Introduction
De fleste aktuelle studier av celle- og molekylærbiologi er basert på befolkningsgjennomsnitt. Imidlertid kan viktige biologiske hendelser bli maskert av disse tradisjonelle populasjonsbaserte analyser da små bestander kan spille en stor rolle i biologiske prosesser og sykdom utfallet. Forstå genuttrykk i heterogene populasjoner på celle-nivå kan (og har) føre til relevante biologiske og kliniske innsikter 1,2. Av interesse for embryonale utviklingsstudier, i en større populasjon av celler, stamceller er ofte underrepresentert, noe som gjør det vanskelig å oppdage subtile endringer i genuttrykk som til slutt setter i gang celle skjebne beslutninger 3. Likeledes kan en enkelt celletype har forskjellige ekspresjons-profiler som respons på mikromiljøet 4. For eksempel, bosatt endotelceller i samme organ eller i forskjellige organer (f.eks., Aorta eller nyre) utviser betydelig heterogenitet tross dele felles morphological og funksjonelle egenskaper 5. I tillegg kan kreftcellene fyller samme svulst også ha varierende molekylære profiler eller mutasjoner på celle-nivå 6.
I modellsystemer, har transcriptomics i enkeltceller hell identifisert nye cellepopulasjoner, karakterisert mellomliggende tilstander som oppstår under celledifferensiering, og avslørte differensial cellulære responser på stimuli 7,8,9. Slike innsikter ville ha vært maskert i konvensjonelle befolkningsbaserte studier. Sebrafisk embryo er et enormt lite benyttet kilde til stammen, stamfar, og differensierende celler for å utforske spørsmål om enkelt celle heterogenitet og molekylær regulering av cellulære identiteter under utvikling. Deres svært stereotype, ex vivo utvikling og enkel genetisk manipulering gjør dem til et utmerket modellsystem for denne tilnærmingen 10,11. Spesielt en stor begrensning for tolkning av enkeltcelle gene uttrykk data er at pålitelig identifisering av nye mellomcelle tilstander under utvikling krever svært forsiktig timing av vev samling ni. Dette er nødvendig for å sikre at heterogenitet mellom fangede celler representerer heterogenitet innenfor et vev ved et enkelt tidspunkt i stedet for heterogenitet i genekspresjon presentert av aldersavhengig celledifferensiering. Sammenlignet med mus, kan sebrafisk embryo utvikling være nøyaktig synkronisert på tvers av et stort antall embryoer 12. I tillegg, med ekstra clutch størrelser, sebrafisk embryoer kan brukes som en rik kilde til stamceller og forløperceller.
Denne protokollen beskriver en metode for å isolere celler fra sebrafisk embryo og fange enkeltceller ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig integrert MicroFluidics krets (IFC) chip og autoprep system for QRT-PCR analyse av genuttrykk. Denne protokollen kan raskt overføres til noen høy gjennomstrømming multiplexing analyser inkludert heletranskriptomet sekvensering som tillater mer omfattende analyse av mobilnettet heterogenitet 13. Det gir også flere fordeler til tradisjonelle genuttrykk analyser. Den enkeltcelleisolasjon protokoll gir høy levedyktighet etter FACS, noe som reduserer andelen av kompromitterte celler som inngår i nedstrømsapplikasjoner. Ved å bruke en IFC, kan fanges opp celler observeres direkte å vurdere fangst priser og vurdere celle helse morfologisk. I tillegg er denne protokollen bredt anvendelig på sebrafisk forskersamfunnet, krever bare en merket transgen fisk linje og tilgang til microfluidic celle fangstteknologier.
Som bevis på prinsippet ble enkeltceller avledet fra hjerte progenitorer isolert og tatt opp på en IFC-brikke, og da den relative overflod av hjertedifferensieringsmarkører ble målt ved QRT-PCR. Genekspresjonsanalyser på celle-nivå viser at hjerte forfedre eksistere sammen med sin differentiating avkom. Den innsikt fra encellede profilering av hjertestamfedre kan kaste lys over heterogenitet i genuttrykksmønster blant hjerte stamceller i løpet av virveldyr utvikling, som kan ha vært maskert i tradisjonelle befolkningsbaserte analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen krever bruk av levende, voksen sebrafisk for å produsere embryoer. Embryoene høstes for vev samling. Det er viktig å få godkjenning fra relevante etiske gjennomgang styrene for å gjennomføre dette eksperimentet.
1. Få Etappevise Embryoet
- Dagen før forsøket, forberede sunn, voksen sebrafisk for avl. Plasser en mann og en kvinne på hver sin side av en klar skillelinje i en avl tank.
- Gjenta 1.1 for så mange avl tanks som er nødvendig for tilstrekkelig embryo produksjon for nedstrøms søknaden. Skaff embryoer fra både villtype fisk og transgen fisk som uttrykker fluorescerende proteiner i cellen type interesse.
MERK: Antall embryoer som trengs for nedstrøms applikasjoner i trinnene 2-8, avhenger av den relative overflod av cellene av interesse på tidspunktet av interesse. Selv om dette kan variere etter celletype, 200 embryoer produsere 2,000-5,000 sorterte celler når calen av interesse representerer <1,0% av de totale cellene ved 24 HPF (timer etter befruktning). - Neste morgen, endre vannet i panering tanken ved å overføre fisk til en frisk avl tank og fjerne skillet. Tipp beholderen i en vinkel for å oppmuntre avl.
- Samle iscenesatt embryoer.
- Hvert 15 min, samle embryoer ved å overføre de voksne til en frisk avl tank og passerer eggene som er igjen gjennom en te sil.
MERK: sebrafisk embryoer utvikler synkront når opprettholdes på sammenlignbare tettheter og temperaturer. - Skyll eggene med Egg Vann (0,21 g / L Instant Ocean salter i en L dobbelt destillert vann) og overføre til en petriskål. Overfør petriskål til en fuktig inkubator ved 28,5 ° C med luftsirkulasjon.
- Hvert 15 min, samle embryoer ved å overføre de voksne til en frisk avl tank og passerer eggene som er igjen gjennom en te sil.
- To timer etter siste samling, sortere befruktet, flercellede embryoer til 10 cm petriskåler og redusere tettheten til 50 embryoer per parabolen. Velg embryoer fra en enkelt, 15min tidsvindu på samling for nedstrøms søknaden. Inkuber embryoer ved 28,5 ° C.
MERK: For eksempel, samle embryo på 8:30, 8:45, 9:00, 9:15, 9:30, 9:45, 10:00 og 10:15. Sammenligning på tvers av tids poeng, hvis det største antallet befruktede embryoer er fra klørne samlet på 09:00, og deretter bruke bare disse embryoer for nedstrømsapplikasjoner.
2. Sett opp for Single Cell Dissosiasjon
- Ca 30 min før tiden interessepunkt (18 HPF) fjerne embryoer fra deres chorion manuelt med fin pinsett.
- Samle og merke følgende for hver tilstand: to 2 ml mikrosentrifugerør, en 40 mikrometer celle sil, en 35 mm cellekultur parabolen, og to FACS rør toppet med en 35 mikrometer celle sil.
- Chill følgende reagenser på is: Egg Vann inneholder 0,21 g / L Instant Ocean salter i 1L dobbelt destillert vann; De-yolking buffer inneholdende 55 mM NaCl, 1,8 mM KCl, og 1,25 mM NaHCO3; og FACS buffer inneholdende Leibovitz L-15 media supplert med 5% varmeinaktivert føtalt bovint serum.
- Bringe 1 ml per prøve av celledissosiasjon Reagens 1 til RT. Tine 1 ml celledissosiasjon Reagens 2 per prøve på is. Bringe opp til romtemperatur umiddelbart før bruk.
3. Enkelt celledissosiasjon
- Ved hjelp av en bred utboring glass pipette, overføres 100-300 embryo til en 2 ml mikro- sentrifugerør i et minimalt volum Egg vann.
- Avlive embryoer ved å erstatte vann med 1 ml iskald Egg Vann og senke rør i is i 20 min.
FORSIKTIG! Det er viktig å få godkjenning fra riktig institusjonelle dyr omsorg forglemmelse komité for aktiv dødshjelp metoden (chilling på isen etterfulgt av celledissosiasjon som sekundær aktiv dødshjelp). Standard dødshjelp krever vanligvis at embryoer <3 dager etter befruktning er bleket etter at de er kjølt, som ikke er egnet for å få levedyktige celler. - Vask embryoene to ganger med 1 ml iskald Egg Water. Å vaske, bruke et bredt boring glass pipette for å fjerne Egg Vann og en P1000 for å legge egg Water.
- Ta av eggeplomme ved å erstatte embryo vann med 1 ml Deyolking Buffer og triturating 8-12 ganger med en P1000 tips, eller til eggeplomme er oppløst og bare likene av embryoer er synlige.
- Samle vevet ved sentrifugering ved 300 x g i 1 min. Bruk en pipette til å forsiktig fjerne supernatanten uten å forstyrre vev pellet. Re-suspendere i en ml Egg Water.
- Gjenta trinn 3.5 for totalt tre vaskinger, men på den siste vask, re-suspendere i 1 ml RT celledissosiasjon Reagens 1.
- Inkuber i celledissosiasjon Reagens 1 i 10 minutter ved RT med rør plassert horisontalt. Hver 2-3 min, forsiktig triturer med en P1000 pipette for å unngå klumper.
MERK: Handle prøver forsiktig under Triturerings trinn. En gang en enkelt, stor klump vil danne i røret fra en floke av embryo organer. Dette vilspre med ekstra fordøyelse hjulpet ved forsiktig gniing. IKKE VORTEX. - Samle vev ved sentrifugering ved 300 x g i 3 min. Fjern supernatanten og resuspender i 1 ml celledissosiasjon Reagens 2.
- Inkuberes i 5-15 minutter ved romtemperatur. Plasser rørene horisontalt. Hver 2-3 min, triturer forsiktig for å unngå klumper. Hvert 5 min, vurdere fordøyelsen fremgang.
- For å vurdere fordøyelsen fremgang, fortynne 2 ul supernatant til 18 mL FACS buffer og pipette som en dråpe på en cellekultur parabolen.
- Plasser et dekkglass over prøven og observere under et vev kultur mikroskop med 10x og 20x forstørrelse.
MERK: Preparatet skal fremstå som en blanding av enkeltceller, små klynger, store klynger, og sporadiske stort sett intakt embryo kroppen. - Visuelt bedømme andelen av blandingen som er enkle celler og små klaser.
MERK: Over-fordøyelsen vil redusere levedyktighet; under-fordøyelse vil redusere enkelt celle yield. </ Li>
- Samle cellepreparatet ved sentrifugering ved 300 xg i 5 minutter. Kast supernatanten og re-suspendere i 1 ml kald FACS buffer.
- Fukt en 40 mikrometer celle sil med FACS buffer. Passere cellesuspensjonen via 40 mikrometer celle sil på et 35 mm cellekulturskål. Vask cellefilter en gang med 1 ml FACS sortering buffer.
- Overfør gjennomstrømnings til et 2 ml mikrosentrifugerør. Samle celler ved sentrifugering ved 300 xg i 5 minutter og re-suspen i 100 ul FACS-buffer.
- Telle celle avkastning ved hjelp av en hemocytometer. Videre fortynne prøvene til 5x10 6 celler per ml, eller optimal konsentrasjon anbefalt for FACS maskin av valget. Optional-Når opptellingen celle yield på hemocytometer, counterstain døde celler med trypanblått å bekrefte levedyktighet av cellen forberedelse før FACS sortering.
MERK: Forberedelser som er for tynn vil ta overskytende beløp av tid til å sortere. Preparater som er for concentrated en tendens til å klumpe seg inn multimerer og er suboptimal for sortering en ren populasjon. - Reserve 10-20% av hver prøve til bruk som ufargede kontroller. For de resterende prøvene, beis døde celler ved å legge til et fluorescerende live / dead (L / D) diskriminering fargestoff i hver prøve. IKKE vask.
MERK: Enhver fluorescerende fargestoff som trenger inn i cellene med kompromitterte cellemembraner og flekker nukleinsyrer kan anvendes som L / D-fargestoff, forutsatt at fluorescens-spektrene er forenlige med FACS maskin av valg og fluorofor merking av celler av interesse.- Ikke vask preparatet etter tilsetning av fargestoff som noen celler vil dø i transitt til FACS rensing og bør utelukkes fra den sorterte befolkningen.
- Fukt 35 mikrometer celle sil avkortet FACS tube med 20 ul FACS buffer. Legg celler til silen og samle av tyngdekraften. Oppbevar på is.
4. FACS Enrichment
- Bruk FACS å berike for enkelt, Levende celler som uttrykker det fluorescerende markør.
- Sett en gate å skille celler fra rusk på et spredningsplott av fremover scatter (FSC-A) amplitude vs side scatter amplitude (SSC-A), begge med lineær skalering.
Forsiktig! Sebrafisk cellene er vanligvis mindre enn mus eller humane celler. Dette gjenspeiles i en lavere basal skille mellom celler og rusk. - Fra porten satt i 4.1.1, satt en gate for å berike for enkeltceller og inkluderer multimerer ved hjelp av et punktplott av fremover scatter høyde (FSC-H) og lav side scatter høyde (SSC-H), begge med lineær skalering.
MERK: Celler med uforholdsmessig høy FSC-H og lav SSC-H er sannsynlige multimerer og blir utelatt fra sortering. - Fra porten sett i 4.1.2, ved hjelp av enkle fargekontroller, satt en gate for å inkludere bare levende celler ved hjelp av et punktplott av FSA-A med lineær skalering og amplitude av kanalen brukes til å oppdage L / D flekken med log skalering. Inkluder L / D-negative celler.
- Fraporten satt i 4.1.3, ved hjelp av enkle fargekontroller, satt en gate til å omfatte bare levende celler med positiv fluorescens ved hjelp av et punktplott av FSA-A med lineær skalering og amplitude av kanalen brukes til å oppdage fluorescerende protein cellemarkør med log skalering . Inkluder positive celler.
- Angi noen kompensasjon kontroller, hvis det er nødvendig, å ta hensyn til interferens mellom L / D-flekk og fluorescerende protein spektra.
- Sett en gate å skille celler fra rusk på et spredningsplott av fremover scatter (FSC-A) amplitude vs side scatter amplitude (SSC-A), begge med lineær skalering.
- Set slags logikk til celler som faller inn i alle portene satt i trinn 4.1.
- Ved hjelp av dobbelt merkede celler, bekrefter gating for cellesortering.
MERK: Celler for sortering blir cellene i stedet for rusk, enkeltceller i stedet for multimere, L / D-negative og fluorescens positive celler.
- Ved hjelp av dobbelt merkede celler, bekrefter gating for cellesortering.
- Sorter 2000-4000 celler fra populasjonen i 5 ul kald FACS buffer i en mikro tube på is. For å minimere klipping og belastning på celler under sortering, bruker de laveste presset mulig for cellensorter.
MERK: 5 ul dråpe med FACS-buffer tjener som en pute for celler som kommer ut fra FACS maskinen. Samle 2000-4000 celler direkte inn FACS buffer eliminerer behovet for sentrifugering før lasting på IFC chips. Denne strategien er anbefalt fordi sentrifugering kan føre til dannelse av multimerer hvis celler holder seg til hverandre i pelleten. - Vurdere etter slags levedyktighet analyse.
- Overføring av 1 mL celler sortert til en frisk FACS rør med 100 ul FACS sortering buffer og 1: 1000 fortynning av L / D-flekk. Pass cellene gjennom FACS sorter med gating strategien i trinn 4.1. Bruk andelen av L / D negativ til positivt å estimere levedyktighet av sorterte celler.
5. veieceller bort på Microfluidics Chip
- Ved hjelp av et hemocytometer, måle både konsentrasjonen og størrelsen av sorterte cellene.
- Spe sorterte celler til minst 10 mL. Fortynn en aliquot av 5 μ; L celler med 5 mL trypanblått. Laste inn hemocytometer og bruke dekkglass.
- Samle lyse felt bilder av alle cellene i 4 x 4 rutenett av hemocytometer. Telle antall levende celler og beregne levende celler / ml. Levende celler ikke ta opp trypanblått.
MERK: Bruk en standard bildeanalyse programvare for å måle diameteren på alle levende celler. Beregn gjennomsnitt og standardavvik til cellestørrelsen, og velge en IFC plate som er egnet for cellestørrelsesområdet av interesse. Hvis celle størrelsesområdet strekker en IFC plate celle størrelse rekkevidde, bruker flere plater for å fange hele spekteret av celler av interesse.
- Veieceller på å IFC plate i henhold til produsentens instruksjoner (se Materials).
- Fortynn celler til 1x10 6 celler / ml og utføre oppdrift optimalisering i henhold til produsentens anvisninger.
MERK: Oppdrift optimalisering sørger for at cellene verken synke til bunns eller flyte til toppen av laste well for optimal lasting på IFC chip. Forholdet mellom buffer til celler, kan variere innen celletype, men er typisk i området 6: 4-7: 3 av celler: buffer. - Legg celler til primet-IFC plate. Load plate inn kompatibel lufthåndtering maskin, og kjøre en celle lasting skript for å presse cellene gjennom MicroFluidics krets og inn i fangstfelt.
- Fortynn celler til 1x10 6 celler / ml og utføre oppdrift optimalisering i henhold til produsentens anvisninger.
- Bekreft at cellene blir innlosjert i fangst sider på IFC plate.
- Fjern IFC plate fra lufthåndtering maskin. Monter IFC plate på et mikroskop utstyrt med en plate adapter.
- Samle bilder av lyse felt og fluorescens for hver opptaks nettsted på 10X forstørrelse.
MERK: Lysfelt fangsttider kan variere fra 10-50 ms, avhengig av lampe intensitet. Fluorescens digitaliseringsTidene kan variere fra 250-750 ms, avhengig av fluoroforen lysstyrke. Unngå overeksponering celler for å hindre photodamage.
6. cDNA Synthesis
- Utføre cellelysering in situ i henhold til jegFC plate produsentens anvisninger.
- Legg lysis buffere til brønner på IFC plate. Load plate på kompatible lufthåndtering maskin og kjøre cellelyse script som per produsentens instruksjoner.
- Utfør revers transkripsjon henhold til IFC plate produsentens instruksjoner.
- Legg revers transkripsjon reagenser til IFC plate. Load plate på kompatible lufthåndtering maskin. Kjør revers transkripsjon script. Sample sykkel betingelser: en syklus ved 25 ° C i 10 minutter, en syklus ved 42 ° C i 1 time, deretter en syklus ved 85 ° C i 5 minutter.
- Utfør pre-forsterkning med gen-spesifikke prober i henhold til IFC plate produsentens instruksjoner.
MERK: På grunn av deres større spesifisitet med lav kopiantall, bruke fluorogene-merkede prober i stedet for sonder som er optimalisert for bruk med intercalator fargestoffer.- Pool primere og fortynne til finalen 180 nM hver. Legg sammenslåtte primere til IFC plate. Load plate på kompatible fluidics maskin. Kjør preamplification script.
- Utføre pre-amplifikasjon med de følgende syklusbetingelser: 1 syklus ved 95 ° C i 10 min, deretter 18 sykluser med denaturering ved 95 ° C i 15 sek og deretter gløding og forlengelse ved 60 ° C i 4 min. Oppbevares pre-forsterket cDNA ved 4 ° C før høsting. Harvest-cDNA fra mikrofluid plate i henhold til produsentens instruksjoner og oppbevares ved -20 ° C inntil bruk.
7. Velg cDNA fra enkeltceller for enkelt mål QRT-PCR
- Fortynnet cDNA i 25 ul fortynning reagens i henhold til produsentens instruksjoner.
MERK: Omtrentlig endelige utbyttet er 28 mL av pre-forsterket cDNA per celle. Reservere en delmengde av fortynningsmiddel for anvendelse som en ikke-templat kontroll i QRT-PCR.- Med henvisning til lyse felt og fluoriserende bilder tatt opp i trinn 5.3.2, scorer hver fangst nettsted. Manuelt telle og registrere antall celler. Vurdere og registrere om hver celle er influensaorescent.
MERK: Hver enkelt side kan inneholde 0, 1, eller> en celle, hvor> en celle inkluderer fangst nettsteder som inneholder flere celler og / eller uidentifiserbare rusk. Hvis bildene er tilstrekkelig kvalitet, kan en pikselverdi også bli tildelt til kvantifisere intensiteten av fluorescenssignalet.
- Med henvisning til lyse felt og fluoriserende bilder tatt opp i trinn 5.3.2, scorer hver fangst nettsted. Manuelt telle og registrere antall celler. Vurdere og registrere om hver celle er influensaorescent.
- Velg prøver for QRT-PCR analyse.
- Velg cDNA prøvene fra fangst områder som er identifisert i trinn 7.2 som inneholder eksakte en celle med positiv fluorescens. Pool 1 ul alikvoter av cDNA fra hver prøve.
MERK: Dette er den "Pool" positiv kontroll anvendes for å bestemme hvorvidt gener av interesse er uttrykt i en hvilken som helst av de valgte cellene. - Velg cDNA fra minst en fangst nettsted som inneholder nøyaktig 0 celler som en negativ kontroll. Bruk fortynningsmiddel fra trinn 7.1.2 som en no-mal kontroll.
- Velg cDNA prøvene fra fangst områder som er identifisert i trinn 7.2 som inneholder eksakte en celle med positiv fluorescens. Pool 1 ul alikvoter av cDNA fra hver prøve.
- Kjør QRT-PCR-analyse.
- Bruk bare sonder som brukes for pre-forsterkning i trinn 6.4.1. Last alle prøvene i triplicate. Sykling betingelser for en 10 pl reaksjon på en 384 brønners plate: en syklus 50 ° C 2 min, en syklus 95 ° C i 10 minutter, 40 sykluser med denaturering ved 95 ° C i 15 sekunder og deretter gløding og forlengelse ved 60 ° C i 1 min.
8. Data Analysis
- Validere QRT-PCR produktene av standard gelelektroforese. Bekrefte at produktet er en enkelt bånd ved forventede molekylvekt (varierer for hver sonde).
MERK: Hvis en sonde produserer flere band eller en eneste band på en upassende størrelse, så spesifisitet er tvilsom, og dette utelukker genet fra analyse. - Undersøk alle forsterker kurver og står for noe unormalt 14. Beregne gjennomsnittlig CT verdi for hver prøve / gen kombinasjon 15.
MERK: CT verdier for positive kontroller vanligvis varierer 10-30. CT verdier for negative kontroller vanligvis varierer 35-40 (ingen forsterkning). CT verdier 30-35 anses svært lav uttrykkog bør tolkes med varsomhet 14. - Rapporter data
- Hvis prøvene faller i CT = 10-30, kan data også rapportert som gangers endring i transkripsjon overflod i forhold til en kontrollprøve.
MERK: Brett endring er lik 2 ^ (- ΔΔCT) hvor ΔCT er i forhold til et husholdningsgenet ved å subtrahere den gjennomsnittlige CT av prøven fra husholdningsgenet og ΔΔCT er forskjellene i ΔCT mellom prøven og en positiv kontroll 15.
- Hvis prøvene faller i CT = 10-30, kan data også rapportert som gangers endring i transkripsjon overflod i forhold til en kontrollprøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som bevis på prinsippet ble genuttrykk vurdert til å utforske differensiering dynamikk under hjerte utvikling. I sebrafisk, oppstår hjertestamfedre fra en mesodermal populasjon av celler som migrerer til fremre sideplate mesoderm hvor de smelter sammen for å danne den lineære hjertet tube. Før fusjon, hjerte forfedre begynne å uttrykke transkripsjonsfaktor nkx2.5 (NK2 homeobox 5), som antas å være den tidligste spesifikk markør for hjerte forfedre 16,17. Her, en tidligere beskrevet BAC transgen fisk Tg (nkx2.5: ZsYellow) 18, forkortet nkx2.5: ble ZSY brukt til å undersøke hjertedifferensieringsmarkører i enkeltceller på 18 somitt scenen, 18 timer etter befruktning (HPF) 12. Dette var den tidligste tidspunkt ved hvilket ZsYellow signal var visuelt detekterbar. Som tidligere beskrevet for denne transgene linje, etiketter ZsYellow hjerte stamceller, som vill som noen ekstra-hjertecellene som gir opphav til svelg bue endotelceller ved 28 HPF 19 (figur 1A-B, data ikke vist). På 18 HPF, nkx2.5: ble ZSY embryoer dissosiert til en enkelt cellesuspensjon deretter farget med Sytox Blå å utelukke døde celler. Live ZsYellow positiv, Sytox Blå negative celler var FACS sortert ved hjelp av enten en MoFloXDP eller Sony SH800Z sorter utstyrt med 100 mikrometer dyse (figur 1C-F). For å vurdere renhet av sortert befolkningen og etter slags levedyktighet, ble en delmengde av sorterte cellene farget med Sytox blå og evaluert andelen av hendelser som falt innenfor den opprinnelige sorterings gate (Figur 1G-J).
Etter sortering ble cellene inngått en integrert mikrofluidkrets (IFC) chip arbeidsflyt (figur 2A) i henhold til produsentens instruksjoner. En hemocytometer, kombinert med trypanblått exclusion ble brukt for å måle cellediameter, konsentrasjon, og levedyktighet (figur 2B, og data ikke vist). Cell oppdrift ble optimalisert (6,5: 3,5 celler: buffer) i henhold til produsentens instruksjoner, og cellene ble lastet på en IFC for å fange 5-10 mikrometer diameter celler. For å vurdere fangsteffektivitet, fluorescens og / eller lyse felt signalene ble fotografert på alle fangst områder, ble en flislegging funksjon i FIJI brukes til å sy et enkelt bilde av MicroFluidics plate. Hver fange nettstedet inneholdt 0, 1, eller> 1 enkeltceller (Figur 2C-F). Som forventet fra FACS berikelse, fanget cellene uttrykte ZsYellow (figur 2G). Capture effektivitet oversteg 90% i 5 separate eksperimenter med nkx2.5: ZSY sortert celler, og minst 70% av fangst steder ble okkupert av en enkelt celle (data ikke vist). Cellene ble lysert, RNA isolert, cDNA syntetisert og spesifikke mål gener ble forsterket, alt i henhold til produsentens instruksjoner.
En undergruppe av celleopptaksseter ble utvalgt for QRT-PCR-analyse som beskrevet i protokollen ovenfor. Nærmere bestemt, elongeringsfaktor 1a (efl1a) 20 og glyceraldehyd-3-fosfat (GAPDH) 21 ble analysert som husholdningsgener som forventes å bli uttrykt i hver celle; GATA bindende protein 4 (gata4) 22 og NK2 homeobox 5 (nkx2.5) så tidlig hjerte progenitor markører; ISL LIM homeobox en boks 1 (isl1) som andre hjerte felt markør 23,24; og myosin lettkjede (myl7) og ventrikulær myosin tung kjede (vmhc) 25 for å markere ventrikulære kardiomyocytter. Gene-spesifikke prober ble validert ved hjelp av cDNA fra 48 HPF embryoer (figur 3). QRT-PCR ble brukt for å vurdere relativ genekspresjon av disse genene i 45 enkeltceller fra 18 HPF embryo, en no-mal negativ kontroll, og en samlet befolknings positive kontroll containing cDNA fra alle 96 fangststeder. Raw CT verdier for 40 representative celler og kontroller er vist i Tabell 1. Spesielt fra bassenget av 46 celler undersøkt, ble 6 celler ekskludert fra analysen fordi alle genuttrykk CT verdier overskrides CT = 35,0, og det er ukjent om disse high CT verdier skyldes sanne, svært lave nivåer eller prøve degradering. Siden utvalget av CT verdier for husholdningsgenet, ef1a, var for bred til å sammenligne genekspresjon mellom prøvene, og mange CT verdier overskrides 30, CT verdier ble visualisert som et varmekart (figur 3). Sammenligning på tvers av prøvene, ble betydelig heterogenitet i gen-ekspresjon observert, og cellene ble klassifisert som Type cellene 1-5 basert på ekspresjon mønster (figur 3).
Figur 1. Enkelt celle isolasjon av sebrafisk
Figur 2. Enkelt celle fangst av sebrafisk nkx2.5: ZSY
igur 3 "src =" / files / ftp_upload / 53877 / 53877fig3.jpg "/>
Figur 3. Gene uttrykk analyse av fangst enkelt sebrafisk nkx2.5:. ZSY positive celler Gene uttrykk ved QRT-PCR i positive kontroller (embryoer på 2 dager-post-fertilisering, sammenslåtte cDNA fra enkeltceller), negativ kontroll (no-mal ) og 40 enkeltceller (Cell 01-40). Raw CT verdier ble fargekodet basert som beskrevet i Key. Ef1a = forlengelse faktor 1a, gata4 = GATA bindende protein 4, nkx2.5 = NK2 homeobox 5, myl7 = myosin lett kjede 7, vmhc = ventrikkel myosin tung kjede, GAPDH = glyseraldehyd-3-fosfat, og isl1 = ISL LIM homeobox en. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Cycle Threshold (CT) | ||||||||
| ef1a | gata4 | nkx25 | myl7 | vmhc | GAPDH | isl1 | ||
| embryo | 20.69 | 20.92 | 28.59 | 32,87 | 26.30 | 27.00 | 33.57 | |
| Basseng | 26.4 | 22,4 | 27.7 | 27.4 | 24.5 | 29.2 | 40.0 | |
| NTC | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | |
| Type 1 | Cell-01 | 25.1 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 |
| Cell-02 | 25.4 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | |
| Cell-03 | 26.3 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | |
| Cell-04 | 27.4 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | |
| Cell-05 | 28,0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | |
| Cell-06 | 28.2 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | |
| Cell-07 | 29.3 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 400,0 | |
| Cell-08 | 30.7 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | |
| Cell-09 | 34.3 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | |
| Type 2 | Cell-10 | 23.5 | 28,0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 26.3 | 40.0 |
| Cell-11 | 23.5 | 27.2 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | |
| Cell-12 | 23,7 | 17.9 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | |
| Cell-13 | 24,1 | 32.4 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | |
| Cell-14 | 24.9 | 27.5 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | |
| Cell-15 | 25.9 | 28.6 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | |
| Cell-16 | 26.0 | 28.1 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | |
| Cell-17 | 27,0 | 27.7 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 38.5 | 40.0 | |
| Cell-18 | 27,0 | 27.4 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | |
| Cell-19 | 27,0 | 30.2 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 38.2 | 40.0 | |
| Cell-20 | 27,0 | 28.2 | 40.0 | 40.0 | 400,0 | 39.2 | 40.0 | |
| Cell-21 | 27.7 | 30.3 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 38.6 | 40.0 | |
| Cell-22 | 30.4 | 26.2 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 38.3 | 40.0 | |
| Cell-23 | 31.3 | 22,4 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 39.7 | 40.0 | |
| Cell-24 | 31.5 | 28.8 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 39.5 | 40.0 | |
| Cell-25 | 33.8 | 27.4 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 37.3 | 40.0 | |
| Cell-26 | 40.0 | 27.4 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 36.6 | 40.0 | |
| Type 3 | Cell-27 | 24,7 | 19.9 | 28.8 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 |
| Cell-28 | 24,8 | 28.4 | 26.3 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | |
| Cell-29 | 25.1 | 23.5 | 27.6 | 40.0 | 40.0 | 32.5 | 40.0 | |
| Cell-30 | 26.3 | 21.4 | 27.5 | 40.0 | 40.0 | 39.9 | 40.0 | |
| Cell-31 | 26.9 | 24,8 | 28.2 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | |
| Cell-32 | 27,0 | 22.5 | 23,8 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | |
| Cell-33 | 27.8 | 27.6 | 27.7 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | 40.0 | |
| Cell-34 | 28.1 | 21,9 | 26.6 | 40.0 | 40.0 | 37.7 | 40.0 | |
| Cell-35 | 29.3 | 26.5 | 28.1 | 40.0 | 40.0 | 38.3 | 40.0 | |
| Type 4 | Cell-36 | 24,8 | 20.3 | 26.0 | 27.4 | 26.6 | 40.0 | 40.0 |
| Cell-37 | 28.7 | 22,3 | 25.9 | 28.9 | 22.9 | 38.5 | 40.0 | |
| Type 5 | Cell-38 | 25.5 | 20,0 | 29.3 | 23,0 | 19.9 | 25.9 | 40.0 |
| Cell-39 | 25.9 | 21,8 | 28.6 | 25.1 | 21,7 | 25.7 | 40.0 | |
| Cell-40 | 28.9 | 22,0 | 27,0 | 23,0 | 21.3 | 27.6 | 40.0 | |
Tabell 1. Raw CT verdier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fremgangsmåten som her er beskrevet anvender ekspresjon av et fluorescerende protein under kontroll av en celletype-spesifikk promoter for å berike en populasjon av hjerte progenitorceller fra sebrafisk embryoer for bruk i mikrofluid assistert enkelt celle capture system for å vurdere ekspresjon av et delsett av hjerte gener i enkelt celler. Forutsatt at FACS laser eksitasjons- og emisjons evner er kompatible med fluorofor (er) av valget, kan denne metoden anvendes for en hvilken som helst fluorescerende reporter linje. Mange sebrafisk reporter linjene er allerede eksisterer, og transgen fisk bærer romanen journalister kan genereres i så lite som tre måneder. I tillegg kan dette arbeidet strømnings være tilpasset til å fremstille cDNA fra hele transkriptomet for enkeltcelle-RNA-sekvensering. For å gjøre dette, trinn 5-7 må endres litt for bruk med kjemikalier som er optimalisert for å forberede cDNA for å generere biblioteker egnet for RNA sekvensering. Men det er tilrådelig å validere befolkningen heterogenitetved hjelp av metoden beskrevet her før pursing høy gjennomstrømning sekvenseringsapplikasjoner.
Det er viktig å merke seg at det ikke er noen begrensninger i den beskrevne fremgangsmåte. Først bruk av integrerte mikrofluidkrets (IFC) plater krever spesialisert, kostbart utstyr. Men microfluidic chips gi betydelige fordeler i forhold til tradisjonelle 96 brønner og 384 brønns plate formater for analysering av enkeltceller. Ved å strømme celler og reagenser gjennom mikrometer skala kjørefelt, er enkeltceller plassert i enkelt fangst områder der de kan observeres direkte for å bekrefte at de er enkeltceller i god helse. RNA-ekstraksjon og cDNA-syntese oppstår in situ på IFC brikken ved hjelp av meget lavt volum for hver celle. Integrerte fluidic chips, på den tiden dette ble skrevet, er kommersielt tilgjengelig gjennom bare én kilde. Selv om ikke-kommersiell fabrikasjon har blitt utført av flere grupper, er det utenfor kapasiteten på de fleste laboratorier. Trinn 5-7 kanmå endres for plattformer produsert av andre selskaper eller in-house fabrikasjoner. For det andre, selv om kommersielt tilgjengelige IFC plater kan romme opp til 96 gener er gener valgt begrenset av tilgjengeligheten av fluorogene-merkede gener validert for bruk i sebrafisk. Tredje, sebrafisk cellene er vanligvis mindre enn pattedyrceller, og denne lille størrelsen gir utfordringer for å prøve behandlingen. En liten endring i cellediameter oversettes til en stor endring i cellevolum, noe som reduserer tilgjengelig materiale og redusere sannsynligheten for å detektere lav ekspresjon av gener.
Det er flere andre hensyn for denne protokollen. I trinn 1, er det viktig å kun bruke embryoer befruktede løpet av et kort tidsvindu. Holder temperaturen konstant og uten å begrense oksygenforholdene, sebrafisk embryoer utvikler synkront. Den ultimate avlesning av denne protokollen (relativ genekspresjon fra enkeltceller) kan ikke diskriminere kilden heterogeteten mellom individuelle celler. Av denne grunn, tolkning av intercellulære heterogenitet er avhengig av tilfredstrinnvise befruktede egg og synkron utvikling. I trinnene 2-3, er det en avveining mellom dissosiasjon og levedyktighet. Selv trinn 4 velger for levedyktige celler, og trinn 3 inneholder flere filtreringstrinn som hjelper utelukke multimerer, over-fordøyelsen vil redusere levedyktig materiale tilgjengelig for FACS og potensielt redusere sortert celle yield. Fremgangsmåte for å feilsøke lav levedyktighet inkluderer å redusere koketiden, redusere finmaling intensitet, og optimalisere antall embryoer i utgangsmaterialet. FACS berikelse av cellepopulasjon av interesse (trinn 4) er uten tvil den mest kritiske trinnet i denne protokollen. Strenge sorteringskriterier er avgjørende for å generere en enkelt celle preparat som inneholder bare leve celler som uttrykker fluorescerende protein av interesse. Forurensende celler fra andre populasjoner kan føre til falsk representasjon av inter heterogenitet. spesielt,FACS berikelse av en befolkning av interesse er ikke begrenset til de to farge strategien vist i denne protokollen. Mer komplekse strategier kan produsere mer raffinerte cellepopulasjoner, og er en rask måte å forlenge metodikken rapportert i bevis på prinsippet studie. I trinn 5, kan cellene observeres direkte for å bekrefte antall celler fanges opp, celle helse og ekspresjon av fluorescens protein. Men, avhengig av cellestørrelse og lysstyrke, fluoroforen av interesse er ikke visuelt detekterbart og er ikke en pålitelig avlesning. Vellykket gjennomføring av trinn 6-8 krever nøye overholdelse av produsentens protokoller.
Som bevis på prinsippet ble uttrykket nivåer av en undergruppe av kjente hjertemarkører vurderes i enkelt stammer fra en tidligere beskrevet BAC transgen sebrafisk linjen nkx2.5: ZSY å undersøke hjertedifferensieringsmarkører i enkelte nkx2.5: ZSY positive celler på 18 timer etter befruktning (HPF). For å utforske heterogeneity for differensiering markører uttrykt i fanget nkx2.5: ZSY uttrykker celler, en pakke med gener ble analysert inkludert housekeeping gener (ef1a, GAPDH), transkripsjonsfaktorer som er kjent for å være slått på tidlig hjerte spesifikasjonen (gata4, nkx2.5), en andre hjerte-feltet stamfar markør (isl1), og gener som er kjent for å være slått på senere under hjertestans differensiering (myl7, vmhc). Den relative overflod av hvert gen ble målt ved QRT-PCR-terskelsyklus ved å beregne (CT). Det laveste CT-verdi beregnet var 17,9 og høyest var 40, som representerer ingen forsterkning (tabell 1). CT-verdier på> 35,0 ble vurdert under deteksjons.
Av de 46 cellene i datasettet, 6 ble ekskludert på grunn av feil amplifisering av noen gener. De resterende cellene ble sub-kategorisert celler inn i 5 typer basert på uttrykk for gata4, nkx2.5, myl7, og vmhc, og were sortert etter ef1a verdi innenfor grupper. Selv GAPDH ble opprinnelig tatt med som en mulig husholdningsgenet, uttrykk var svært variabel over cellene, noe som gjør det uegnet som husholdningsgenet. GAPDH uttrykket sannsynlig bedre representerer endringer i energiomsetningen i forbindelse med hjertestans differensiering i denne celletype. Interessant nok var det en celle hvor ef1a var un-påvisbart, men et annet gen var detekterbar (gata1 i celler 26). Dette tyder på at mens ef1a er vanligvis en tilstrekkelig rengjøring genet for å skille mellom vellykkede og mislykkede enkelt celle reverse transkripsjonsreaksjoner, kan det ikke være ideelt for alle bruksområder. Mangelen på ef1a ekspresjon i cellen 26 kan være på grunn av enkeltcelletranskripsjon dynamikk. Siste single-celler studier viser at gentranskripsjon er fundamentalt stokastisk, alternerende mellom faser av rask og ubetydelig transkripsjonen aktivitet 26. Thans transkripsjonen sprengning Modellen viser at anvendelse av en husholdningsgenet for kvantitative sammenligninger mellom enkeltceller kan være helt uegnet.
I Type 1-gruppen, er ef1a den eneste genet påvises. Disse celle kan omfatte enten nkx2.5: ZSY negative celler eller celler med svært lav ekspresjon av andre gener av interesse. Type 2-celler, med unntak av Cell-26, uttrykte både ef1a og gata4 med ingen korrelasjon i de relative ekspresjonsnivå av disse genene. Spesielt, kan nkx2.5 uttrykk i type 1 og type 2 celler skyldes suboptimal FACS stringens, transcriptional sprengning, transgen leakiness, eller sub-terskel uttrykk nivåer. Type 3 celler uttrykte påvisbare nivåer av ef1a, gata4, og nkx-2.5. Disse cellene er sannsynlig hjerte stamceller og kan omfatte differensiere atrial cardiomyocytes. Type 4 celler uttrykte påvisbare nivåer av ef1a, gata4, nkx2.5, myl7 </ em> og vmhc og er sannsynlige celler differensierende i ventrikkel cardiomyocytes. Type 5 celler uttrykte ef1a, gata4, nkx2.5, myl7, vmhc, og GAPDH. Tilsetningen av påvisbare nivåer av GAPDH antyder at disse cellene har kapasitet for forbedret glykolytisk metabolisme som finnes i differensierte kardiomyocytter. Det var interessant at, til tross for sortering for ZsYellow positive celler fra Tg. (Nkx2.5: ZsYellow), embryoer, 21/40 cellene hadde sub-terskelverdiene for nkx2.5 i vår QRT-PCR-analyse Dette kan skyldes transkripsjonen sprengning eller kan reflektere forskjeller i karakter behandling mellom endogen nkx2.5 og ZsYellow. Viktigere, den andre hjerte-feltet markør isl1 var umulig å oppdage i noen celler eller cDNA samlet fra alle våre opptakssider. I sum, sammenligne på tvers av prøvene, betydelig heterogenitet var tydelig på celle-nivå, noe som tyder på at 18 HPF, nkx2.5: ZSY + cells omfatter hjertestamfedre samt avkom på ulike stadier av differensiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | For removing the chorion from embryos |
| Microcentrifuge tube 2 ml | GeneMate | C-3261-1 | |
| 40 um cell strainer | Biobasic | SP104151 | |
| 35 mm culture dish | Falcon | 351008 | |
| FACS tubes topped with 35 um cell strainer | Falcon | 352235 | |
| P1000 and tips | Rainin | 17005089 | |
| P20 and tips | Rainin | 17005091 | |
| IFC chip manufacturer's protocol | Fluidigm | 100-6117 | Version 100-6117 E1 was used in representative experiment |
| Wide bore pastuer glass pippette | VWR | 14673-010 | For transferring embryos |
| Adult wild type zebrafish | N/A | We used AB line | |
| Adult transgenic zebrafish | N/A | We used Tg(nkx2.5:ZsYellow) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for cell dissociation | |||
| Double distilled water | N/A | ||
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| NaCl | FisherScientific | S271-3 | make stock in water and use for de-yolking buffer |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405 | make stock in water and use for de-yolking buffer |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6014 | make stock in water and use for de-yolking buffer |
| Leibovitz's L-15 | Gibco | 21083-027 | |
| FBS | FisherScientific | 03-600-511 | Heat inactivate; any brand of FBS should be fine |
| Cell Dissociation Reagent 1 -TrypLE | Life Technologies | 12605-010 | Store at room temperature. |
| Cell Dissociation Reagent 2 - FACSmax | Genlantis | T200100 | Store -20; thaw on ice; bring to room temp before use |
| pronase (optional) | Sigma | P5147 | |
| L/D Dye - Sytox Blue | Life Technologies | S34857 | Any live/dead stain suitable for flow cytometry will work |
| Trypan Blue | Gibco | 15250-061 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for IFC plate use and qRT-PCR | |||
| Gene-specific probes | Probes will vary by experiment | ||
| TaqMan Probe ef1a | Life Technologies | Dr03432748_m1 | |
| TaqMan Probe gata4 | Life Technologies | Dr03443262_g1 | |
| TaqMan Probe nk2-5 | Life Technologies | Dr03074126_m1 | |
| TaqMan Probe myl7 | Life Technologies | Dr03105700_m1 | |
| TaqMan Probe vmhc | Life Technologies | Dr03431136_m1 | |
| TaqMan Probe isl1 | Life Technologies | Dr03425734_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Life Technologies | 4369016 | |
| Reagents listed in IFC manufacturer's protocol | |||
| C1 Reagent Kit | Fluidigm | 100-5319 | Reagents for loading cells onto IFC plate |
| Ambion Single Cell-to-CTTM | Life Technologies | 4458237 | Reagents for reverse transcription and pre-amplification steps |
| Molecular Biology Quality Water | Corning | 46-000CM | |
| C1 IFC for PreAmp (5-10 um) | Fluidigm | 100-5757 | IFC plate for small cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| C1 AutoPrep machine | Fluidigm | 100-5477 | For IFC plate use |
| Hemocytometer | Sigma Aldrich | Z359629 | For counting cells and assessing cell size |
| Dissecting microscope | For removing embryos from chorion | ||
| Tissue culture microscope | For assessing single cell digestion | ||
| FACS machine | For isolating cells of interest |
References
- Speicher, M. R. Single-cell analysis: toward the clinic. Genome medicine. 5, (2013).
- Macaulay, I. C., Voet, T. Single cell genomics: advances and future perspectives. PLoS genetics. 10, e1004126 (2014).
- Marco, E., et al. Bifurcation analysis of single-cell gene expression data reveals epigenetic landscape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 5643-5650 (2014).
- Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Current opinion in biotechnology. 23, 110-119 (2012).
- Garlanda, C., Dejana, E. Heterogeneity of endothelial cells. Specific markers. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 17, 1193-1202 (1997).
- Diaz-Cano, S. J. Tumor heterogeneity: mechanisms and bases for a reliable application of molecular marker design. International journal of molecular sciences. 13, 1951-2011 (2012).
- Guo, G., et al. Mapping cellular hierarchy by single-cell analysis of the cell surface repertoire. Cell stem cell. 13, 492-505 (2013).
- Guo, G., et al. Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst. Developmental cell. 18, 675-685 (2010).
- Treutlein, B., et al. Reconstructing lineage hierarchies of the distal lung epithelium using single-cell RNA-seq. Nature. 509, 371-375 (2014).
- Kimmel, C. B. Genetics and early development of zebrafish. Trends in genetics : TIG. 5, 283-288 (1989).
- Liu, J., Stainier, D. Y. Zebrafish in the study of early cardiac development. Circulation research. 110, 870-874 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 203, 253-310 (1995).
- Zhao, S., Fung-Leung, W. P., Bittner, A., Ngo, K., Liu, X. Comparison of RNA-Seq and microarray in transcriptome profiling of activated T cells. PloS one. 9, e78644 (2014).
- McCall, M. N., McMurray, H. R., Land, H., Almudevar, A. On non-detects in qPCR data. Bioinformatics. 30, 2310-2316 (2014).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature. 3, 1101-1108 (2008).
- Lyons, I., et al. Myogenic and morphogenetic defects in the heart tubes of murine embryos lacking the homeo box gene Nkx2-5. Genes & development. 9, 1654-1666 (1995).
- Chen, J. N., Fishman, M. C. Zebrafish tinman homolog demarcates the heart field and initiates myocardial differentiation. Development. 122, 3809-3816 (1996).
- Zhou, Y., et al. Latent TGF-beta binding protein 3 identifies a second heart field in zebrafish. Nature. 474, 645-648 (2011).
- Paffett-Lugassy, N., et al. Heart field origin of great vessel precursors relies on nkx2.5-mediated vasculogenesis. Nature cell biology. 15, 1362-1369 (2013).
- McCurley, A. T., Callard, G. V. Characterization of housekeeping genes in zebrafish: male-female differences and effects of tissue type, developmental stage and chemical treatment. BMC molecular biology. 9, 102 (2008).
- Tang, R., Dodd, A., Lai, D., McNabb, W. C., Love, D. R. Validation of zebrafish (Danio rerio) reference genes for quantitative real-time RT-PCR normalization. Acta biochimica et biophysica Sinica. 39, 384-390 (2007).
- Serbedzija, G. N., Chen, J. N., Fishman, M. C. Regulation in the heart field of zebrafish. Development. 125, 1095-1101 (1998).
- de Pater, E., et al. Distinct phases of cardiomyocyte differentiation regulate growth of the zebrafish heart. Development. 136, 1633-1641 (2009).
- Hami, D., Grimes, A. C., Tsai, H. J., Kirby, M. L. Zebrafish cardiac development requires a conserved secondary heart field. Development. 138, 2389-2398 (2011).
- Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. Y. Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish. Developmental biology. 214, 23-37 (1999).
- Molina, N., et al. Stimulus-induced modulation of transcriptional bursting in a single mammalian gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 20563-20568 (2013).
