحواض التفريخ.
  2. كرر 1.1 لأكبر عدد ممكن من الدبابات تربية كما اللازمة لإنتاج الجنين كافيا لتطبيق المصب. الحصول على أجنة من كل نوع الأسماك البرية والأسماك المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتينات الفلورية في نوع من الخلايا في المصالح.
    ملاحظة: عدد الأجنة اللازمة للتطبيقات المصب في خطوات 2-8 يعتمد على الوفرة النسبية للخلايا الفائدة عند نقطة زمنية من الفائدة. على الرغم من أن هذا قد تختلف من نوع من الخلايا، 200 الأجنة تنتج 2،000-5،000 خلايا فرزها عندما جملتعلمي اللغة اإلنكليزية من الفائدة تمثل <1.0٪ من مجموع الخلايا في 24 HPF (ساعة بعد الإخصاب).
  3. في صباح اليوم التالي، وتغيير المياه في الخزان فتات الخبز عن طريق نقل الأسماك إلى خزان تربية جديدة وإزالة المفرق. إمالة دبابات على زاوية لتشجيع تربية.
  4. جمع الأجنة مراحل.
    1. كل 15 دقيقة، وجمع الأجنة عن طريق نقل البالغين إلى خزان تربية الطازجة وتمرير البيض التي تركت وراءها من خلال مصفاة الشاي.
      ملاحظة: الأجنة الزرد تتطور بشكل متزامن عندما حافظت على كثافة ودرجات حرارة مماثلة.
    2. شطف البيض مع البيض المياه (0.21 جم / لتر أملاح المحيط الفوري في 1 لتر من الماء المقطر مزدوج) ونقل إلى طبق بتري. نقل طبق بتري إلى حاضنة الرطبة في 28.5 درجة مئوية مع دوران الهواء.
  5. بعد ساعتين من جمع الماضي، المخصبة نوع والأجنة المتعددة الخلايا إلى 10 سم أطباق بتري وتقليل الكثافة إلى 50 الأجنة في الطبق. حدد الأجنة من واحد، 15نافذة زمنية دقيقة لجمع لتطبيق المصب. احتضان الأجنة في 28.5 درجة مئوية.
    ملاحظة: على سبيل المثال، جمع الأجنة في الساعة 8:30، 8:45، 9:00، 9:15، 9:30، 9:45، 10:00 و 10:15. مقارنة عبر نقاط الوقت، إذا كان أكبر عدد من الأجنة المخصبة هم من براثن التي تم جمعها في الساعة 9:00، ثم استخدم فقط هذه الأجنة لتطبيقات المصب.

2. إعداد لتفكك خلية واحدة

  1. ما يقرب من 30 دقيقة قبل نقطة زمنية من الفائدة (18 HPF) إزالة الأجنة من المشيمه الخاصة بهم يدويا مع ملقط غرامة.
  2. جمع وتسمية التالية لكل حالة: اثنان 2 مل أنابيب microcentrifuge، واحدة من 40 ميكرومتر مصفاة الخلية، واحد 35 مم طبق ثقافة الخلية، واثنين من أنابيب FACS تصدرت مع مصفاة الخلية 35 ميكرون.
  3. هدئ الكواشف التالية على الجليد: البيض المياه التي تحتوي على 0.21g / L أملاح المحيط الفوري في 1L الماء المقطر مزدوجة؛ دي yolking العازلة التي تحتوي على 55 ملي كلوريد الصوديوم، 1.8 ملي بوكل، و 1.25 ملم NaHCO 3. وFACS العازلة التي تحتوي على يبوفيتش L-15 وسائل الإعلام تستكمل مع المعطل للحرارة 5٪ مصل بقري جنيني.
  4. جلب 1 مل لكل عينة من خلية التفكك الكاشف 1 إلى RT. ذوبان الجليد 1 مل خلية التفكك الكاشف 2 لكل عينة على الجليد. جلب لRT مباشرة قبل الاستعمال.

3. التفكك وحيد الخلية

  1. باستخدام ماصة تتحمل الزجاج واسعة، ونقل 100-300 الأجنة إلى أنبوب الطرد المركزي 2 مل الصغير في حجم الحد الأدنى من البيض المياه.
  2. الموت ببطء الأجنة عن طريق استبدال الماء مع الماء البيض 1 مل الجليد الباردة وغمر أنبوب في الثلج لمدة 20 دقيقة.
    تنبيه! فمن الأهمية بمكان الحصول على موافقة من لجنة الرقابة رعاية الحيوانات المؤسسية المناسبة لهذا الأسلوب القتل الرحيم (تقشعر لها الأبدان على الجليد تليها التفكك خلية أنه قتل رحيم الثانوي). يتطلب القتل الرحيم القياسية عادة أن الأجنة <3 أيام بعد الإخصاب وابيض بعد تبريد الأسماك والتي ليس مناسبا للحصول على خلايا قابلة للحياة.
  3. غسل الأجنة مرتين مع 1 مل الجليد الباردة البيض المياه. أن يغسل، واستخدام ماصة تتحمل الزجاج واسعة لإزالة المياه البيض وP1000 لإضافة البيض المياه.
  4. إزالة صفار البيض عن طريق استبدال الماء الجنين مع 1 مل Deyolking العازلة والطحن 8-12 مرات مع طرف P1000، أو حتى يذوب صفار البيض وفقط على جثث الأجنة مرئية.
  5. جمع الأنسجة عن طريق الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 1 دقيقة. استخدام ماصة لإزالة بلطف طاف دون الإخلال بيليه الأنسجة. إعادة تعليق في 1 مل ماء البيض.
  6. كرر الخطوة 3.5 ليصبح المجموع ثلاثة يغسل، ولكن على غسل النهائي، وإعادة تعليق في 1 مل RT خلية التفكك الكاشف 1.
  7. احتضان في الخلية تفارق الكاشف 1 لمدة 10 دقيقة في RT مع أنابيب وضعت أفقيا. كل 2-3 دقيقة، يسحن بلطف مع ماصة P1000 لمنع تراكمها.
    ملاحظة: التعامل مع عينات بلطف خلال خطوات سحن. في وقت واحد، وأجمة كبيرة ستشكل في أنبوب من مجموعة متشابكة من الهيئات الجنين. هذه الإرادةتفريق مع الهضم إضافية بمساعدة سحن لطيف. لا الدوامة.
  8. جمع الأنسجة عن طريق الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 3 دقائق. إزالة طاف و resuspend في 1 مل خلية التفكك الكاشف 2.
  9. احتضان لمدة 5-15 دقائق على RT. وضع أنابيب أفقيا. كل 2-3 دقيقة، يسحن بلطف لمنع تراكمها. كل 5 دقائق، تقييم التقدم المحرز الهضم.
    1. لتقييم التقدم المحرز الهضم، ويخفف 2 ميكرولتر طاف في 18 ميكرولتر FACS العازلة وماصة كما قطرات على طبق ثقافة الخلية.
    2. وضع ساترة على عينة ومراقبة تحت المجهر زراعة الأنسجة في 10X 20X وتكبير.
      ملاحظة: يجب أن تظهر إعداد بأنها مزيج من الخلايا وحيدة، مجموعات صغيرة، مجموعات كبيرة، وأحيانا الجسم الجنين معظمها سليمة.
    3. تقييم بصريا نسبة الاعداد التي هي خلايا مفردة ومجموعات صغيرة.
      ملاحظة: والإفراط في الهضم تقلل من جدوى. تحت الهضم وتقليل العائد خلية واحدة. </ لى>
  10. جمع وإعداد الخلية عن طريق الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف وإعادة تعليق في 1 مل الباردة FACS العازلة.
  11. بلل مصفاة الخلية 40 ميكرومتر مع FACS العازلة. تمرير تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر على طبق خلية ثقافة 35 ملم. غسل الخلية مصفاة مرة واحدة مع 1 مل FACS فرز العازلة.
  12. نقل التدفق من خلال لأنبوب microcentrifuge 2 مل. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق واعادة تعليق في 100 ميكرولتر FACS العازلة.
  13. عدد العائد الخلية باستخدام عدادة الكريات. وعلاوة على ذلك تمييع عينات إلى 5X10 6 خلايا لكل مل، أو تركيز الأمثل الموصى بها لآلة نظام مراقبة الأصول الميدانية في الاختيار. اختياري، عندما عد العائد خلية على عدادة الكريات، مباين الخلايا الميتة مع الأزرق التريبان لتأكيد جدوى إعداد الخلية قبل FACS الفرز.
    ملاحظة: الاستعدادات التي يتم تمييع جدا وسوف تأخذ كمية كبيرة من الوقت لفرز. الاستعدادات التي هي أيضا جoncentrated تميل إلى تتجمع في multimers وهي الأمثل لفرز السكان نقية.
  14. احتياطي 10-20٪ من كل عينة لاستخدام الضوابط كما غير ملوثين. للعينات المتبقية، وصمة عار الخلايا الميتة عن طريق إضافة / ميت (L / D) التمييز يعيش صبغة الفلورسنت في كل عينة. لا تغسل.
    ملاحظة: أي صبغة الفلورسنت التي تخترق الخلايا مع أغشية الخلايا للخطر والبقع ويمكن استخدام الأحماض النووية كما الصبغة L / D، شريطة أن أطياف مضان متوافق مع الجهاز FACS الاختيار ووضع العلامات fluorophore خلايا الفائدة.
    1. لا يغسل إعداد بعد إضافة الصبغة حيث أن بعض الخلايا سيموت في طريقها إلى تنقية نظام مراقبة الأصول الميدانية، وينبغي أن تستبعد من السكان فرزها.
  15. بلل مصفاة 35 ميكرومتر الخلية توج FACS أنبوب مع العازلة FACS 20 ميكرولتر. إضافة الخلايا إلى مصفاة وجمع عن طريق الجاذبية. تخزين على الجليد.

4. نظام مراقبة الأصول الميدانية التخصيب

  1. استخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية لإثراء لاحدوالخلايا الحية معربا عن علامة فلوري.
    1. تعيين بوابة لتمييز الخلايا من الحطام على مساحة مبعثر مبعثر إلى الأمام (FSC-A) السعة مقابل السعة الجانب مبعثر (SSC-A)، وكلاهما مع التحجيم الخطي.
      الحذر! خلايا الزرد وعادة ما تكون أصغر من الماوس أو الخلايا البشرية. وينعكس هذا في فصل القاعدية أقل بين الخلايا والحطام.
    2. من البوابة المحددة في 4.1.1، تعيين بوابة لإثراء للخلايا واحدة واستبعاد multimers باستخدام مؤامرة مبعثر من ارتفاع الأمام مبعثر (FSC-H)، وانخفاض ارتفاع الجانب مبعثر (SSC-H)، وكلاهما مع التحجيم الخطي.
      ملاحظة: خلايا مع ارتفاع غير متناسب FSC-H وانخفاض SSC-H هي multimers المرجح ويتم استبعادها من الفرز.
    3. من مجموعة بوابة في 4.1.2، وذلك باستخدام ضوابط لون واحد، وضع بوابة لتشمل الخلايا الحية فقط باستخدام مؤامرة مبعثر من هيئة الرقابة المالية-A مع التحجيم الخطي وسعة القناة تستخدم لكشف L / D وصمة عار مع التحجيم السجل. تشمل L / D خلايا السلبية.
    4. من عندتعيين البوابة في 4.1.3، وذلك باستخدام ضوابط لون واحد، وضعت بوابة لتشمل الخلايا الحية الوحيدة مع مضان الإيجابي باستخدام مؤامرة مبعثر من هيئة الرقابة المالية-A مع التحجيم الخطي وسعة القناة تستخدم لكشف الفلورسنت علامة الخلية البروتين مع توسيع نطاق سجل . تتضمن خلايا إيجابية.
    5. تعيين أي ضوابط التعويض، إذا لزم الأمر، لحساب تدخل بين L / وصمة عار D والفلورسنت أطياف البروتين.
  2. مجموعة منطق نوع الخلايا التي تقع في جميع البوابات بتعيينه في الخطوة 4.1.
    1. استخدام الخلايا المسمى مزدوج، تحقق النابضة لفرز الخلايا.
      ملاحظة: خلايا لفرز سيكون الخلايا بدلا من الحطام، وخلايا واحدة بدلا من multimers، L / D خلايا إيجابية سلبية ومضان.
  3. نوع 2،000-4،000 الخلايا من سكان الفائدة إلى 5 ميكرولتر من العازلة FACS الباردة في أنبوب microcentrifuge على الجليد. للحد من القص والضغط على الخلايا أثناء الفرز، واستخدام أقل الضغوط ممكن للخليةفارز.
    ملاحظة: قطرة 5 ميكرولتر من FACS العازلة بمثابة وسادة للخلايا الخروج من آلة نظام مراقبة الأصول الميدانية. جمع 2،000-4،000 الخلايا مباشرة إلى نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة يلغي الحاجة إلى الطرد المركزي قبل تحميل على رقائق مؤسسة التمويل الدولية. وينصح باستخدام هذه الاستراتيجية بسبب الطرد المركزي يمكن أن يؤدي إلى تشكيل multimers إذا تلتصق الخلايا لبعضها البعض في بيليه.
  4. تقييم تحليل الجدوى بعد الفرز.
    1. نقل 1 ميكرولتر فرز الخلايا إلى أنبوب FACS جديدة مع 100 ميكرولتر FACS فرز عازلة و 1: 1000 تخفيف من L / D وصمة عار. تمر الخلايا من خلال فارز FACS مع استراتيجية المحاصرة في الخطوة 4.1. استخدام نسبة L / D سلبي إلى إيجابي لتقدير جدوى من الخلايا التي تم فرزها.

5. خلايا الحمل على رقاقة على microfluidics

  1. باستخدام عدادة الكريات، وقياس كل من التركيز وحجم الخلايا فرزها.
    1. تمييع الخلايا التي تم فرزها لا يقل عن 10 ميكرولتر. تمييع قسامة من 5 μ؛ خلايا لتر مع 5 ميكرولتر التريبان الأزرق. تحميل على عدادة الكريات وتطبيق ساترة.
    2. جمع الصور الحقل مشرق لجميع الخلايا في 4 × 4 شبكات من عدادة الكريات. حساب عدد الخلايا الحية وحساب الحية خلية / مل. الخلايا الحية لا يستغرق التريبان الأزرق.
      ملاحظة: استخدام أي برنامج تحليل الصور القياسية لقياس قطرها من جميع الخلايا الحية. حساب الانحراف المتوسط ​​والمعياري للحجم الخلية، واختر لوحة مؤسسة التمويل الدولية مناسبة لمجموعة وحجم الخلية من الفائدة. إذا مدى حجم الخلية تمتد مؤسسة التمويل الدولية وحة مدى حجم الخلية، واستخدام لوحات متعددة لالتقاط مجموعة كاملة من خلايا الفائدة.
  2. خلايا الحمل على لوحة مؤسسة التمويل الدولية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (انظر المواد).
    1. تمييع الخلايا إلى الخلايا 1x10 6 / مل وأداء الأمثل الطفو وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
      ملاحظة: الطفو الأمثل يضمن أن الخلايا لا تنزل الى القاع ولا تطفو الى أعلى أهلا وسهلا تحميلل لتحميل الأمثل على رقاقة مؤسسة التمويل الدولية. نسبة عازلة للخلايا قد تختلف من نوع من الخلايا، ولكن عادة ما يتراوح 6: 4-7: 3 من الخلايا: العازلة.
    2. إضافة إلى خلايا معدة ومؤسسة التمويل الدولية لوحة. لوحة الحمل إلى آلة FLUIDICS المتوافقة، وتشغيل برنامج نصي خلية تحميل لدفع الخلايا من خلال الدائرة على microfluidics وفي الممرات القبض عليه.
  3. تأكد من أن الخلايا استقرت في المواقع القبض على لوحة مؤسسة التمويل الدولية.
    1. إزالة لوحة مؤسسة التمويل الدولية من آلة FLUIDICS. تركيب لوحة مؤسسة التمويل الدولية على المجهر مجهزة محول لوحة.
    2. جمع لقطات من مشرق الميدان ومضان لكل موقع القبض على التكبير 10x.
      قد تتراوح Brightfield مرات القبض 10-50 مللي ثانية، اعتمادا على شدة مصباح: ملاحظة. قد تتراوح مرات القبض مضان 250-750 مللي ثانية، اعتمادا على سطوع fluorophore. تجنب تعريض الخلايا لمنع photodamage.

6. كدنا] التجميعي

  1. أداء تحلل الخلايا في الموقع وفقا للالأولتعليمات FC لوحة المصنعة.
    1. إضافة مخازن تحلل من الآبار على لوحة مؤسسة التمويل الدولية. لوحة الحمل على الجهاز FLUIDICS متوافقة وخلية المدى النصي تحلل حسب تعليمات الشركة الصانعة.
  2. أداء النسخ العكسي وفقا لتعليمات مؤسسة التمويل الدولية وحة المصنعة.
    1. إضافة الكواشف النسخ العكسي لوحة مؤسسة التمويل الدولية. لوحة الحمل على الجهاز FLUIDICS متوافقة. تشغيل البرنامج النصي النسخ العكسي. عينة شروط ركوب الدراجات: 1 دورة في درجة حرارة 25 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، 1 دورة في 42 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، ثم 1 دورة في 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  3. أداء ما قبل تضخيم مع تحقيقات الجينات المحددة وفقا لتعليمات مؤسسة التمويل الدولية وحة المصنعة.
    ملاحظة: نظرا لأكبر خصوصيتها مع أرقام منخفضة نسخة، استخدم تحقيقات الفلورة المسمى بدلا من تحقيقات الأمثل للاستخدام مع الأصباغ intercalator.
    1. الاشعال تجمع وتمييع لنهائي 180 نيوتن متر لكل منهما. إضافة الاشعال المجمعة لوحة مؤسسة التمويل الدولية. لوحة الحمل على fluidi متوافقآلة خدمات العملاء. تشغيل البرنامج النصي preamplification.
  4. أداء ما قبل تضخيم مع الظروف دورة التالية: 1 دورة في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، ثم 18 دورات مع تغيير طبيعة في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ثم الصلب والإرشاد عند 60 درجة مئوية لمدة 4 دقائق. مخزن قبل تضخيم [كدنا في 4 درجات مئوية حتى الحصاد. حصاد كدنا] من لوحة ميكروفلويديك وفقا لتعليمات الشركة الصانعة وتخزينها في 20C-حتى الاستخدام.

7. حدد كدنا] من خلايا واحدة لشخص واحد الهدف QRT-PCR

  1. تمييع [كدنا في 25 كاشف تخفيف ميكرولتر وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    ملاحظة: التقريبي العائد النهائي هو 28 ميكرولتر من [كدنا] تضخيم ما قبل لكل خلية. حجز قسامة من مخفف لاستخدامها كوسيلة لمراقبة عدم القالب في QRT-PCR.
    1. في اشارة الى حقل مشرق والصور فلوري سجلتها في الخطوة 5.3.2، يسجل كل موقع الالتقاط. يدويا عد وتسجيل عدد من الخلايا. تقييم وتسجيل ما إذا كان كل خلية هي انفلونزاorescent.
      ملاحظة: قد يحتوي كل موقع على حدة 0، 1، أو> 1 الخلية، حيث تتضمن> 1 خلية المواقع القبض التي تحتوي على خلايا متعددة و / أو الحطام هويته. إذا كانت الصور هي نوعية كافية، ويمكن أيضا أن يتم تعيين قيمة بكسل لقياس شدة إشارة مضان.
  2. اختر عينات للتحليل QRT-PCR.
    1. اختيار عينات كدنا] من مواقع التقاط تحديدها في الخطوة 7.2 التي تحتوي على الدقيق 1 خلية مع مضان إيجابي. تجمع 1 مكل من كدنا] من كل عينة.
      ملاحظة: هذا هو "بركة" مراقبة إيجابية تستخدم لتحديد ما إذا كان يتم التعبير عن جينات الفائدة في أي من الخلايا المحددة.
    2. اختر كدنا] من موقع التقاط واحد على الأقل يحتوي بالضبط 0 خلايا كعنصر تحكم السلبية. استخدام مخفف من الخطوة 7.1.2 كوسيلة لمراقبة أي قالب.
  3. تشغيل QRT-فحص PCR.
    1. استخدام تحقيقات الوحيدة المستخدمة لمرحلة ما قبل التضخيم في الخطوة 6.4.1. تحميل جميع العينات في triplicatه. شروط ركوب الدراجات لرد فعل 10 ميكرولتر على 384 لوحة جيدا: 1 دورة 50 ° C 2 دقيقة (1)، دورة 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، 40 دورة مع تغيير طبيعة في 95 درجة مئوية 15 ثانية ثم الصلب والإرشاد عند 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.

تحليل 8. البيانات

  1. التحقق من صحة المنتجات QRT-PCR بواسطة الكهربائي للهلام القياسية. تأكيد المنتج هو فرقة واحدة في الوزن الجزيئي المتوقع (تختلف عن كل مسبار).
    ملاحظة: إذا كان التحقيق تنتج عصابات متعددة أو فرقة واحدة في حجم مناسب، ثم خصوصية أمر مشكوك فيه، وهذا لا يشمل هذا الجين من التحليل.
  2. دراسة جميع منحنيات التضخيم وحساب لأي تشوهات 14. حساب متوسط ​​قيمة CT لكل تركيبة نموذج / جين 15.
    ملاحظة: القيم المقطعية لعناصر إيجابية تتراوح عادة 10-30. القيم المقطعية لضوابط السلبية عادة ما تتراوح 35-40 (أي التضخيم). القيم CT تعتبر 30-35 التعبير منخفض جداوينبغي أن تفسر بحذر 14.
  3. تقرير البيانات
    1. اذا انخفضت العينات في CT = 10-30، قد أبلغت بيانات أيضا تغيير أضعاف في نسخة الوفرة النسبية على عينة السيطرة.
      ملاحظة: طية تغير يساوي 2 ^ (- ΔΔCT) حيث ΔCT نسبة إلى الجينات التدبير المنزلي بطرح متوسط ​​المقطعية للعينة من الجينات التدبير المنزلي وΔΔCT هي الاختلافات في ΔCT بين العينة وتحكم إيجابية 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وكدليل على المبدأ، وجرى تقييم التعبير الجيني لاستكشاف ديناميكيات التمايز خلال تطوير القلب. في الزرد، تنشأ الأسلاف القلب من السكان أرومية متوسطة من الخلايا التي تهاجر إلى لوحة جانبية الأمامي الأديم المتوسط ​​حيث تلتحم لتشكل أنبوب القلب الخطي. قبل الانصهار، تبدأ الأسلاف القلب للتعبير عن عامل النسخ nkx2.5 (NK2 علبة مثلية 5)، والتي يعتقد أن تكون أقرب علامة معينة من الأسلاف القلب 16،17. هنا، والتي سبق وصفها BAC الأسماك المعدلة وراثيا تيراغرام (nkx2.5: ZsYellow) 18، يختصر nkx2.5: ZsY كان يستخدم لفحص علامات التمايز القلب في الخلايا واحد في المرحلة 18 الجسيدة، 18 وظيفة ساعة الإخصاب (HPF) 12. وكان هذا أقرب نقطة الوقت الذي كانت ZsYellow إشارة يمكن كشفها بصريا. كما هو موضح سابقا لهذا الخط المعدلة وراثيا، ZsYellow تسميات الأسلاف القلب، ونحنليرة لبنانية عن عدد قليل من الخلايا خارج القلب التي تؤدي إلى البلعوم قوس الخلايا البطانية في 28 HPF 19 (الشكل 1A-B، لا تظهر البيانات). في 18 HPF، nkx2.5: تم فصل الأجنة ZsY إلى تعليق خلية واحدة ثم ملطخة Sytox الأزرق لاستبعاد الخلايا الميتة. فرز الحية، ZsYellow إيجابية، كانت خلايا السلبية Sytox الأزرق FACS باستخدام إما فارز MoFloXDP أو سوني SH800Z مجهزة 100 فوهة ميكرومتر (الشكل 1C-F). لتقييم نقاء بقاء السكان وبعد الفرز فرزها، كانت ملطخة قسامة من الخلايا فرزها مع Sytox الأزرق وتقييم نسبة الأحداث التي تقع في بوابة الفرز الأصلية (الشكل 1G-J).

بعد الفرز، تم إدخال الخلايا في دائرة الموائع الدقيقة (IFC) تدفق العمل رقاقة (الشكل 2A) متكامل وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. عدادة الكريات، جنبا إلى جنب مع exclusio الأزرق التريبانوقد استخدم ن لقياس قطر الخلية، والتركيز، وقدرتها على البقاء (الشكل 2B، ولا تظهر البيانات). تم تحسين الطفو الخلية (6.5: 3.5 الخلايا: عازلة) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، وتم تحميل الخلايا على مؤسسة التمويل الدولية لالتقاط 5-10 ميكرون خلايا قطر. لتقييم كفاءة التقاط، مضان و / أو تم تصويرها في جميع المواقع التقاط إشارات المجال مشرق، تم استخدام وظيفة التبليط في فيجي لغرزة صورة واحدة من لوحة على microfluidics. كل موقع التقاط يرد 0، 1، أو> 1 الخلايا الفردية (الشكل 2C-F). كما هو متوقع من تخصيب FACS، أعربت الخلايا والقبض ZsYellow (الشكل 2G). كفاءة التقاط تجاوزت 90٪ في 5 التجارب الفردية باستخدام nkx2.5: ZsY فرز الخلايا، واحتلت 70٪ على الأقل من مواقع الاعتقال من قبل خلية واحدة (لا تظهر البيانات). كانت هي lysed الخلايا، وتضخمت RNA معزولة، كدنا] توليفها والجينات المستهدفة المحددة، كل وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.

وقد تم اختيار مجموعة فرعية من المواقع القبض على خلية للتحليل QRT-PCR كما هو موضح في البروتوكول أعلاه. على وجه التحديد، عامل استطالة 1A (efl1a) 20 والغليسيرالدهيد 3 الفوسفات (GAPDH) ويعاير 21 كما الجينات التدبير المنزلي المتوقع أن يتم التعبير عنها في كل خلية. GATA بروتين ملزمة 4 (gata4) 22 و NK2 علبة مثلية 5 (nkx2.5) في وقت مبكر كعلامات السلف القلب. ISL LIM علبة مثلية 1 مربع 1 (isl1) بمثابة القلب الثاني الميداني علامة 23،24. وضوء سلسلة الميوسين (myl7) والميوسين البطين السلسلة الثقيلة (vmhc) 25 للاحتفال العضلية البطين. ولم يتم التحقق من تحقيقات جينات محددة باستخدام [كدنا من 48 الأجنة HPF (الشكل 3). وقد استخدم QRT-PCR لتقييم التعبير الجيني النسبي لهذه الجينات في الخلايا واحد 45 من 18 HPF الأجنة، سيطرة سلبية عدم القالب، ويبلغ عدد سكانها المجمعة containi السيطرة إيجابينانوغرام [كدنا من جميع المواقع القبض على 96. وتظهر القيم الخام CT 40 خلايا تمثيلية والضوابط الواردة في الجدول 1. والجدير بالذكر أن من تجمع من 46 خلايا فحصها، تم استبعاد 6 خلايا من التحليل لجميع القيم CT التعبير الجيني تجاوزت CT = 35.0، وأنه من غير المعروف ما إذا كانت هذه عالية CT القيم يمكن أن تعزى إلى مستويات التعبير منخفضة جدا الحقيقية أو تدهور العينة. منذ نطاق القيم المقطعية لجين التدبير المنزلي، ef1a، وكان واسع جدا مقارنة التعبير الجيني بين العينات، وتجاوز العديد من القيم CT 30، تم تصور القيم CT كخريطة الحرارة (الشكل 3). مقارنة بين عينات، وقد لوحظ عدم تجانس كبير في التعبير الجيني، وصنفت الخلايا خلايا كنوع 1-5 على أساس نمط التعبير (الشكل 3).

الشكل 1
الشكل 1. عزل خلية واحدة من الزرد خلايا إيجابية في 18 HPF صور جبل كامل من تيراغرام التمثيلي (nkx2.5: ZsYellow). الجنين في 18 HPF مع (A) ZsYellow مضان وحدها أو (ب) اندمجت مع صورة حقل مشرق. استراتيجية النابضة (CF) الممثل نظام مراقبة الأصول الميدانية لإثراء لZsYellow خلايا إيجابية و(GJ) تحليل ما بعد الفرز مع (C، G) FSC / SSC حجم النابضة، (D، H) التمييز صدرة، (E، I) لايف / النابضة الميت ، و (F، J) مرتبة السكان. شريط المقياس هو 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. القبض على خلية واحدة من nkx2.5 الزرد: ZsY أونج> خلايا إيجابية. (A) تدفق العمل. (ب) توزيع حجم الخلية لخلايا فرزها من تيراغرام (nkx2.5: ZsYellow) الأجنة معزولة في 18 HPF. (CF) التمثيلية الأحداث القبض على خلية على لوحة مؤسسة التمويل الدولية حيث (C) هو بئر فارغة، (D) يحتوي على خليتين، (E) لديه خلية واحدة استقرت في قناة FLUIDICS بأنه "القبض على قناة"، و (F) هو خلية القبض على احد. صناديق الأرجواني نحتفل وأقحم لمشاهدة مضاعف من المواقع الالتقاط. (G) القبض على خلية واحدة مع brightfield، ZsYellow ودمج الصور. (CF) أبيض شريط النطاق هو 50 ميكرون. شريط النطاق الأصفر هو 10 ميكرون. (G) مقياس شريط 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

igure 3 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 53877 / 53877fig3.jpg "/>
الشكل 3. جين تحليل التعبير عن القبض على nkx2.5 الزرد واحد:. ZsY خلايا إيجابية التعبير الجيني عن طريق QRT-PCR في الضوابط الإيجابية (الأجنة في 2 أيام بعد انتهاء الإخصاب، المجمعة كدنا] من خلايا مفردة)، سيطرة سلبية (أي قالب ) و 40 الخلايا واحد (خلية 01-40). تم ونا مميزا على أساس القيم الخام CT كما هو موضح في مفتاح. Ef1a = استطالة عامل 1A، gata4 = GATA بروتين ملزمة 4، nkx2.5 = NK2 علبة مثلية 5، سلسلة myl7 = الميوسين ضوء 7، vmhc = الميوسين البطين السلسلة الثقيلة، GAPDH = الغليسيرالدهيد 3 الفوسفات، وisl1 = ISL LIM علبة مثلية 1. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

. في غضون الصفحات = "1" FO: المحافظة على مع next.within صفحة = "دائما">
دورة عتبة (CT)
ef1a gata4 nkx25 myl7 vmhc GAPDH isl1
جنين 20.69 20.92 28.59 32.87 26.30 27.00 33.57
حوض السباحة 26.4 22.4 27.7 27.4 24.5 29.2 40.0
NTC 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
النوع 1 خلية-01 25.1 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
خلية-02 25.4 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
خلية-03 26.3 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
خلية-04 27.4 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
خلية-05 28.0 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
خلية-06 28.2 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
خلية-07 29.3 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0 400.0
خلية-08 30.7 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
خلية-09 34.3 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
نوع 2 خلية 10 23.5 28.0 40.0 40.0 40.0 26.3 40.0
خلية-11 23.5 27.2 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
خلية ال 12 23.7 17.9 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
خلية-13 24.1 32.4 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
خلية-14 24.9 27.5 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
خلية 15 25.9 28.6 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
خلية-16 26.0 28.1 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
خلية-17 27.0 27.7 40.0 40.0 40.0 38.5 40.0
خلية 18 27.0 27.4 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
خلية-19 27.0 30.2 40.0 40.0 40.0 38.2 40.0
خلية ال 20 27.0 28.2 40.0 40.0 400.0 39.2 40.0
خلية-21 27.7 30.3 40.0 40.0 40.0 38.6 40.0
خلية-22 30.4 26.2 40.0 40.0 40.0 38.3 40.0
خلية-23 31.3 22.4 40.0 40.0 40.0 39.7 40.0
خلية ال 24 31.5 28.8 40.0 40.0 40.0 39.5 40.0
خلية-25 33.8 27.4 40.0 40.0 40.0 37.3 40.0
خلية-26 40.0 27.4 40.0 40.0 40.0 36.6 40.0
نوع 3 خلية-27 24.7 19.9 28.8 40.0 40.0 40.0 40.0
خلية-28 24.8 28.4 26.3 40.0 40.0 40.0 40.0
خلية-29 25.1 23.5 27.6 40.0 40.0 32.5 40.0
خلية 30 26.3 21.4 27.5 40.0 40.0 39.9 40.0
خلية-31 26.9 24.8 28.2 40.0 40.0 40.0 40.0
خلية-32 27.0 22.5 23.8 40.0 40.0 40.0 40.0
خلية-33 27.8 27.6 27.7 40.0 40.0 40.0 40.0
خلية 34 28.1 21.9 26.6 40.0 40.0 37.7 40.0
خلية-35 29.3 26.5 28.1 40.0 40.0 38.3 40.0
اكتب 4 خلية-36 24.8 20.3 26.0 27.4 26.6 40.0 40.0
خلية-37 28.7 22.3 25.9 28.9 22.9 38.5 40.0
اكتب 5 خلية-38 25.5 20.0 29.3 23.0 19.9 25.9 40.0
خلية-39 25.9 21.8 28.6 25.1 21.7 25.7 40.0
خلية 40 28.9 22.0 27.0 23.0 21.3 27.6 40.0

الجدول 1. القيم الخام CT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الطريقة الموصوفة هنا يستخدم تعبير عن بروتين فلوري تحت سيطرة أحد المروجين محددة الخلية من نوع لإثراء مجموعة من الخلايا الاصلية في القلب من الأجنة الزرد لاستخدامها في نظام بمساعدة القبض على خلية واحدة ميكروفلويديك لتقييم تعبير عن مجموعة فرعية من الجينات القلب في واحد الخلايا. شريطة أن الإثارة ليزر نظام مراقبة الأصول الميدانية والانبعاثات قدرات متوافقة مع fluorophore (ق) في الاختيار، وهذه الطريقة يمكن أن تستخدم في أي خط مراسل الفلورسنت. العديد من خطوط مراسل الزرد هي بالفعل في الوجود، والأسماك المعدلة وراثيا تحمل للصحفيين رواية يمكن أن تتولد في اقل من 3 أشهر. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تكييف هذا تدفق العمل لإنتاج كدنا] من Transcriptome على كامل لواحد تسلسل خلية الحمض النووي الريبي. للقيام بذلك، الخطوات 5-7 سوف تحتاج إلى تعديل طفيف للاستخدام مع كيمياء الأمثل لإعداد [كدنا لتوليد المكتبات مناسبة للتسلسل الحمض النووي الريبي. ومع ذلك، فإنه من المستحسن للتحقق من عدم التجانس السكانيباستخدام الطريقة الموصوفة هنا قبل أن تسلك تطبيقات التسلسل عالية الإنتاجية.

من المهم أن نلاحظ أن هناك بعض القيود على الطريقة الموصوفة. أولا، استخدام لوحات الدوائر المتكاملة الموائع الدقيقة (IFC) يتطلب ومعدات مكلفة المتخصصة. ومع ذلك، ورقائق ميكروفلويديك توفر مزايا كبيرة على التقليدية 96 بئر و 384 صيغ لوحة جيدا لمعايرة الخلايا وحيدة. التي تتدفق الخلايا والكواشف عبر الممرات مقياس الميكرومتر، يتم وضع الخلايا وحيدة في مواقع التقاط واحدة حيث يمكن ملاحظتها مباشرة للتأكد من أنها هي خلايا واحدة في صحة جيدة. استخراج الحمض النووي الريبي والتوليف [كدنا تحدث في الموقع على رقاقة مؤسسة التمويل الدولية باستخدام وحدات التخزين منخفضة جدا لكل خلية. رقائق الموائعية متكاملة، في وقت كتابة هذا التقرير، متاحة تجاريا من خلال مصدر واحد فقط. على الرغم من تلفيق غير التجاري وقد تم تنفيذ عدة مجموعات، ومن خارج قدرة معظم المختبرات. الخطوات قد 5-7تحتاج إلى تعديل لمنصات التي تنتجها شركات أخرى أو في المنزل افتراءات. ثانيا، على الرغم من لوحات مؤسسة التمويل الدولية المتاحة تجاريا يمكن أن تستوعب ما يصل إلى 96 الجينات وجينات منتقاة محدودة بسبب توافر تحقيقات الجينات الفلورة المسمى التحقق من صحتها للاستخدام في الزرد. الثالثة، خلايا الزرد وعادة ما تكون أصغر من خلايا الثدييات، ويعرض هذا الحجم الصغير التحديات لتجهيز العينات. تغيير صغير في قطر خلية يترجم إلى تغيير كبير في حجم الخلية، والحد من المواد المتاحة وتقليل احتمال الكشف عن أدنى مستوى التعبير عن الجينات.

هناك عدة اعتبارات إضافية لهذا البروتوكول. في الخطوة 1، فمن المهم أن الأجنة استخدام الوحيدة المخصبة داخل نافذة زمنية قصيرة. حفظ درجة حرارة ثابتة ودون الحد من الشروط الأكسجين والأجنة الزرد تتطور بشكل متزامن. قراءات في نهاية المطاف من هذا البروتوكول (التعبير الجيني النسبي من الخلايا واحد) لا يمكن تمييز مصدر heterogeneity بين الخلايا الفردية. لهذا السبب، وتفسير التباين بين الخلايا يعتمد على الأجنة نظمت بعناية والتنمية متزامن. في الخطوات 2-3، هناك علاقة تبادلية بين التفكك وقدرتها على البقاء. على الرغم من الخطوة 4 يختار لخلايا قابلة للحياة، والخطوة 3 يحتوي على عدة خطوات الترشيح التي تساعد على استبعاد multimers، والإفراط في الهضم وتقلل من المواد القابلة للحياة متوفرة لنظام مراقبة الأصول الميدانية وربما للتقليل العائد خلية فرزها. الخطوات لاستكشاف جدوى منخفضة تشمل تقليل الوقت الهضم، والحد من شدة سحن، وتحقيق الاستفادة المثلى من عدد من الأجنة في المواد الاساسية. FACS إثراء السكان من الخلايا في المصالح (الخطوة 4) يمكن القول إن الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول. معايير الفرز الصارمة ضرورية لتوليد إعداد خلية واحدة تحتوي على العيش فقط الخلايا معربا عن بروتين فلوري من الفائدة. يمكن تلويث الخلايا من الشعوب الأخرى تؤدي إلى تمثيل كاذب من عدم التجانس بين الخلايا. والجدير بالذكر،لا يقتصر FACS إثراء يبلغ عدد سكانها تهم استراتيجية اثنين من لون هو مبين في هذا البروتوكول. يمكن للاستراتيجيات أكثر تعقيدا تنتج سكان الخلية أكثر دقة وهي وسيلة سريعة لتمديد منهجية ورد في دليل الدراسة المبدأ. في الخطوة 5، يمكن خلايا وحظ مباشرة إلى تأكيد عدد من الخلايا والقبض والصحة الخلية، والتعبير عن البروتين مضان. ولكن، وهذا يتوقف على حجم الخلية والسطوع، وfluorophore من الفائدة قد لا يكون كشفها بصريا وليس قراءات موثوقة. الانتهاء بنجاح من الخطوات 6-8 يتطلب الالتزام الدقيق بروتوكولات الشركة المصنعة.

وكدليل على المبدأ، تم تقييم مستويات التعبير عن مجموعة فرعية من علامات القلب المعروفة في واحدة مستمدة من BAC المعدلة وراثيا nkx2.5 خط الزرد التي سبق وصفها: ZsY لفحص علامات التمايز القلب في nkx2.5 الفردية: ZsY خلايا إيجابية في آخر 18 ساعة الإخصاب (HPF). لاستكشاف heterogeneiتاي من علامات التمايز التي أعرب عنها في nkx2.5 القبض: ZsY الخلايا معربا، ويعاير مجموعة من الجينات بما في ذلك الجينات التدبير المنزلي (ef1a، GAPDH)، عوامل النسخ المعروف أن تحول في وقت مبكر من مواصفات القلب (gata4، nkx2.5)، ل الثاني الميداني القلب السلف علامة (isl1)، والجينات المعروف أن تحولت لاحقا خلال تمايز القلب (myl7، vmhc). وقد تم قياس الوفرة النسبية للكل الجينات التي QRT-PCR عن طريق حساب عتبة دورة (CT). وبلغت قيمة CT أدنى تحسب 17.9 وكان أعلى مستوى 40، لا تمثل التضخيم (الجدول 1). واعتبرت القيم CT من> 35.0 أدناه الكشف.

من الخلايا 46 في مجموعة البيانات، تم استبعاد 6 بسبب التضخيم فشل أي الجينات. الخلايا المتبقية ودون تصنيف الخلايا في 5 أنواع على أساس التعبير عن gata4، nkx2.5، myl7، وvmhc، وورالبريد فرزها من حيث القيمة ef1a ضمن مجموعات. على الرغم من GAPDH أدرج أصلا باسم الجينات التدبير المنزلي ممكن، وكان التعبير متغير بدرجة كبيرة عبر الخلايا، مما يجعلها غير صالحة باسم الجينات التدبير المنزلي. التعبير GAPDH على الأرجح أفضل يمثل تغييرات على استقلاب الطاقة المرتبطة التمايز القلب في هذا نوع من الخلايا. ومن المثير للاهتمام، كان هناك خلية واحدة في الذي كان ef1a الامم المتحدة للكشف ولكن جين آخر كشف (gata1 في خلايا 26). وهذا يشير إلى أنه في حين ef1a هو عموما التدبير المنزلي الجينات الكافي للتمييز بين ردود الفعل خلية عكس النسخ احدة الناجحة وغير الناجحة، قد لا تكون مثالية لجميع التطبيقات. عدم التعبير ef1a في الخلية 26 يمكن أن يكون راجعا إلى خلية واحدة ديناميكية النسخي. وتبين دراسات الخلايا واحدة الأخيرة أن الاستنساخ الجيني هو العشوائية في الأساس، بالتناوب بين مراحل النشاط النسخي السريع ويذكر (26). تيوحي له النسخي نموذج الانفجار أن استخدام الجينات التدبير المنزلي للمقارنات كمية بين الخلايا واحد قد يكون غير مناسب تماما.

في المجموعة نوع 1، ef1a هو جين الوحيد للكشف. قد تشمل هذه الخلايا إما nkx2.5: ZsY خلايا السلبية أو الخلايا مع منخفض جدا التعبير عن الجينات الأخرى ذات الاهتمام. اكتب 2 الخلايا، مع استثناء من خلية 26، أعرب كل من ef1a وgata4 مع عدم وجود ارتباط في مستويات التعبير النسبية لهذه الجينات. والجدير بالذكر، قد يكون التعبير nkx2.5 في نوع 1 ونوع 2 الخلايا بسبب صرامة دون المستوى الأمثل FACS، انفجار النسخي، التسرب التحوير، أو مستويات التعبير عتبة الفرعية. نوع 3 خلايا أعربت المستويات التي يمكن اكتشافها من ef1a، gata4، وnkx 2.5. هذه الخلايا من المحتمل الخلايا الاولية القلب ويمكن أن تشمل التفريق العضلية الأذينية. اكتب 4 خلايا أعربت المستويات التي يمكن اكتشافها من ef1a، gata4، nkx2.5، myl7 </ م> وvmhc وهي خلايا المرجح التفريق في العضلية البطين. أعربت نوع 5 خلايا ef1a، gata4، nkx2.5، myl7، vmhc، وGAPDH. إضافة المستويات التي يمكن اكتشافها من GAPDH تشير إلى أن هذه الخلايا لديها القدرة على تعزيز عملية التمثيل الغذائي حال السكر وجدت في العضلية متباينة. وكان فضول أنه على الرغم من فرز للخلايا إيجابية ZsYellow من تيراغرام. (nkx2.5: ZsYellow)، الأجنة، 21/40 الزنازين كانت مستويات شبه عتبة من nkx2.5 في تحليل QRT-PCR لدينا وهذا يمكن أن يكون بسبب انفجار النسخي أو يمكن أن تعكس الاختلافات في معالجة النص بين nkx2.5 الذاتية وZsYellow. الأهم من ذلك، كان ثاني علامة isl1 مجال القلب غير قابلة للكشف في أي خلايا أو المجمعة كدنا] من جميع المواقع التقاط لدينا. وخلاصة القول، مقارنة عبر العينات، وعدم التجانس الكبير واضحا على مستوى خلية واحدة، مما يشير إلى أنه في 18 HPF، nkx2.5: ZsY + سلوتضم ليرة سورية الأسلاف القلب وكذلك ذرية في مراحل مختلفة من التمايز.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Supplies
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11254-20 For removing the chorion from embryos
Microcentrifuge tube 2 ml GeneMate C-3261-1
40 um cell strainer Biobasic SP104151
35 mm culture dish Falcon 351008
FACS tubes topped with 35 um cell strainer Falcon 352235
P1000 and tips Rainin 17005089
P20 and tips Rainin 17005091
IFC chip manufacturer's protocol Fluidigm 100-6117 Version 100-6117 E1 was used in representative experiment
Wide bore pastuer glass pippette VWR 14673-010 For transferring embryos
Adult wild type zebrafish N/A We used AB line
Adult transgenic zebrafish N/A We used Tg(nkx2.5:ZsYellow)
Name Company Catalog Number Comments
Reagents for cell dissociation
Double distilled water N/A
Instant Ocean Sea Salt Instant Ocean SS15-10
NaCl FisherScientific S271-3 make stock in water and use for de-yolking buffer
KCl Sigma Aldrich P5405 make stock in water and use for de-yolking buffer
NaHCO3 Sigma Aldrich S6014 make stock in water and use for de-yolking buffer
Leibovitz's L-15 Gibco 21083-027
FBS FisherScientific 03-600-511 Heat inactivate; any brand of FBS should be fine
Cell Dissociation Reagent 1 -TrypLE Life Technologies 12605-010 Store at room temperature.
Cell Dissociation Reagent 2 - FACSmax Genlantis T200100 Store -20; thaw on ice; bring to room temp before use
pronase (optional) Sigma P5147
L/D Dye - Sytox Blue Life Technologies S34857 Any live/dead stain suitable for flow cytometry will work
Trypan Blue Gibco 15250-061
Name Company Catalog Number Comments
Reagents for IFC plate use and qRT-PCR
Gene-specific probes Probes will vary by experiment
TaqMan Probe ef1a Life Technologies Dr03432748_m1
TaqMan Probe gata4 Life Technologies Dr03443262_g1
TaqMan Probe nk2-5 Life Technologies Dr03074126_m1
TaqMan Probe myl7 Life Technologies Dr03105700_m1
TaqMan Probe vmhc Life Technologies Dr03431136_m1
TaqMan Probe isl1 Life Technologies Dr03425734_m1
TaqMan Gene Expression Master Mix Life Technologies 4369016
Reagents listed in IFC manufacturer's protocol
C1 Reagent Kit Fluidigm 100-5319 Reagents for loading cells onto IFC plate
Ambion Single Cell-to-CTTM Life Technologies 4458237 Reagents for reverse transcription and pre-amplification steps
Molecular Biology Quality Water Corning 46-000CM
C1 IFC for PreAmp (5-10 um) Fluidigm 100-5757 IFC plate for small cells
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
C1 AutoPrep machine Fluidigm 100-5477 For IFC plate use
Hemocytometer  Sigma Aldrich Z359629 For counting cells and assessing cell size
Dissecting microscope For removing embryos from chorion
Tissue culture microscope For assessing single cell digestion
FACS machine For isolating cells of interest

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Speicher, M. R. Single-cell analysis: toward the clinic. Genome medicine. 5, (2013).
  2. Macaulay, I. C., Voet, T. Single cell genomics: advances and future perspectives. PLoS genetics. 10, e1004126 (2014).
  3. Marco, E., et al. Bifurcation analysis of single-cell gene expression data reveals epigenetic landscape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 5643-5650 (2014).
  4. Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Current opinion in biotechnology. 23, 110-119 (2012).
  5. Garlanda, C., Dejana, E. Heterogeneity of endothelial cells. Specific markers. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 17, 1193-1202 (1997).
  6. Diaz-Cano, S. J. Tumor heterogeneity: mechanisms and bases for a reliable application of molecular marker design. International journal of molecular sciences. 13, 1951-2011 (2012).
  7. Guo, G., et al. Mapping cellular hierarchy by single-cell analysis of the cell surface repertoire. Cell stem cell. 13, 492-505 (2013).
  8. Guo, G., et al. Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst. Developmental cell. 18, 675-685 (2010).
  9. Treutlein, B., et al. Reconstructing lineage hierarchies of the distal lung epithelium using single-cell RNA-seq. Nature. 509, 371-375 (2014).
  10. Kimmel, C. B. Genetics and early development of zebrafish. Trends in genetics : TIG. 5, 283-288 (1989).
  11. Liu, J., Stainier, D. Y. Zebrafish in the study of early cardiac development. Circulation research. 110, 870-874 (2012).
  12. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 203, 253-310 (1995).
  13. Zhao, S., Fung-Leung, W. P., Bittner, A., Ngo, K., Liu, X. Comparison of RNA-Seq and microarray in transcriptome profiling of activated T cells. PloS one. 9, e78644 (2014).
  14. McCall, M. N., McMurray, H. R., Land, H., Almudevar, A. On non-detects in qPCR data. Bioinformatics. 30, 2310-2316 (2014).
  15. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature. 3, 1101-1108 (2008).
  16. Lyons, I., et al. Myogenic and morphogenetic defects in the heart tubes of murine embryos lacking the homeo box gene Nkx2-5. Genes & development. 9, 1654-1666 (1995).
  17. Chen, J. N., Fishman, M. C. Zebrafish tinman homolog demarcates the heart field and initiates myocardial differentiation. Development. 122, 3809-3816 (1996).
  18. Zhou, Y., et al. Latent TGF-beta binding protein 3 identifies a second heart field in zebrafish. Nature. 474, 645-648 (2011).
  19. Paffett-Lugassy, N., et al. Heart field origin of great vessel precursors relies on nkx2.5-mediated vasculogenesis. Nature cell biology. 15, 1362-1369 (2013).
  20. McCurley, A. T., Callard, G. V. Characterization of housekeeping genes in zebrafish: male-female differences and effects of tissue type, developmental stage and chemical treatment. BMC molecular biology. 9, 102 (2008).
  21. Tang, R., Dodd, A., Lai, D., McNabb, W. C., Love, D. R. Validation of zebrafish (Danio rerio) reference genes for quantitative real-time RT-PCR normalization. Acta biochimica et biophysica Sinica. 39, 384-390 (2007).
  22. Serbedzija, G. N., Chen, J. N., Fishman, M. C. Regulation in the heart field of zebrafish. Development. 125, 1095-1101 (1998).
  23. de Pater, E., et al. Distinct phases of cardiomyocyte differentiation regulate growth of the zebrafish heart. Development. 136, 1633-1641 (2009).
  24. Hami, D., Grimes, A. C., Tsai, H. J., Kirby, M. L. Zebrafish cardiac development requires a conserved secondary heart field. Development. 138, 2389-2398 (2011).
  25. Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. Y. Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish. Developmental biology. 214, 23-37 (1999).
  26. Molina, N., et al. Stimulus-induced modulation of transcriptional bursting in a single mammalian gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 20563-20568 (2013).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 109، خلية واحدة، الزرد، مضاعفة، السلف القلب، والقلب، والتنمية
عزل وتوصيف الخلايا واحدة من اسماك الزرد الأجنة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Samsa, L. A., Fleming, N., Magness,… More

Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (109), e53877, doi:10.3791/53877 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter