本方案描述了一种从斑马鱼胚胎中分离单个细胞、富集目标细胞、在基于微流控的单细胞多重系统中捕获斑马鱼细胞，以及检测单个细胞基因表达的方法。
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本文内容
摘要
摘要
斑马鱼（Danio rerio）是研究脊椎动物发育的有力模式生物。尽管斑马鱼胚胎发育的许多方面已在形态学层面得到描述，但对生物体发育过程中发生的细胞变化的分子基础仍知之甚少。随着微流控和多重检测技术的最新进展，现在可以对单个细胞中的基因表达进行表征。这使得研究人员能够探究特定细胞群体中单个细胞之间的异质性，以鉴定和分类细胞亚型，表征细胞分化过程中出现的中间状态，并探索细胞对刺激的不同反应。本研究描述了一种从斑马鱼胚胎中分离出有活力的单细胞的实验方案，用于高通量多重检测分析。该方法可快速应用于任何带有荧光标记的斑马鱼胚胎细胞类型。该方法的扩展版本还可与高通量测序技术结合使用，以全面表征单细胞的转录组。作为原理验证，本研究检测了来自 nkx2.5 阳性心脏前体细胞的分离单细胞中心脏分化标志物的相对丰度。通过对单细胞水平及单一时间点的基因表达进行分析，研究结果支持一种模型，即心脏前体细胞与其正在分化的子代细胞共存。本文所述的方法和工作流程可广泛适用于斑马鱼研究领域，仅需一种带有标记的转基因鱼系以及微流控技术的使用权限。
引言
目前大多数细胞与分子生物学研究均基于群体平均值。然而，这些传统的基于群体的分析可能会掩盖重要的生物学事件，因为少数细胞群体在生物过程和疾病结局中可能发挥关键作用。在单细胞水平上理解异质性群体中的基因表达，能够（且已经）带来相关的生物学和临床见解1,2。在胚胎发育研究中值得关注的是，在较大的细胞群体中，前体细胞往往所占比例较低，这使得检测最终启动细胞命运决定的基因表达细微变化变得困难3。同样，同一种细胞类型在不同微环境刺激下可能表现出不同的表达谱4。例如，尽管具有共同的形态学和功能特征，同一器官或不同器官（例如，主动脉或肾脏）中的定居内皮细胞仍表现出显著的异质性5。此外，同一肿瘤中的癌细胞在单细胞水平上也可能具有不同的分子表达谱或突变6。
在模式系统中，单细胞转录组学已成功鉴定出新的细胞群体，表征了细胞分化过程中出现的中间状态，并揭示了细胞对刺激的不同响应7,8,9。这些发现若采用传统的基于细胞群体的研究方法则会被掩盖。斑马鱼胚胎是研究发育过程中单细胞异质性及细胞身份分子调控机制时被严重低估的干细胞、前体细胞和分化中细胞的来源。其高度保守的体外（ex vivo）发育过程以及易于进行遗传操作的特点，使其成为该研究策略的理想模型系统10,11。具体而言，解读单细胞基因表达数据的一个主要限制在于，....
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方案
本方案需要使用活体成年斑马鱼以产生胚胎。收集胚胎用于组织取材。开展本实验前，必须获得相关伦理审查委员会的批准。
1. 获取特定发育阶段的胚胎
- 实验前一天，准备健康的成年斑马鱼用于繁殖。将一条雄鱼和一条雌鱼分别放置于繁殖缸中透明隔板的两侧。
- 根据下游应用所需的足够胚胎数量，对必要数量的繁殖缸重复步骤1.1。从野生型鱼和在目标细胞类型中表达荧光蛋白的转基因鱼中获取胚胎。
注意：步骤 2-8 中下游应用所需的胚胎数量取决于目标时间点目标细胞的相对丰度。尽管该数量可能因细胞类型而异，但当目标细胞占比为 <受精后24小时（hpf）时占总细胞的1.0%。 - 次日早晨，将鱼转移到新的繁殖缸中以更换育苗缸内的水，并移除隔板。倾斜繁殖缸以促进鱼类交配。
- 收集处于特定发育阶段的胚胎。
- 每15分钟收集一次胚胎，方法是将成鱼转移至新的繁殖缸中，然后将留下的卵通过茶漏过滤收集。
注意：当斑马鱼胚胎在相似密度和温度条件下培养时，其发育是同步的。 - 用卵水（1 L 双蒸水中含 0.21 g/L Instant Ocean 盐）冲洗卵，并转移至培养皿中。将培养皿置于 28.5 ℃ 的湿润培养箱中 °C，带空气循环。
- 每15分钟收集一次胚胎，方法是将成鱼转移至新的繁殖缸中，然后将留下的卵通过茶漏过滤收集。
- 最后一次收集后 2 小时，将受精的多细胞胚胎分选至 10 c....
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结果
作为概念验证，通过检测基因表达来探究心脏发育过程中的分化动态。在斑马鱼中，心脏前体细胞起源于中胚层细胞群体，这些细胞迁移至前外侧板中胚层并融合形成线性心脏管。在融合之前，心脏前体细胞开始表达转录因子 nkx2.5 （NK2同源框5），被认为是心脏前体细胞最早的特异性标志物16,17此处，一种先前已描述的BAC转基因鱼 Tg(nkx2.5:ZsYellow)18, 简写 nkx2.5:ZsY 用于在受精后18小时（hpf）、18体节阶段对单细胞中的心脏分化标志物进行检测12这是首次可肉眼观察到ZsYellow信号的时间点。如先前对该转基因品系所述，ZsYellow标记心脏前体细胞，以及少数心外细胞，这些心外细胞在28 hpf时发育为咽弓内皮细胞。19 (图1A-B，数据未显示）。在18 hpf时， nkx2.5:ZsY 胚胎被解离为单细胞悬液，随后用Sytox Bl.......
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讨论
本文所述方法利用在细胞类型特异性启动子控制下的荧光蛋白表达，从斑马鱼胚胎中富集一群心脏前体细胞，用于微流控辅助的单细胞捕获系统，以检测单个细胞中部分心脏基因的表达情况。只要FACS激光激发和发射波长与所选荧光染料兼容，该方法可适用于任何荧光报告基因品系。目前已存在多种斑马鱼报告基因品系，且携带新型报告基因的转基因鱼可在短短3个月内构建完成。此外，该实验流程还可进行调整，用于从全转录组生成单细胞cDNA，以进行单细胞RNA测序。为此，需对步骤5-7进行轻微修改，以适配专为RNA测序文库构建而优化的cDNA制备化学体系。然而，在开展高通量测序应用之前，建议先使用本文所述方法验证细胞群体的异质性。
需要注意的是，所述方法存在一些局限性。首先，集成微流控回路（IFC）板的使用需要专用且昂贵的设备。然而，与传统的96孔和384孔板格式相比，微流控芯片在单细胞检测方面具有显著优势。通过在微米级通道中流动细胞和试剂，可将单个细胞定位至独立的捕获位点，并可直接观察以确认其为健康状态的单细胞。随后进行RNA提取与cDNA合成 原位 在IFC芯片上使用极低细胞量进行单个细胞操作。截至.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 C. Geoffrey Burns 博士提供的鱼类品系。作者感谢北卡罗来纳大学（UNC）流式细胞术核心设施、UNC-CGIBD AAC 核心为本项目提供的资源支持，以及 ZAC 设施在动物护理方面的帮助。L.S. 由美国国立卫生研究院（NIH）T32 基金 HL069768-13（项目负责人：Nobuyo Maeda）资助。N.F. 由美国国家科学基金会（NSF）研究生研究奖学金 NSF-DGE-1144081 资助。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）P30DK034987 基金（资助对象：UNC 高级分析核心）、美国心脏协会科学家发展基金 13SDG17060010、艾略特医学基金会新学者基金 AG-NS-1064-13（授予 Qian 博士）以及美国国立卫生研究院（NIH）R00 HL109079 基金（授予 Liu 博士）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 耗材 | |||
| Dumont #5 镊子 | Fine Science Tools | 11254-20 | 用于去除胚胎的卵膜 |
| 2 ml 微量离心管 | GeneMate | C-3261-1 | |
| 40 µm 细胞筛 | Biobasic | SP104151 | |
| 35 mm 培养皿 | Falcon | 351008 | |
| 顶部带 35 µm 细胞筛的 FACS 管 | Falcon | 352235 | |
| P1000 移液器及吸头 | Rainin | 17005089 | |
| P20 移液器及吸头 | Rainin | 17005091 | |
| IFC 芯片制造商的操作规程 | Fluidigm | 100-6117 | 代表性实验中使用版本 100-6117 E1 |
| 宽口巴斯德玻璃移液管 | VWR | 14673-010 | 用于转移胚胎 |
| 成年野生型斑马鱼 | N/A | 我们使用了 AB 品系 | |
| 成年转基因斑马鱼 | N/A | 我们使用了 Tg(nkx2.5:ZsYellow) | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 细胞解离试剂 | |||
| 双蒸水 | N/A | ||
| Instant Ocean 海盐 | Instant Ocean | SS15-10 | |
| NaCl | FisherScientific | S271-3 | 用水配制储备液，用于去卵黄缓冲液 |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405 | 用水配制储备液，用于去卵黄缓冲液 |
| NaHCO₃ | Sigma Aldrich | S6014 | 用水配制储备液，用于去卵黄缓冲液 |
| Leibovitz's L-15 培养基 | Gibco | 21083-027 | |
| FBS | FisherScientific | 03-600-511 | 热灭活；任何品牌的 FBS 均可使用 |
| 细胞解离试剂 1 - TrypLE | Life Technologies | 12605-010 | 室温保存 |
| 细胞解离试剂 2 - FACSmax | Genlantis | T200100 | -20°C 保存；冰上解冻；使用前恢复至室温 |
| 蛋白酶（可选） | Sigma | P5147 | |
| 死活染料 - Sytox Blue | Life Technologies | S34857 | 任何适用于流式细胞术的活/死染料均可使用 |
| 台盼蓝 | Gibco | 15250-061 | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 用于 IFC 板和 qRT-PCR 的试剂 | |||
| 基因特异性探针 | 探针根据实验而异 | ||
| TaqMan 探针 ef1a | Life Technologies | Dr03432748_m1 | |
| TaqMan 探针 gata4 | Life Technologies | Dr03443262_g1 | |
| TaqMan 探针 nk2-5 | Life Technologies | Dr03074126_m1 | |
| TaqMan 探针 myl7 | Life Technologies | Dr03105700_m1 | |
| TaqMan 探针 vmhc | Life Technologies | Dr03431136_m1 | |
| TaqMan 探针 isl1 | Life Technologies | Dr03425734_m1 | |
| TaqMan 基因表达主混合液 | Life Technologies | 4369016 | |
| IFC 制造商操作规程中列出的试剂 | |||
| C1 试剂盒 | Fluidigm | 100-5319 | 用于将细胞加载到 IFC 板上 |
| Ambion Single Cell-to-CTTM | Life Technologies | 4458237 | 用于逆转录和预扩增步骤的试剂 |
| 分子生物学级水 | Corning | 46-000CM | |
| C1 IFC 预扩增板（5-10 µm） | Fluidigm | 100-5757 | 适用于小细胞的 IFC 板 |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 设备 | |||
| C1 AutoPrep 仪器 | Fluidigm | 100-5477 | 用于 IFC 板操作 |
| 血细胞计数板 | Sigma Aldrich | Z359629 | 用于细胞计数和评估细胞大小 |
| 解剖显微镜 | 用于从卵膜中取出胚胎 | ||
| 组织培养显微镜 | 用于评估单细胞消化情况 | ||
| FACS 仪器 | 用于分离目标细胞 |
参考文献
- Speicher, M. R. Single-cell analysis: toward the clinic. Genome medicine. 5, (2013).
- Macaulay, I. C., Voet, T. Single cell genomics: advances and future perspectives. PLoS genetics. 10, e1004126(2014).
- Marco, E., et al. Bifurcation analysis of single-cell gene express....
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重印与许可
