Isolamento e caratterizzazione di singole cellule da embrioni di zebrafish

Leigh Ann Samsa; Nicole Fleming; Scott Magness; Li Qian; Jiandong Liu

doi:10.3791/53877

È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Isolamento e caratterizzazione di singole cellule da embrioni di zebrafish

14.6K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/53877

⸱

12 marzo 2016

Leigh Ann Samsa¹^,² , Nicole Fleming²^,³ , Scott Magness¹ , Li Qian²^,³ , Jiandong Liu²^,³

¹Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, ²McAllister Heart Institute, University of North Carolina at Chapel Hill, ³Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo per isolare singole cellule da embrioni di zebrafish, arricchimento per cellule di interesse, catturare cellule di zebrafish in sistemi multiplex a singola cellula basati su microfluidica e valutare l'espressione genica da singole cellule.

Abstract

Il pesce zebra (Danio rerio) è un potente organismo modello per studiare lo sviluppo dei vertebrati. Sebbene molti aspetti dello sviluppo embrionale del pesce zebra siano stati descritti a livello morfologico, poco si sa sulle basi molecolari dei cambiamenti cellulari che si verificano durante lo sviluppo dell'organismo. Con i recenti progressi nella microfluidica e nelle tecnologie di multiplexing, è ora possibile caratterizzare l'espressione genica in singole cellule. Ciò consente di studiare l'eterogeneità tra le singole cellule di specifiche popolazioni cellulari per identificare e classificare i sottotipi cellulari, caratterizzare gli stati intermedi che si verificano durante la differenziazione cellulare ed esplorare le risposte cellulari differenziali agli stimoli. Questo studio descrive un protocollo per isolare singole cellule vitali da embrioni di zebrafish per saggi di multiplexing ad alto rendimento. Questo metodo può essere rapidamente applicato a qualsiasi tipo di cellula embrionale di zebrafish con marcatori fluorescenti. Un'estensione di questo metodo può essere utilizzata anche in combinazione con tecnologie di sequenziamento ad alto rendimento per caratterizzare completamente il trascrittoma di singole cellule. A riprova del principio, l'abbondanza relativa dei marcatori di differenziazione cardiaca è stata valutata in singole cellule isolate derivate da progenitori cardiaci positivi per nkx2.5. Attraverso la valutazione dell'espressione genica a livello di singola cellula e in un singolo punto temporale, i dati supportano un modello in cui i progenitori cardiaci coesistono con la progenie differenziante. Il metodo e il flusso di lavoro qui descritti sono ampiamente applicabili alla comunità di ricerca del pesce zebra, richiedendo solo una linea di pesce transgenica etichettata e l'accesso alle tecnologie microfluidiche.

Introduzione

La maggior parte degli studi in corso di biologia cellulare e molecolare si basano sulle medie della popolazione. Tuttavia, importanti eventi biologici possono essere mascherati da queste analisi tradizionali basati sulla popolazione dal momento che le popolazioni minori possono giocare un ruolo importante nei processi biologici e l'esito della malattia. Comprendere l'espressione genica in popolazioni eterogenee a livello di singola cellula può (e deve) portare a dati biologici e clinici rilevanti ^1,2. Di interesse per gli studi di sviluppo embrionale, in un numero maggiore di cellule, le cellule progenitrici sono spesso sottorappresentati, il che ....