Introduction
De fleste nuværende studier af cellebiologi og molekylær biologi er baseret på befolkningstal gennemsnit. Dog kan vigtige biologiske begivenheder blive maskeret af disse traditionelle populationsbaserede analyser, da mindre befolkninger kan spille vigtige roller i biologiske processer og resultater sygdom. Forståelse genekspression i heterogene populationer på enkelt celle niveau kan (og har) føre til relevante biologiske og kliniske indsigt 1,2. Af bekymring for embryonale udviklingsstudier, i en større population af celler, stamceller er ofte underrepræsenteret, hvilket gør det udfordrende at opdage subtile ændringer i genekspression, som i sidste ende initierer celle skæbne beslutninger 3. Tilsvarende kan en enkelt celletype have forskellige udtryk profiler i afhængighed af mikromiljøet 4. For eksempel residente endotelceller i samme organ eller i forskellige organer (f.eks., Aorta eller nyrer) udviser signifikant heterogenitet trods deling fælles MORPhological og funktionelle egenskaber 5. Desuden kan cancerceller befolker samme tumor også have varierende molekylære profiler eller mutationer på enkelt celle niveau 6.
I modelsystemer har transcriptomics i enkeltceller med succes identificeret nye cellepopulationer, kendetegnet mellemliggende tilstande, der opstår under celledifferentiering og afslørede differentielle cellulære responser på stimuli 7,8,9. Sådanne indsigter ville have været maskeret i konventionelle populationsbaserede studier. Zebrafisk embryoner er en uhyre underudnyttet kilde til stamceller, stamfader, og differentiere celler til at udforske spørgsmål om enkelt celle heterogenitet og molekylær regulering af cellulære identiteter under udvikling. Deres yderst stereotype, ex vivo udvikling og nem genetisk manipulation gør dem til et fremragende modelsystem for denne fremgangsmåde 10,11. Specielt har en væsentlig begrænsning for fortolkning af enkelt celle gene udtryk data er, at pålidelig identifikation af nye mellemliggende celle stater under udvikling kræver meget omhyggelig timing af væv samling 9. Dette er nødvendigt for at sikre, at heterogenitet mellem opfangede celler repræsenterer heterogenitet inden et væv på et enkelt tidspunkt i stedet for heterogenitet i genekspression præsenteret af aldersbetinget celledifferentiering. Sammenlignet med mus, kan zebrafisk embryo udvikling præcist synkroniseret på et stort antal embryoner 12. Derudover, med stor kobling størrelser, zebrafisk embryoer kan anvendes som en rigelig kilde til stamceller og progenitorceller.
Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til isolering af celler fra zebrafisk embryoner og fange enkeltceller ved anvendelse af et kommercielt tilgængeligt integreret kredsløb mikrofluidik (IFC) chip og autopræp for QRT-PCR-genekspression analyse. Denne protokol kan være hurtigt overføres til enhver high throughput multiplexing analyser, herunder heletranskriptom sekvensering, der giver mere omfattende analyse af cellulær heterogenitet 13. Det giver også flere fordele til traditionelle genekspression assays. Den enkelt celle isolation protokol giver høj levedygtighed efter FACS, som nedsætter andelen af inficerede celler, der er inkluderet i efterfølgende anvendelser. Ved at bruge en IFC kan indfangede celler direkte observeret at evaluere opsamlingsprocent og vurdere celle sundhed morfologisk. Desuden denne protokol er bredt anvendelig til zebrafisk forskningsverden, som kun kræver en mærket transgene fisk linje og adgang til mikrofluide celle capture teknologi.
Som bevis på princippet blev enkelte celler afledt af hjerte-progenitorer isoleret og fanget på en IFC-chip, og derefter den relative forekomst af hjerte- differentieringsmarkører blev målt ved QRT-PCR. Genekspression analyse på enkelt celle niveau viser, at hjerte-stamfædre sameksistere med deres Forskelntiating afkom. Den indsigt erfaringer fra encellede profilering af hjerte stamfædre kan kaste lys over heterogenitet i genekspression mønstre blandt hjerte-stamceller under hvirveldyr udvikling, som kan være blevet maskeret i traditionelle populationsbaserede analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol kræver brug af levende, voksne zebrafisk til at producere embryoer. De embryoner høstes til væv samling. Det er vigtigt at indhente godkendelse fra relevante etik anmeldelse boards til at gennemføre dette eksperiment.
1. Få Gradvise Embryoner
- Dagen før eksperimentet, tilberede sund, voksen zebrafisk til avl. Placer en han og en hun på modsatte sider af en klar skillelinje i en avl tank.
- Gentag 1.1 for så mange ynglende tanke som er nødvendige for en tilstrækkelig embryo produktion til nedstrøms anvendelse. Opnå embryoner fra både vildtype fisk og transgene fisk, der udtrykker fluorescerende proteiner i celletypen af interesse.
BEMÆRK: Antallet af embryoner, der er nødvendige for downstream applikationer i Steps 2-8 afhænger af den relative forekomst af cellerne af interesse på det tidspunkt, punkt af interesse. Selvom dette kan variere afhængigt af celletype, 200 embryoner producerer 2.000-5.000 sorterede celler, når calen af interesse udgør <1,0% af de samlede celler ved 24 HPF (timer efter befrugtningen). - Den næste morgen, skifte vand i den opdræt tanken ved at overføre fisk til en frisk avl tank og fjern divider. Tip beholderen i en vinkel til fremme avl.
- Saml iscenesat embryoner.
- Hver 15 min, indsamle embryoner ved at overføre de voksne til en frisk avl tank og passerer æg, som efterladt gennem en tesi.
BEMÆRK: zebrafisk embryoner udvikler synkront når fastholdes på sammenlignelige tætheder og temperaturer. - Skyl æggene med Egg Vand (0,21 g / L Instant Ocean salte i en L dobbelt destilleret vand) og overføres til en petriskål. Overfør petriskål til et fugtigt inkubator ved 28,5 ° C med luftcirkulation.
- Hver 15 min, indsamle embryoner ved at overføre de voksne til en frisk avl tank og passerer æg, som efterladt gennem en tesi.
- To timer efter den sidste indsamling, sortering befrugtet, flercellede embryoner i 10 cm petriskåle og reducere tætheden til 50 embryoner pr fad. Vælg embryoner fra en enkelt, 15min tid vindue for indsamling til downstream ansøgning. Inkuber embryoner ved 28,5 ° C.
BEMÆRK: For eksempel, indsamle embryoner 8:30, 8:45, 9:00, 9:15, 9:30, 9:45, 10:00 og 10:15. Sammenligning på tværs tidspunkter, hvis det største antal befrugtede embryoner er fra kløerne indsamlet på 9:00, og derefter bruge kun disse embryoner til efterfølgende anvendelser.
2. Opsætning for Single Cell Dissociation
- Ca. 30 min før tid interessepunkt (18 HPF) fjerne embryoner fra deres chorion manuelt med fine pincet.
- Indsamle og mærke følgende for hver betingelse: to 2 ml mikrocentrifugerør, en 40 um celle si, en 35 mm cellekultur fad, og to FACS rør toppet med en 35 um celle si.
- Chill følgende reagenser på is: Egg Vand indeholder 0,21 g / L Øjeblikkelig Ocean salte i 1L dobbelt destilleret vand; De-yolking buffer indeholdende 55 mM NaCl, 1,8 mM KCI, og 1,25 mM NaHCO3; og FACS puffer indeholdende Leibovitz L-15 medium suppleret med 5% varmeinaktiveret føtalt bovint serum.
- Bring 1 ml pr prøve af Cell Dissociation reagens 1 til RT. Thaw 1 ml Cell Dissociation Reagens 2 per prøve på is. Bring til stuetemperatur umiddelbart før anvendelse.
3. Single Cell Dissociation
- Ved hjælp af en bred boring glas pipette 100-300 embryoer til en 2 ml micro centrifugerør i et minimalt volumen af Egg Vand.
- Euthanize embryoner ved at erstatte vand med 1 ml iskold Egg Vand og nedsænke røret i is i 20 minutter.
ADVARSEL! Det er afgørende at opnå godkendelse fra rette institutionelle dyr pleje tilsyn udvalg for denne eutanasi metode (nedkøling på is efterfulgt af celle dissociation som sekundær dødshjælp). Standard dødshjælp kræver typisk, at embryoner <3 dage efter befrugtningen er bleget efter de er kølet, hvilket ikke er hensigtsmæssigt for at opnå levedygtige celler. - Vask embryoner to gange med 1 ml iskold Egg Vand. At vaske, bruge en bred boring glas pipette til at fjerne æg vand og en P1000 at tilføje Egg Water.
- Fjern blommen ved at erstatte embryo vand med 1 ml Deyolking Buffer og findeling 8-12 gange med en P1000 spids, eller indtil blommen er opløst, og kun ligene af embryoner er synlige.
- Indsamle vævet ved centrifugering ved 300 x g i 1 min. Brug en pipette til forsigtigt at fjerne supernatanten uden at forstyrre vævet pellet. Re-suspendere i 1 ml Egg vand.
- Gentag trin 3.5 for i alt tre gange vask, men på den sidste vask resuspender i 1 ml RT Cell Dissociation reagens 1.
- Inkuber i Cell Dissociation Reagens 1 i 10 minutter ved stuetemperatur med rør placeres vandret. Hver 2-3 min, forsigtigt tritureres med en P1000 pipette for at forhindre sammenklumpning.
BEMÆRK: Håndter prøver forsigtigt under findeling trin. Engang et enkelt, stort klump danner i røret fra et virvar af embryo organer. Dette vildispergere med yderligere fordøjelse hjulpet ved forsigtig triturering. MÅ IKKE VORTEX. - Indsamle væv ved centrifugering ved 300 xg i 3 min. Fjern supernatanten og resuspender i 1 ml Cell Dissociation Reagens 2.
- Inkuber i 5-15 minutter ved stuetemperatur. Anbring glassene vandret. Hver 2-3 min, blidt tritureres at forhindre sammenklumpning. Hver 5 min, vurderer fordøjelsen fremskridt.
- For at vurdere fordøjelse fremskridt, fortyndes 2 pi supernatant i 18 pi FACS buffer og pipette som en dråbe på en celledyrkningsskål.
- Placer et dækglas over prøven og observere under en vævskultur mikroskop ved 10X og 20X forstørrelser.
BEMÆRK: Præparatet skal fremstå som en blanding af enkelte celler, små klynger, store klynger, og lejlighedsvis meste-intakt embryo krop. - vurderer Visuelt andelen af præparatet, der er enkelte celler og små klynger.
BEMÆRK: Over-fordøjelse vil reducere levedygtigheden; under-fordøjelse vil reducere enkelt celle udbytte. </ Li>
- Opsaml cellepræparat ved centrifugering ved 300 xg i 5 minutter. Supernatanten fjernes, og re-suspendere i 1 ml kold FACS Buffer.
- Fugt en 40 um cellefilter med FACS puffer. Pass cellesuspensionen gennem 40 um cellefilter på en 35 mm cellekultur skål. Vask cellesigte én gang med 1 ml FACS-sortering buffer.
- Overfør gennemløbet i et 2 ml mikrocentrifugerør. Indsamle cellerne ved centrifugering ved 300 xg i 5 minutter og genopslæmmes i 100 pi FACS buffer.
- Tæl celle udbytte under anvendelse af et hæmocytometer. Fortynd prøver til 5x10 6 celler pr ml eller optimal koncentration anbefales til FACS maskine af valg. Optional-Når tælle celle afkast på hæmocytometeret, kontrastfarve døde celler med trypanblåt at bekræfte levedygtighed af cellen forberedelse forud for FACS sortering.
BEMÆRK: Forberedelser, der også fortyndede vil tage overskydende mængde tid til at sortere. Forberedelser, der er for concentrated tendens til at klumpe til multimerer og er suboptimale til sortering en ren population. - Reserve 10-20% af hver prøve til brug som ufarvede kontroller. For de resterende prøver, bejdse døde celler ved at tilføje en fluorescerende levende / døde (L / D) diskrimination farvestof i hver prøve. Kan ikke vaskes.
BEMÆRK: Enhver fluorescerende farvestof, som trænger celler med kompromitterede cellemembraner og pletter nukleinsyrer kan anvendes som L / D farvestof, forudsat at fluorescensspektrene er forenelig med FACS maskine af valg og fluorofor mærkning celler af interesse.- Vask ikke præparatet efter tilsætning af farvestof som nogle celler vil dø i transit til FACS oprensning og bør udelukkes fra den sorterede population.
- Fugt 35 um celle si udjævnede FACS rør med 20 pi FACS-buffer. Føj celler til sien og indsamle ved hjælp af tyngdekraften. Opbevar på is.
4. FACS Berigelse
- Brug FACS at berige for enkelt, Levende celler, der udtrykker fluorescerende markør.
- Sæt en port til at skelne celler fra snavs på et scatter plot af fremadrettet spredning (FSC-A) amplitude vs sidespredning amplitude (SSC-A), begge med lineær skalering.
Forsigtig! Zebrafisk celler er typisk mindre end muse eller humane celler. Dette afspejles i en lavere basal adskillelse mellem celler og snavs. - Fra porten sat i 4.1.1, sætte en port til at berige for enkelte celler og eksklusive multimerer bruger et scatter plot af fremadrettet scatter højde (FSC-H) og lave side scatter højde (SSC-H), begge med lineær skalering.
BEMÆRK: Celler med uforholdsmæssig høj FSC-H og lav SSC-H er sandsynlige multimerer og er udelukket fra sortering. - Fra porten sæt i 4.1.2, ved hjælp af kontroller enkelt farve, sætte en port til kun at omfatte levende celler ved hjælp af et scatter plot af FSA-A med lineær skalering og amplitude af kanalen anvendes til at påvise L / D pletten med log skalering. Medtag L / D-negative celler.
- Fraporten sat i 4.1.3, anvendes enkelt farve kontrol, sætte en port til kun at omfatte levende celler med positiv fluorescens ved hjælp af et scatter plot af FSA-A med lineær skalering og amplitude af kanalen anvendes til at detektere fluorescerende protein celle markør med log skalering . Omfatte positive celler.
- Sæt eventuelle kompensation kontrol, om nødvendigt, at tage højde for interferens mellem L / D pletten og fluorescerende protein spektre.
- Sæt en port til at skelne celler fra snavs på et scatter plot af fremadrettet spredning (FSC-A) amplitude vs sidespredning amplitude (SSC-A), begge med lineær skalering.
- Indstil slags logik til celler, der falder ind i alle portene, der er i trin 4.1.
- Brug dobbelt mærkede celler, kontrollere gating for celle sortering.
BEMÆRK: Celler til sortering vil være celler snarere end vragrester, enkelte celler snarere end multimerer, L / D negative og fluorescens positive celler.
- Brug dobbelt mærkede celler, kontrollere gating for celle sortering.
- Sorter 2.000-4.000 celler fra populationen af interesse i 5 pi kold FACS-buffer i et mikrocentrifugerør på is. For at minimere klipning og belastning af celler under sortering, bruge de laveste tryk muligt for cellensorteringsanlæg.
BEMÆRK: 5 pi dråbe af FACS buffer tjener som en stødpude for celler forlader FACS-maskine. Indsamling 2.000-4.000 celler direkte i FACS buffer eliminerer behovet for centrifugering før læsset IFC chips. Denne strategi anbefales, fordi centrifugering kan føre til dannelse af multimerer, hvis celler klæber til hinanden i pelleten. - Vurdere den post-sortering levedygtighed analyse.
- Overfør 1 pi sorteret celler til et frisk FACS rør med 100 pi FACS-sortering buffer og 1: 1.000 fortynding af L / D plet. Passere cellerne gennem FACS sorteringsanlæg med gating strategi i trin 4.1. Brug andelen af L / D negativ til positiv at estimere levedygtigheden af sorterede celler.
5. vejeceller onto Microfluidics Chip
- Anvendelse af et hæmocytometer, måle både koncentrationen og størrelsen af sorterede celler.
- Fortynd sorterede celler til mindst 10 pi. Fortynd en alikvot af 5 μL celler med 5 pi trypanblåt. Læg på hæmocytometer og anvende dækglas.
- Saml lyse felt billeder af alle celler i 4 x 4 gitre af hæmocytometer. Tæl antallet af levende celler og beregne levende celler / ml. Levende celler ikke tager op trypanblåt.
BEMÆRK: Brug en standard billedanalyse software til at måle diameteren af alle levende celler. Beregn gennemsnittet og standardafvigelsen af cellen størrelse, og vælg en IFC plade egnet til cellestørrelse vifte af interesse. Hvis cellestørrelse sortiment skræver en IFC plade cellestørrelse rækkevidde, bruge flere plader til at indfange hele spektret af celler af interesse.
- Vejeceller på at IFC plade ifølge producentens instruktioner (se materialer).
- Fortynd celler til 1x10 6 celler / ml og udfører opdrift optimering i henhold til producentens anvisninger.
BEMÆRK: flydeevne optimering sikrer, at celler hverken synker til bunds eller flyde til toppen af loading well for optimal lastning på IFC chip. Forholdet mellem buffer til celler kan variere fra celletype, men ligger typisk i intervallet 6: 4-7: 3 af celler: buffer. - Tilføj celler til primet-IFC plade. Load plade i kompatible fluidics maskine, og køre en celle belastning script til at skubbe celler gennem mikrofluidik kredsløb og ind capture baner.
- Fortynd celler til 1x10 6 celler / ml og udfører opdrift optimering i henhold til producentens anvisninger.
- Bekræft, at celler er indgivet i indfangningsstedet på IFC plade.
- Fjern IFC plade fra fluidik maskine. Monter IFC plade på et mikroskop forsynet med en plade adapter.
- Indsamle snapshots af lysfelt og fluorescensen af hver capture site ved 10X forstørrelse.
BEMÆRK: Lysfelt capture tider kan variere fra 10-50 ms, afhængig af lampens intensitet. Fluorescens capture tider kan ligge i området fra 250-750 ms, afhængigt af fluorofor lysstyrke. Undgå overeksponering celler for at forhindre lysbeskadigelse.
6. cDNA Synthesis
- Udfør cellelyse in situ ifølge jegFC plade producentens anvisninger.
- Tilføj lysis buffere til brønde på IFC plade. Belastningsplade på kompatible fluidik maskine og køre cellelysis script i henhold til producentens anvisninger.
- Udføre revers transkription ifølge IFC plade producentens anvisninger.
- Tilføj revers transkription reagenser til IFC plade. Belastningsplade på kompatible fluidik maskine. Kør revers transkription script. Sample cykelforhold: 1 cyklus ved 25 ° C i 10 minutter, 1 cyklus ved 42 ° C i 1 time, derefter 1 cyklus ved 85 ° C i 5 minutter.
- Udføre præ-amplifikation med genspecifikke prober ifølge IFC plade producentens anvisninger.
BEMÆRK: På grund af deres større specificitet med lavt kopiantal, bruge fluorogene-mærkede prober snarere end sonder optimeret til brug med interkalator farvestoffer.- Pool primere og fortyndes til den endelige 180 nM hver. Tilføj pooled primere til IFC plade. Load plade på kompatible fluidics maskine. Kør preamplification script.
- Udføre præ-amplifikation med de følgende cyklusbetingelser: 1 cyklus ved 95 ° C i 10 minutter, derefter 18 cyklusser med denaturering ved 95 ° C i 15 sekunder og derefter annealing og forlængelse ved 60 ° C i 4 min. Store pre-amplificeret cDNA ved 4 ° C indtil høst. Harvest cDNA fra mikrofluid plade ifølge producentens anvisninger og opbevares ved -20˚C indtil brug.
7. Vælg cDNA fra enkelte celler til Single Target QRT-PCR
- Fortynd cDNA i 25 pi fortynding reagens ifølge producentens anvisninger.
BEMÆRK: Anslået endelige udbytte er 28 pi af præ-forstærket cDNA per celle. Reservere en portion af fortyndingsmiddel til anvendelse som en kontrol uden template i QRT-PCR.- Med henvisning til lyse felt og fluorescerende billeder optaget i trin 5.3.2, score hver fange site. Manuelt tælle og registrere antallet af celler. Vurdere og registrere, om hver celle er influenzaorescent.
BEMÆRK: Hver enkelt websted kan indeholde 0, 1, eller> 1 celle, hvor> en celle indeholder capture websteder, der indeholder flere celler og / eller uidentificerbare vragrester. Hvis billederne er tilstrækkelige kvalitet, kan en pixelværdi også tildeles kvantificere intensiteten af fluorescenssignalet.
- Med henvisning til lyse felt og fluorescerende billeder optaget i trin 5.3.2, score hver fange site. Manuelt tælle og registrere antallet af celler. Vurdere og registrere, om hver celle er influenzaorescent.
- Vælg prøver til QRT-PCR-analyse.
- Vælg cDNA prøver fra indfangningsstedet identificeret i trin 7.2, der indeholder præcis en celle med positiv fluorescens. Pool 1 pi alikvoter af cDNA fra hver prøve.
BEMÆRK: Dette er "Pool" positiv kontrol anvendes til at bestemme, om generne af interesse er udtrykt i nogen af de valgte celler. - Vælg cDNA fra mindst én capture site, der indeholder nøjagtig 0 celler som en negativ kontrol. Brug fortyndingsmiddel fra trin 7.1.2 som en kontrol uden template.
- Vælg cDNA prøver fra indfangningsstedet identificeret i trin 7.2, der indeholder præcis en celle med positiv fluorescens. Pool 1 pi alikvoter af cDNA fra hver prøve.
- Kør QRT-PCR-assay.
- Brug kun sonder anvendes til præ-forstærkning i trin 6.4.1. Læg alle prøver i triplicate. Cykling betingelser for en 10 pi reaktion på en 384 brønd plade: 1 cyklus 50 ° C 2 min, 1 cycle 95 ° C i 10 min, 40 cyklusser med denaturering ved 95 ° C 15 sek derefter annealing og forlængelse ved 60 ° C i 1 min.
8. Data Analysis
- Validere QRT-PCR produkter af standard gelelektroforese. Bekræft produkt er et enkelt bånd på forventet molekylvægt (varierer for hver probe).
BEMÆRK: Hvis en sonde producerer flere bands eller en enkelt bånd på en uhensigtsmæssig størrelse, så specificitet er tvivlsom, og dette udelukker genet fra analysen. - Undersøg alle forstærkning kurver og højde for eventuelle afvigelser 14. Beregn den gennemsnitlige CT værdi for hver prøve / genkombinationen 15.
BEMÆRK: CT-værdier for positive kontroller typisk spænder 10-30. CT-værdier for negative kontroller typisk i området fra 35-40 (ingen amplifikation). Ct-værdier 30-35 anses for meget lav ekspressionog bør fortolkes med forsigtighed 14. - rapport data
- Hvis prøverne falder i CT = 10-30, kan også rapporteret data som gange ændring i transkript overflod i forhold til en kontrolprøve.
BEMÆRK: Fold forandring er lig med 2 ^ (- ΔΔCT) hvor ACt er i forhold til en husholdning gen ved at subtrahere den gennemsnitlige CT af prøven fra husholdning genet og ΔΔCT er forskellene i ACt mellem prøven og en positiv kontrol 15.
- Hvis prøverne falder i CT = 10-30, kan også rapporteret data som gange ændring i transkript overflod i forhold til en kontrolprøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som bevis på princippet blev genekspression vurderes at udforske differentiering dynamik under hjerte-udvikling. I zebrafisk, opstår kardiale progenitorer fra en mesodermal population af celler, der migrerer til den forreste lateral plade mesoderm hvor de smelter til dannelse af den lineære hjerte røret. Før fusion, hjerte- progenitorer begynde at udtrykke transkriptionsfaktoren Nkx2.5 (NK2 homeobox 5), som menes at være den tidligste specifik markør for hjerte-progenitorer 16,17. Her en tidligere beskrevet BAC transgene fisk Tg (Nkx2.5: ZsYellow) 18, forkortet Nkx2.5: blev ZSY anvendt til at undersøge hjerte- differentiering markører i enkelte celler i 18 somit scenen, 18 timer efter befrugtning (HPF) 12. Dette var det tidligste tidspunkt, på hvilket ZsYellow signal var synlige. Som tidligere beskrevet for denne transgene linie, ZsYellow etiketter cardiac progenitorer, som vill som et par ekstra-kardiale celler, der giver anledning til buen endotelceller ved 28 HPF 19 (figur 1A-B, data ikke vist). Ved 18 HPF, Nkx2.5: blev ZSY embryoer dissocieret til en enkelt cellesuspension derefter farvet med Sytox Blå at udelukke døde celler. Levende, ZsYellow positiv, Sytox Blå negative celler var FACS sorteres ved hjælp af enten en MoFloXDP eller Sony SH800Z sorteringsanlæg udstyret med 100 um dyse (Figur 1C-F). For at vurdere renheden af de sorterede population og post-sortering levedygtighed, blev en alikvot af sorterede celler farvet med Sytox blå og evalueret procentdelen af begivenheder, der faldt inden for den oprindelige sortering gate (figur 1G-J).
Efter sortering blev celler indgået en integreret mikrofluid kredsløb (IFC) chip arbejde flow (figur 2A) ifølge producentens instruktioner. Et hæmocytometer, kombineret med trypanblåt exclusion blev anvendt til måling cellediameter, koncentration, og levedygtighed (figur 2B, og data ikke vist). Celle opdrift blev optimeret (6,5: 3,5 celler: buffer) ifølge producentens instruktion, og cellerne blev fyldt på en IFC at fange 5-10 um diameter celler. For at vurdere capture effektivitet, fluorescens og / eller lyse felt signaler blev afbildet på alle indfangningsstedet, blev en flisebelægning funktion i FIJI bruges til at sy et enkelt billede af mikrovæskeanordning pladen. Hver opfangningsstedet indeholdt 0, 1 eller> 1 individuelle celler (figur 2C-F). Som forventet fra FACS berigelse, indfangede celler udtrykte ZsYellow (figur 2G). Indfangningseffektivitet oversteg 90% i 5 individuelle eksperimenter under anvendelse Nkx2.5: ZSY sorteret celler, og mindst 70% af indfangningsstedet blev besat af en enkelt celle (data ikke vist). Cellerne blev lyseret, RNA isoleret, cDNA syntetiseret og specifikke målgener blev amplificeret, alt efter producentens anvisninger.
En undergruppe af celle- indfangningsstedet blev udvalgt til QRT-PCR-analyse som beskrevet i protokollen ovenfor. Specifikt forlængelsesfaktor 1a (efl1a) 20 og glyceraldehyd-3-phosphat (GAPDH) 21 blev analyseret som husholdningsgener forventes at blive udtrykt i hver celle; GATA-bindende protein 4 (gata4) 22 og NK2 homeobox 5 (Nkx2.5) som tidlige kardiale progenitor markører; ISL LIM homeobox 1 kasse 1 (isl1) som en anden hjerte felt markør 23,24; og myosin let kæde (myl7) og ventrikulær myosin tung kæde (vmhc) 25 for at markere ventrikulære cardiomyocytter. Genspecifikke prober blev valideret ved anvendelse af cDNA fra 48 HPF embryoner (figur 3). QRT-PCR blev anvendt til at vurdere relative genekspression af disse gener i 45 enkeltceller fra 18 HPF embryoner, en uden template negativ kontrol, og en poolet population positive kontrolceller containing cDNA fra alle 96 indfangningsstedet. Raw CT-værdier for 40 repræsentative celler og kontroller er vist i tabel 1. Navnlig fra puljen af 46 celler undersøgt, blev 6 celler udelukket fra analysen, fordi alle genekspression Ct-værdier oversteg CT = 35,0, og det er uvist, om disse high CT værdier kan henføres til sande, meget lave udtryk niveauer eller prøve nedbrydning. Da området CT-værdier for husholdning gen, ef1a, var for bred til at sammenligne genekspression mellem prøver, og mange Ct-værdier oversteg 30 blev CT-værdier visualiseret som en varme kort (figur 3). Sammenligning tværs prøver blev væsentlig heterogenitet i genekspression iagttages, og cellerne blev klassificeret celler såsom type 1-5 baseret på ekspressionsmønster (figur 3).
Figur 1. Enkelt celle isolering af zebrafisk
Figur 2. Enkelt celle indfangning af zebrafisk Nkx2.5: ZSY
igur 3 "src =" / files / ftp_upload / 53.877 / 53877fig3.jpg "/>
Figur 3. Gen-ekspression analyse af fange enkelt zebrafisk Nkx2.5:. ZSY positive celler genekspression ved QRT-PCR i positive kontroller (embryoner på 2 dage post-befrugtning, puljede cDNA fra enkelte celler), negativ kontrol (no-skabelon ) og 40 enkeltceller (Cell 01-40). Raw CT værdier blev farvekodede baseret som beskrevet i Key. Ef1a = elongeringsfaktor 1a, gata4 = GATA bindende protein 4, Nkx2.5 = NK2 homeobox 5, myl7 = myosin let kæde 7, vmhc = ventrikulær myosin tung kæde, GAPDH = glyceraldehyd-3-phosphat, og isl1 = ISL LIM homeobox 1. klik her for at se en større version af dette tal.
| Cycle Threshold (CT) | ||||||||
| ef1a | gata4 | nkx25 | myl7 | vmhc | GAPDH | isl1 | ||
| Foster | 20,69 | 20,92 | 28,59 | 32,87 | 26.30 | 27.00 | 33,57 | |
| Pool | 26.4 | 22.4 | 27.7 | 27.4 | 24.5 | 29.2 | 40,0 | |
| NTC | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Type 1 | Celle-01 | 25.1 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 |
| Celle-02 | 25.4 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Celle-03 | 26.3 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Celle-04 | 27.4 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Celle-05 | 28,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Celle-06 | 28.2 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Celle-07 | 29,3 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 400,0 | |
| Celle-08 | 30,7 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Celle-09 | 34.3 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Type 2 | Celle-10 | 23.5 | 28,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 26.3 | 40,0 |
| Celle-11 | 23.5 | 27.2 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Celle-12 | 23,7 | 17.9 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Celle-13 | 24.1 | 32.4 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Celle-14 | 24.9 | 27,5 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Celle-15 | 25.9 | 28,6 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Celle-16 | 26,0 | 28,1 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Celle-17 | 27,0 | 27.7 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 38,5 | 40,0 | |
| Celle-18 | 27,0 | 27.4 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Celle-19 | 27,0 | 30,2 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 38.2 | 40,0 | |
| Celle-20 | 27,0 | 28.2 | 40,0 | 40,0 | 400,0 | 39.2 | 40,0 | |
| Celle-21 | 27.7 | 30,3 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 38,6 | 40,0 | |
| Celle-22 | 30.4 | 26.2 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 38.3 | 40,0 | |
| Celle-23 | 31,3 | 22.4 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 39,7 | 40,0 | |
| Celle-24 | 31.5 | 28,8 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 39.5 | 40,0 | |
| Celle-25 | 33.8 | 27.4 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 37.3 | 40,0 | |
| Celle-26 | 40,0 | 27.4 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 36,6 | 40,0 | |
| type 3 | Celle-27 | 24.7 | 19.9 | 28,8 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 |
| Celle-28 | 24.8 | 28.4 | 26.3 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Celle-29 | 25.1 | 23.5 | 27.6 | 40,0 | 40,0 | 32,5 | 40,0 | |
| Celle-30 | 26.3 | 21.4 | 27,5 | 40,0 | 40,0 | 39.9 | 40,0 | |
| Celle-31 | 26,9 | 24.8 | 28.2 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Celle-32 | 27,0 | 22.5 | 23.8 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Celle-33 | 27.8 | 27.6 | 27.7 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Celle-34 | 28,1 | 21.9 | 26.6 | 40,0 | 40,0 | 37,7 | 40,0 | |
| Celle-35 | 29,3 | 26.5 | 28,1 | 40,0 | 40,0 | 38.3 | 40,0 | |
| type 4 | Celle-36 | 24.8 | 20.3 | 26,0 | 27.4 | 26.6 | 40,0 | 40,0 |
| Celle-37 | 28,7 | 22.3 | 25.9 | 28,9 | 22.9 | 38,5 | 40,0 | |
| Type 5 | Celle-38 | 25.5 | 20,0 | 29,3 | 23,0 | 19.9 | 25.9 | 40,0 |
| Celle-39 | 25.9 | 21.8 | 28,6 | 25.1 | 21,7 | 25,7 | 40,0 | |
| Celle-40 | 28,9 | 22,0 | 27,0 | 23,0 | 21.3 | 27.6 | 40,0 | |
Tabel 1. Raw CT-værdier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den heri beskrevne fremgangsmåde anvender ekspression af et fluorescerende protein under kontrol af en celletypespecifik promotor til berigelse af en population af kardiale progenitorceller fra zebrafisk embryoner til anvendelse i mikrofluid assisteret enkelt celle capture system til at vurdere ekspression af en undergruppe af kardiale gener i enkelt celler. Forudsat at FACS laser excitation og emission kapaciteter er forenelige med fluoroforen (e) valg, kan denne fremgangsmåde anvendes til enhver fluorescerende reporter linje. Mange zebrafisk reporter linjer er allerede findes, og transgene fisk transporterer nye journalister kan genereres i så lidt som 3 måneder. Derudover kan dette arbejde flow tilpasses til fremstilling af cDNA fra hele transkriptom til enkelt-celle-RNA-sekventering. For at gøre dette, trin 5-7 skal ændres en smule til brug med kemi optimeret til fremstilling af cDNA til at generere biblioteker er egnede til RNA-sekventering. Imidlertid er det tilrådeligt at validere befolkning heterogenitetved anvendelse af fremgangsmåden beskrevet her forud for pursing high throughput sekventering applikationer.
Det er vigtigt at bemærke, at der er nogle begrænsninger for den beskrevne fremgangsmåde. Først, brug af integrerede mikrofluid kredsløb (IFC) plader kræver specialiseret, dyrt udstyr. Men mikrofluide chips tilbyde betydelige fordele i forhold til traditionelle 96 godt og 384 samt plade formater til analyse enkelte celler. Ved strømmende celler og reagenser gennem mikrometer skala baner, er enkelte celler placeret i enkelte indfangningsstedet hvor de direkte kan observeres for at bekræfte, at de er enkelte celler i et godt helbred. RNA-ekstraktion og cDNA-syntese forekommer in situ på IFC chip bruger meget små mængder for hver celle. Integrerede fluide chips på det tidspunkt dette skrives, er kommercielt tilgængelige gennem kun én kilde. Selvom ikke-kommerciel fabrikation er blevet udført af adskillige grupper, det er uden for kapaciteten af de fleste laboratorier. Trin 5-7 kanskal ændres for platforme produceret af andre virksomheder eller in-house påfund. For det andet, selv om kommercielt tilgængelige IFC-plader kan rumme op til 96 gener, de udvalgte gener er begrænset af tilgængeligheden af fluorogene-mærkede genprober valideret til brug i zebrafisk. Tredje, zebrafisk celler er typisk mindre end pattedyrceller, og denne lille størrelse giver udfordringer til at prøve behandling. En lille ændring i cellediameter udslag i en stor ændring i cellevolumen, reducere tilgængeligt materiale og mindske sandsynligheden for at detektere lav ekspression af gener.
Der er flere andre overvejelser for denne protokol. I trin 1, er det vigtigt kun at bruge embryoner befrugtede inden for en kort tidsvindue. Holde temperaturen konstant og uden at begrænse iltforhold, udvikler zebrafisk embryoner synkront. Det ultimative udlæsning af denne protokol (relativ genekspression fra enkelte celler) kan ikke diskriminere kilden til heterogeneity mellem individuelle celler. Af denne grund, fortolkning af intercellulære heterogenitet afhængig omhyggeligt iscenesatte embryoner og synkron udvikling. I trin 2-3, der er en afvejning mellem dissociation og levedygtighed. Selvom trin 4 selekterer for levedygtige celler, og trin 3 indeholder flere filtrering trin, der hjælper udelukke multimerer, over-fordøjelse vil reducere levedygtigt materiale til rådighed for FACS og potentielt reducere sorterede celleudbytte. Trin til fejlfinding lav levedygtighed omfatte reducere fordøjelse tid, reducere findeling intensitet og optimere antallet af embryoner i udgangsmaterialet. FACS berigelse af cellepopulationen af interesse (trin 4) er nok den mest kritiske skridt i denne protokol. Stringente sorteringskriterier er afgørende for at generere et enkelt præparat celle indeholdende kun levende celler, der udtrykker det fluorescerende protein af interesse. Kontaminerende celler fra andre populationer kan føre til falsk repræsentation af intercellulære heterogenitet. isærFACS berigelse af en population af interesse er ikke begrænset til de to farver strategi vist i denne protokol. Mere komplekse strategier kan producere mere raffinerede cellepopulationer og er en hurtig måde at udvide den metode rapporteret i proof of principle undersøgelse. I trin 5 kan celler observeres direkte at bekræfte antallet af celler tilfangetagne, cell sundhed og ekspression af fluorescens protein. Men afhængigt af cellestørrelse og lysstyrke, fluoroforen af interesse kan ikke være synlige og er ikke en pålidelig udlæsning. En vellykket gennemførelse af trin 6-8 kræver omhyggelig overholdelse af producentens protokoller.
Som bevis på princippet blev ekspressionsniveauer af en delmængde af kendte hjertemarkører vurderet i enkelt afledt af en tidligere beskrevet BAC transgene zebrafisk linje Nkx2.5: ZSY at undersøge hjertedifferentiering markører i individuelle Nkx2.5: ZSY positive celler ved 18 timer efter fertilisering (HPF). At udforske heterogeneity af differentiering markører udtrykt i erobrede Nkx2.5: ZSY udtrykkende celler, en suite af gener blev analyseret, herunder husholdning gener (ef1a, GAPDH), transkriptionsfaktorer kendt for at være tændt tidligt i hjertets specifikation (gata4, Nkx2.5), en andet hjerte felt stamfader markør (isl1), og generne er kendt for at være tændt senere under hjerte-differentiering (myl7, vmhc). Den relative forekomst af hvert gen blev målt ved QRT-PCR ved at beregne tærskelcyklus (CT). Den laveste CT beregnet var 17,9 og den højeste var 40, hvilket repræsenterer ingen amplifikation (tabel 1). Ct-værdier på> 35,0 blev behandlet nedenfor detektion.
Af de 46 celler i datasættet blev 6 udelukket på grund fejler amplifikation af eventuelle gener. De resterende celler blev underopdelt celler i 5 typer baseret på udtryk for gata4, Nkx2.5, myl7, og vmhc og were ordnet efter ef1a værdi inden for grupper. Selvom GAPDH oprindeligt var medtaget som en mulig husholdning gen, udtryk var meget variable på tværs af celler, hvilket gør det uegnet som husholdning gen. GAPDH udtryk sandsynligvis bedre repræsenterer ændringer i energi metabolisme er forbundet med hjerte-differentiering i denne celletype. Interessant nok var en celle, i hvilken ef1a var un-detekterbar, men et andet gen var detekterbar (gata1 i celler 26). Dette antyder, at mens ef1a er generelt en tilstrækkelig housekeeping-gen til at skelne mellem vellykkede og mislykkede enkelt celle revers transkription-reaktioner, kan det ikke være ideel for alle applikationer. Manglen på ef1a ekspression i cellen 26 kan skyldes enkelt celle transkriptionelle dynamik. De seneste single-celler undersøgelser viser, at gentranskription er fundamentalt stokastisk, vekslende mellem faser af hurtige og ubetydelig transkriptionel aktivitet 26. Thans transkriptionel sprængning model antyder, at anvendelse af en husholdning gen for kvantitative sammenligninger mellem enkelte celler kan være helt upassende.
I type 1-gruppen, ef1a er den eneste gen påvises. Disse celle kan omfatte enten Nkx2.5: ZSY negative celler eller celler med meget lav ekspression af de andre gener af interesse. Type 2-celler, med undtagelse af Cell-26, udtrykt både ef1a og gata4 med ingen sammenhæng i de relative ekspressionsniveauer af disse gener. Især kan Nkx2.5 udtryk i type 1 og type 2 celler skyldes suboptimal FACS stringens, transkriptionel sprængning, transgen utætheder, eller sub-tærskel ekspressionsniveauerne. Type 3 celler udtrykte detekterbare niveauer af ef1a, gata4, og NKX-2.5. Disse celler er sandsynlige kardial progenitorceller og kan omfatte differentiere atrielle cardiomyocytter. Type 4 celler udtrykte detekterbare niveauer af ef1a, gata4, Nkx2.5, myl7 </ em> og vmhc og er sandsynlige celler differentierer i ventrikulære cardiomyocytter. Type 5 celler udtrykte ef1a, gata4, Nkx2.5, myl7, vmhc, og GAPDH. Tilsætningen af påviselige niveauer af GAPDH antyder, at disse celler har kapacitet til forøget glykolytisk metabolisme fundet i differentierede cardiomyocytter. Det var spændende at trods sortering for ZsYellow positive celler fra Tg. (Nkx2.5: ZsYellow), embryoner, 21/40 celler var sub-tærskelværdier for Nkx2.5 i vores QRT-PCR-analyse Dette kunne skyldes transskriptionel sprængning eller kan afspejle forskelle i udskrift behandling mellem endogen Nkx2.5 og ZsYellow. Vigtigt er det, den anden hjerte feltmarkør isl1 var målbart i eventuelle celler eller cDNA samlet fra alle vores indfangningsstedet. I summen, sammenligner på tværs prøver, væsentlig heterogenitet var tydelig på enkelt celle niveau, hvilket tyder på, at ved 18 HPF, Nkx2.5: ZSY + cells omfatter cardiac progenitorer samt afkom på forskellige stadier af differentiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | For removing the chorion from embryos |
| Microcentrifuge tube 2 ml | GeneMate | C-3261-1 | |
| 40 um cell strainer | Biobasic | SP104151 | |
| 35 mm culture dish | Falcon | 351008 | |
| FACS tubes topped with 35 um cell strainer | Falcon | 352235 | |
| P1000 and tips | Rainin | 17005089 | |
| P20 and tips | Rainin | 17005091 | |
| IFC chip manufacturer's protocol | Fluidigm | 100-6117 | Version 100-6117 E1 was used in representative experiment |
| Wide bore pastuer glass pippette | VWR | 14673-010 | For transferring embryos |
| Adult wild type zebrafish | N/A | We used AB line | |
| Adult transgenic zebrafish | N/A | We used Tg(nkx2.5:ZsYellow) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for cell dissociation | |||
| Double distilled water | N/A | ||
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| NaCl | FisherScientific | S271-3 | make stock in water and use for de-yolking buffer |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405 | make stock in water and use for de-yolking buffer |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6014 | make stock in water and use for de-yolking buffer |
| Leibovitz's L-15 | Gibco | 21083-027 | |
| FBS | FisherScientific | 03-600-511 | Heat inactivate; any brand of FBS should be fine |
| Cell Dissociation Reagent 1 -TrypLE | Life Technologies | 12605-010 | Store at room temperature. |
| Cell Dissociation Reagent 2 - FACSmax | Genlantis | T200100 | Store -20; thaw on ice; bring to room temp before use |
| pronase (optional) | Sigma | P5147 | |
| L/D Dye - Sytox Blue | Life Technologies | S34857 | Any live/dead stain suitable for flow cytometry will work |
| Trypan Blue | Gibco | 15250-061 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for IFC plate use and qRT-PCR | |||
| Gene-specific probes | Probes will vary by experiment | ||
| TaqMan Probe ef1a | Life Technologies | Dr03432748_m1 | |
| TaqMan Probe gata4 | Life Technologies | Dr03443262_g1 | |
| TaqMan Probe nk2-5 | Life Technologies | Dr03074126_m1 | |
| TaqMan Probe myl7 | Life Technologies | Dr03105700_m1 | |
| TaqMan Probe vmhc | Life Technologies | Dr03431136_m1 | |
| TaqMan Probe isl1 | Life Technologies | Dr03425734_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Life Technologies | 4369016 | |
| Reagents listed in IFC manufacturer's protocol | |||
| C1 Reagent Kit | Fluidigm | 100-5319 | Reagents for loading cells onto IFC plate |
| Ambion Single Cell-to-CTTM | Life Technologies | 4458237 | Reagents for reverse transcription and pre-amplification steps |
| Molecular Biology Quality Water | Corning | 46-000CM | |
| C1 IFC for PreAmp (5-10 um) | Fluidigm | 100-5757 | IFC plate for small cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| C1 AutoPrep machine | Fluidigm | 100-5477 | For IFC plate use |
| Hemocytometer | Sigma Aldrich | Z359629 | For counting cells and assessing cell size |
| Dissecting microscope | For removing embryos from chorion | ||
| Tissue culture microscope | For assessing single cell digestion | ||
| FACS machine | For isolating cells of interest |
References
- Speicher, M. R. Single-cell analysis: toward the clinic. Genome medicine. 5, (2013).
- Macaulay, I. C., Voet, T. Single cell genomics: advances and future perspectives. PLoS genetics. 10, e1004126 (2014).
- Marco, E., et al. Bifurcation analysis of single-cell gene expression data reveals epigenetic landscape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 5643-5650 (2014).
- Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Current opinion in biotechnology. 23, 110-119 (2012).
- Garlanda, C., Dejana, E. Heterogeneity of endothelial cells. Specific markers. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 17, 1193-1202 (1997).
- Diaz-Cano, S. J. Tumor heterogeneity: mechanisms and bases for a reliable application of molecular marker design. International journal of molecular sciences. 13, 1951-2011 (2012).
- Guo, G., et al. Mapping cellular hierarchy by single-cell analysis of the cell surface repertoire. Cell stem cell. 13, 492-505 (2013).
- Guo, G., et al. Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst. Developmental cell. 18, 675-685 (2010).
- Treutlein, B., et al. Reconstructing lineage hierarchies of the distal lung epithelium using single-cell RNA-seq. Nature. 509, 371-375 (2014).
- Kimmel, C. B. Genetics and early development of zebrafish. Trends in genetics : TIG. 5, 283-288 (1989).
- Liu, J., Stainier, D. Y. Zebrafish in the study of early cardiac development. Circulation research. 110, 870-874 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 203, 253-310 (1995).
- Zhao, S., Fung-Leung, W. P., Bittner, A., Ngo, K., Liu, X. Comparison of RNA-Seq and microarray in transcriptome profiling of activated T cells. PloS one. 9, e78644 (2014).
- McCall, M. N., McMurray, H. R., Land, H., Almudevar, A. On non-detects in qPCR data. Bioinformatics. 30, 2310-2316 (2014).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature. 3, 1101-1108 (2008).
- Lyons, I., et al. Myogenic and morphogenetic defects in the heart tubes of murine embryos lacking the homeo box gene Nkx2-5. Genes & development. 9, 1654-1666 (1995).
- Chen, J. N., Fishman, M. C. Zebrafish tinman homolog demarcates the heart field and initiates myocardial differentiation. Development. 122, 3809-3816 (1996).
- Zhou, Y., et al. Latent TGF-beta binding protein 3 identifies a second heart field in zebrafish. Nature. 474, 645-648 (2011).
- Paffett-Lugassy, N., et al. Heart field origin of great vessel precursors relies on nkx2.5-mediated vasculogenesis. Nature cell biology. 15, 1362-1369 (2013).
- McCurley, A. T., Callard, G. V. Characterization of housekeeping genes in zebrafish: male-female differences and effects of tissue type, developmental stage and chemical treatment. BMC molecular biology. 9, 102 (2008).
- Tang, R., Dodd, A., Lai, D., McNabb, W. C., Love, D. R. Validation of zebrafish (Danio rerio) reference genes for quantitative real-time RT-PCR normalization. Acta biochimica et biophysica Sinica. 39, 384-390 (2007).
- Serbedzija, G. N., Chen, J. N., Fishman, M. C. Regulation in the heart field of zebrafish. Development. 125, 1095-1101 (1998).
- de Pater, E., et al. Distinct phases of cardiomyocyte differentiation regulate growth of the zebrafish heart. Development. 136, 1633-1641 (2009).
- Hami, D., Grimes, A. C., Tsai, H. J., Kirby, M. L. Zebrafish cardiac development requires a conserved secondary heart field. Development. 138, 2389-2398 (2011).
- Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. Y. Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish. Developmental biology. 214, 23-37 (1999).
- Molina, N., et al. Stimulus-induced modulation of transcriptional bursting in a single mammalian gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 20563-20568 (2013).
