Introduction
Большинство современных исследований клеточной и молекулярной биологии основаны на средних показателях населения. Тем не менее, важные биологические события могут быть замаскированы этих традиционных анализов населения на основе, так как небольшие группы населения могут играть важную роль в биологических процессах и исход заболевания. Понимание экспрессии генов в гетерогенных популяций на уровне одной клетки может (и имеет) приводят к соответствующим биологическим и клиническим прозрений 1,2. Беспокойство исследований эмбрионального развития, в большей популяции клеток, клетки - предшественники часто недостаточно представлены, что делает его сложным для обнаружения тонких изменений в экспрессии генов , которые в конечном счете , инициирующих клеток судьбы решений 3. Точно так же, один тип клеток , могут иметь различные профили экспрессии в ответ на микроокружение 4. Например, эндотелиальные клетки - резиденты в том же органе или в различных органах (например., Аорте или почек) проявляют значительную гетерогенность , несмотря на общий обмен morphological и функциональные особенности 5. Кроме того, раковые клетки , обитающие той же опухоли также могут иметь различные молекулярные профили или мутации на уровне одной клетки 6.
В модельных системах, транскриптомика в одиночных камерах успешно идентифицировали новые клеточные популяции, характеризуются промежуточными состояниями , которые происходят во время дифференцировки клеток, и выявили дифференциальные клеточные реакции на стимулы 7,8,9. Такое понимание был бы замаскирован в обычных популяционных исследованиях. Эмбрионы рыбок данио являются чрезвычайно малоиспользуемых источником стволовых, прародителя и дифференцируя клеток для изучения вопросов одной гетерогенности клеточной и молекулярной регуляции клеточных идентичности в процессе развития. Их весьма стереотипны, исключая виво развитие и простота генетических манипуляций делают их отличной моделью системы для такого подхода 10,11. В частности, основным ограничением для интерпретации одного клеточного гене выражение данных является то , что надежная идентификация новых промежуточных состояний клеток в процессе развития требует очень тщательного сроки сбора ткани 9. Это необходимо для того, чтобы гарантировать, что гетерогенность между захваченными клетками представляет гетерогенность в пределах ткани в одной точке времени, а не гетерогенность экспрессии гена, представленного возрастного дифференциации клеток. По сравнению с мышами, развитие эмбриона данио рерио могут быть точно синхронизированы через большое количество эмбрионов 12. Кроме того, при больших размерах сцепления, данио эмбрионы могут быть использованы в качестве обильного источника стволовых и клеток-предшественников.
Этот протокол описан способ выделения клеток из эмбрионов данио и захвата отдельных клеток с использованием коммерчески доступного чипа и autoprep интегрированной системы микрофлюидики схема (МФК) для анализа экспрессии генов QRT-PCR. Этот протокол может быть быстро передаваемом к любым мультиплексирование с высокой пропускной способностью анализов, включая целомтранскриптомный секвенирования , которая позволяет более всесторонний анализ клеточной неоднородности 13. Он также предлагает ряд преимуществ для традиционных анализов экспрессии генов. Один протокол изоляции клеток дает высокую жизнеспособность после FACS, что уменьшает долю скомпрометированных клеток, которые включены в последующих применений. Используя IFC, захваченные клетки могут наблюдать непосредственно оценить скорости захвата и оценки состояния здоровья клеток морфологически. Кроме того, этот протокол широко применима к данио научное сообщество, требуя только меченый трансгенной линии рыбы и доступ к микрофлюидальных технологии улавливания клеток.
В качестве доказательства принципа, отдельные клетки, полученные из кардиальных предшественников были выделены и захваченный на чипе МФК, а затем относительное обилие кардиомаркеров дифференцировки измеряли с помощью QRT-PCR. Анализ экспрессии генов на уровне одной клетки показывает, что сердечные клетки-предшественники сосуществуют с их differentiating потомством. Понимание того, полученные от одноклеточного профилирования сердечных клеток-предшественников может пролить свет на неоднородности в экспрессии генов моделей среди сердечных клеток-предшественников в процессе развития позвоночных животных, которые могут быть замаскированы в традиционных анализов популяций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол требует использования живого, взрослых данио для получения эмбрионов. Эмбрионы собирают для сбора ткани. Крайне важно, чтобы получить одобрение соответствующих советов по этике обзора для проведения этого эксперимента.
1. Получить постановочные зародыши
- За день до начала эксперимента, подготовить здоровую, взрослых данио для разведения. Поместите один мужчина и одна женщина на противоположных сторонах четкого делителя в разведении танк.
- Повторите 1.1 столько селекционных танках, необходимых для производства достаточного эмбриона для нисходящего применения. Получают из эмбрионов как дикого типа рыбы и трансгенных рыб, которые экспрессируют флуоресцентные белки в типе клеток, представляющих интерес.
Примечание: Количество эмбрионов, необходимых для последующих применений в шагах 2-8, зависит от относительного содержания клеток, представляющих интерес в момент точки интереса. Хотя это может варьироваться в зависимости от типа клеток, 200 эмбрионов производят 2,000-5,000 отсортированные клетки, когда сгезов, представляющих обоюдный интерес <1,0% от общего числа клеток на 24 HPF (ч после оплодотворения). - На следующее утро, менять воду в панировке резервуаре путем переноса рыбы свежей селекционной бак и удалить разделитель. Наклоните бак под углом, чтобы стимулировать размножение.
- Сбор постановочные эмбрионов.
- Каждые 15 мин, собирают эмбрионов путем переноса взрослых на свежий разведение танк и прохождения яйца, которые остались позади через ситечко.
Примечание: Эмбрионы рыбок данио развиваются синхронно, когда поддерживается при сравнимых плотностей и температур. - Полоскание яйца с яйцом воды (0,21 г / л Мгновенные соли океане в 1 л дистиллированной воды) и переносят в чашку Петри. Передача чашку Петри на влажной инкубаторе при температуре 28,5 ° С с циркуляцией воздуха.
- Каждые 15 мин, собирают эмбрионов путем переноса взрослых на свежий разведение танк и прохождения яйца, которые остались позади через ситечко.
- Через два часа после последнего сбора, сортировки оплодотворены, многоклеточные эмбрионы в 10 см чашки Петри и уменьшить плотность до 50 эмбрионов на чашку. Выберите эмбрионы из одного, 15мин временное окно сбора ниже по течению приложения. Инкубируйте эмбрионов на 28,5 ° C.
Примечание: Например, сбор эмбрионов в 8:30, 8:45, 9:00, 9:15, 9:30, 9:45, 10:00 и 10:15. Сравнивая между моментами времени, если наибольшее количество оплодотворенных эмбрионов из тисков, собранных в 9:00, а затем использовать только эти зародыши для последующих применений.
2. Настройка для одного сотового Разобщения
- Приблизительно за 30 минут до времени точки интереса (18 ФВЧ) удалить эмбрионов из их хориона вручную с тонким пинцетом.
- Сбор и обозначить следующие действия для каждого условия: два 2 мл микроцентрифужных трубки, один 40 мкм клеточный фильтр, один 35 мм блюдо культуры клеток, и два FACS трубки увенчанный ячейки фильтра 35 мкм.
- Охладить следующие реагенты на льду: Яйцо Вода, содержащая 0,21 / л соли Instant Ocean в 1 л двойной дистиллированной воды; Де-yolking буфера , содержащего 55 мМ NaCl, 1,8 мМ KCl, и 1,25 мМ NaHCO 3; и FACS-буфера, содержащего L-15 Лейбовиц, дополненной 5% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки.
- Принесите 1 мл на образец для диссоциации клеток Реагент 1 до комнатной температуры. Оттепель 1 мл Cell диссоциация Реагент 2 на пробу на льду. Доведите немедленно RT перед использованием.
3. Single Cell диссоциация
- Используя широкий отверстие стеклянной пипетки переносят 100-300 эмбрионов в 2 мл микро центрифуге трубки в минимальном объеме воды яйцо.
- Эвтаназии эмбрионов путем замены воды с 1 мл охлажденного льдом Яйцо Вода и погружая трубку во льду в течение 20 мин.
ВНИМАНИЕ! Очень важно , чтобы получить одобрение от надлежащего институционального комитета по надзору по уходу за животными для этого метода эвтаназии (охлаждения на льду с последующей клеточной диссоциации в качестве вторичного эвтаназии). Стандартный эвтаназии, как правило, требует, чтобы эмбрионы <3-й день после оплодотворения отбеливают после того, как они охлаждаются, которые не подходят для получения жизнеспособных клеток. - Промыть эмбрионы два раза 1 мл охлажденного льдом Яйцо Вода. Для мытья используйте широкий отверстие стеклянной пипетки, чтобы удалить яйца воды и P1000, чтобы добавить яйцо воды.
- Удалите желток путем замены эмбриона воды с 1 мл буфера Deyolking и растиранием 8-12 раз с наконечником P1000, или пока желток не растворится, и только тела эмбрионов видны.
- Собирают ткани путем центрифугирования при 300 мкг в течение 1 мин. С помощью пипетки, чтобы аккуратно удалить супернатант, не нарушая гранул ткани. Повторное приостановить в 1 мл воды яйцо.
- Повторите шаг 3.5 в общей сложности на трех промывок, а на последней промывки, вновь приостановить в 1 мл RT диссоциации клеток Реагент 1.
- Выдержите в диссоциации клеток Реагент 1 в течение 10 мин при комнатной температуре с трубками расположен горизонтально. Каждые 2-3 мин, осторожно растирают с P1000 пипетки, чтобы предотвратить слипание.
Примечание: Ручка образцы осторожно во время выполнения действий тритурационного. Когда-нибудь один, большой комок будет формировать в трубке из клубка тел эмбрионов. Это будетразойтись с дополнительным переваривания помогший нежным растиранием. НЕ VORTEX. - Собрать ткань центрифугированием при 300 х г в течение 3 мин. Удалить супернатант и ресуспендируют в 1 мл клеточной диссоциации реагента 2.
- Выдержите в течение 5-15 мин при комнатной температуре. Место труб в горизонтальном направлении. Каждые 2-3 мин, аккуратно растереть, чтобы предотвратить слипание. Каждые 5 мин, оценить прогресс пищеварения.
- Для того, чтобы оценить прогресс пищеварения, развести 2 мкл супернатанта в 18 мкл FACS буфера и пипеткой в капельке на клеточной культуре блюдо.
- Поместите покровное над образцом и наблюдать под микроскопом культуры ткани в 10х и 20х увеличениях.
Примечание: Препарат должен появиться как смесь отдельных клеток, малых кластеров, больших кластеров, а также время от времени в основном поврежденную тела эмбриона. - Визуально оценить долю препарата, который отдельные клетки и небольшие кластеры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерное пищеварение приведет к снижению жизнеспособности; под-пищеварение приведет к снижению одного выхода клеток. </ Li>
- Сбор клеточного препарата путем центрифугирования при 300 мкг в течение 5 мин. Удалите супернатант и повторно приостанавливать в 1 мл холодного FACS буфера.
- Смочить фильтр грубой очистки ячейки 40 мкм с FACS буфером. Передайте клеточной суспензии через сито 40 клеток мкм на 35 мм для культивирования клеток блюдо с. Промыть клеточный фильтр один раз с 1 мл FACS буфера сортировки.
- Передача Проточный в микроцентрифужных пробирку 2 мл. Собирают клетки центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин и вновь приостановить в 100 мкл FACS буфера.
- Граф выхода клеток с использованием гемоцитометра. Далее разбавленные образцы до 5х10 6 клеток на мл, или оптимальной концентрации , рекомендованных для FACS машины выбора. Дополнительно, при подсчете выхода клеток на гемоцитометра, контрастное мертвые клетки с трипановым синим, чтобы подтвердить жизнеспособность клеточного препарата до начала FACS сортировки.
Примечание: Препараты, которые слишком разведенным будут принимать избыточное количество времени для сортировки. Препараты, которые тоже сoncentrated имеют тенденцию группироваться в мультимеры и неоптимальным для сортировки чистую популяцию. - Резерв 10-20% от каждого образца, чтобы использовать в качестве неокрашенных элементов управления. Для остальных образцов, пятно мертвых клеток путем добавления / мертвых (L / D) дискриминация флуоресцентный краситель живой в каждом образце. Не мой.
Примечание: Любой флуоресцентный краситель, который проникает клетки с ослабленной клеточных мембран и пятен нуклеиновые кислоты могут быть использованы в качестве L / D красителя, при условии, что спектры флуоресценции совместим с машиной FACS выбора и маркировки флуорофора интересующих клеток.- Не мойте препарат после добавления красителя, как некоторые клетки умирают в пути к очистке FACS и должны быть исключены из отсортированного населения.
- Смочить сетчатый фильтр 35 мкм клеток FACS колпачком трубку с 20 мкл FACS буфера. Добавить ячейки в ситечко и собирать под действием силы тяжести. Хранить на льду.
4. FACS Обогащение
- Используйте FACS для обогащения одного, Живые клетки, экспрессирующие флуоресцентный маркер.
- Установить ворота, чтобы отличить клетки от мусора на график рассеяния вперед рассеяния (FSC-A) амплитуды против бокового рассеяния амплитуды (SSC-A), как с линейного масштабирования.
Внимание! Рыбок данио клетки , как правило , меньше , чем мышь или человеческих клеток. Это нашло отражение в более низкой базальной разделения между клетками и мусором. - От ворот, установленного в 4.1.1, установить ворота для обогащения отдельных клеток и исключить мультимеры, используя график рассеяния высоты переднего рассеяния (FSC-H) и низкой высоты бокового рассеяния (SSC-H), как с линейного масштабирования.
Примечание: Клетки с непропорционально высоким FSC-H и низкой SSC-H являются вероятными мультимеры и исключены из сортировки. - Из множества ворот в пункте 4.1.2, используя одиночные элементы управления цветом, установите ворота, чтобы включать только живые клетки, используя график рассеяния FSA-А с линейным масштабированием и амплитуды канала, используемого для обнаружения L / D пятно с масштабированием журнала. Включите L / D-отрицательных клеток.
- Изворота установлены в п.4.1.3, с помощью одного средства управления цветом, установите ворота, чтобы включать только живые клетки с положительной флуоресценции, используя график рассеяния FSA-А с линейным масштабированием и амплитуды канала, используемого для обнаружения флуоресцентного белка клеточный маркер с масштабированием журнала , Включайте позитивные клетки.
- Установите любые элементы управления компенсации, в случае необходимости, для учета помех между L / D пятно и флуоресцентного белка спектров.
- Установить ворота, чтобы отличить клетки от мусора на график рассеяния вперед рассеяния (FSC-A) амплитуды против бокового рассеяния амплитуды (SSC-A), как с линейного масштабирования.
- Набор логики сортировки к клеткам, которые попадают во все ворота, установленные на шаге 4.1.
- Использование двойной меченых клеток, проверить стробирования для сортировки клеток.
Примечание: Клетки для сортировки будут клетки, а не мусор, отдельные клетки, а не мультимеры, L / D отрицательные и положительные флуоресценции клеток.
- Использование двойной меченых клеток, проверить стробирования для сортировки клеток.
- Сортировка 2000-4000 клеток из популяции интерес в 5 мкл холодного FACS буфера в микроцентрифужных трубки на льду. Чтобы свести к минимуму стрижку и напряжение на клетки во время сортировки, используйте самые низкие давления возможно для клеткисортировщик.
Примечание: 5 мкл капелька FACS буфера служит в качестве подушки безопасности для клеток, покидающих машину FACS. Сбор 2000-4000 клеток непосредственно в FACS буфера устраняет необходимость центрифугирования перед загрузкой на чипы МФК. Эта стратегия рекомендуется, так как центрифугирование может привести к образованию мультимеров, если клетки прилипать друг к другу в осадке. - Оценка анализа жизнеспособности после сортировки.
- Передача 1 мкл сортируется клеток в свежую FACS пробирку с 100 мкл FACS буфера сортировки и 1: 1000 разбавлении L / D пятно. Проходят клетки через сортировщика FACS со стратегией стробирования на шаге 4.1. Используйте соотношение L / D отрицательного к положительному для оценки жизнеспособности отсортированных клеток.
5. Тензодатчики на Microfluidics Chip
- С помощью гемоцитометра, измерять как концентрацию и размер отсортированных клеток.
- Развести отсортированных клеток по меньшей мере 10 мкл. Развести аликвоту 5 мкм; Л клетки с 5 мкл трипанового синего. Нагрузка на гемоцитометра и применять покровное.
- Собирают яркие полевые изображения всех ячеек в 4 х 4 сетками гемоцитометра. Подсчитайте количество живых клеток и вычислить живых клеток / мл. Живые клетки не занимают трипановым синим.
Примечание: Используйте любое стандартное программное обеспечение для анализа изображений для измерения диаметра всех живых клеток. Рассчитайте среднее и стандартное отклонение размера ячейки и выберите пластину IFC, подходящую для диапазона размеров клеток, представляющих интерес. Если диапазон размеров ячейки колеблется в диапазоне размеров ячейки пластины IFC, используют несколько пластин, чтобы охватить весь диапазон ячеек, представляющих интерес.
- Дозаторы к пластине IFC в соответствии с инструкциями производителя (см Материалы).
- Развести клетки 1x10 6 клеток / мл , и выполнить оптимизацию плавучести в соответствии с инструкциями изготовителя.
Примечание: оптимизация Плавучесть гарантирует, что клетки, ни один не оседают на дно и не всплывают на верхней части загрузочной достл для оптимальной загрузки на чипе IFC. Отношение буфера к клеткам, может варьироваться в зависимости от типа клеток, но обычно находится в пределах 6: 4-7: 3 ячеек: буфер. - Добавить клетки к загрунтованную-IFC пластины. Загрузка пластины в совместимые гидросистемы машины, и запустить скрипт нагрузки сотовой ячейки, чтобы подтолкнуть клетки через микрофлюидики цепи и в захват полос движения.
- Развести клетки 1x10 6 клеток / мл , и выполнить оптимизацию плавучести в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Убедитесь, что клетки поселены в захвате участков на пластине МФК.
- Удалить МФК пластину от гидросистемы машины. Установите пластину МФК на микроскоп, снабженный адаптером пластины.
- Собирают снимки светлого поля и флуоресценции для каждого участка захвата на 10-кратным увеличением.
Примечание: Светлое раз захвата может находиться в диапазоне от 10-50 мс, в зависимости от интенсивности лампы. раз захват флюоресценции может находиться в диапазоне от 250-750 мс, в зависимости от яркости флуорофора. Избегайте передержки клеток, чтобы предотвратить фотоповреждения.
6. Синтез кДНК
- Выполнение лизис клеток на месте в соответствии с IИнструкция ФК пластинчатого производителя.
- Добавить лизиса буферы в лунки на пластину МФК. Загрузка пластины на совместимые гидросистемы машины и лизиса сценарий запуска ячейки в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Выполнение обратной транскрипции в соответствии с инструкцией МФК пластинчатого изготовителя.
- Добавить обратной транскрипции реагенты пластины IFC. Загрузка пластины на совместимые гидросистемы машины. Выполнить скрипт обратной транскрипции. Примеры Циклическую: 1 цикл при 25 ° С в течение 10 мин, 1 цикл при 42 ° С в течение 1 ч, а затем 1 цикл при 85 ° С в течение 5 мин.
- Выполнение предварительного усиления с помощью зондов геноспецифических в соответствии с инструкциями МФК пластинчатого изготовителя.
Примечание: Из-за их большей специфичности с номерами низкокопийных, используйте флуорогенные-меченых зондов, а не датчики, оптимизированные для использования с интеркалятором красителей.- Бассейн праймеров и разбавить до конечной 180 нМ каждого. Добавить объединенных праймеров к пластине IFC. Загрузка пластины на совместимых fluidiCS машина. Запуск предусиление сценария.
- Выполнение предварительного усиления со следующими условиями цикла: 1 цикл при 95 ° С в течение 10 мин, затем 18 циклов при денатурации при 95 ° С в течение 15 с последующим отжигом и удлинение при 60 ° С в течение 4 мин. Хранить предварительно усиливается кДНК при 4 ° С до сбора урожая. Урожай кДНК из микрожидком пластины в соответствии с инструкциями изготовителя и хранить при температуре -20 ° С до использования.
7. Выберите кДНК из одиночных клеток для одиночной мишени QRT-PCR
- Развести кДНК в 25 мкл реагента для разведения в соответствии с инструкциями изготовителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Примерный конечный выход составляет 28 мкл предварительно амплифицированный кДНК на клетку. Резервный аликвоты разбавителя для использования в качестве контроля не-шаблона в QRT-PCR.- Ссылаясь на светлом поле и флуоресцентных изображений, записанных на этапе 5.3.2, оценка каждого участка захвата. Вручную подсчитывать и записывать количество клеток. Проведение оценки и записи каждая клетка является ли гриппorescent.
Примечание: Каждый отдельный сайт может содержать 0, 1 или> 1 ячейку, где> 1 ячейка включает в себя сайты захвата, которые содержат несколько ячеек и / или неопределяемый мусора. Если изображения достаточное качество, значение пикселя также может быть назначен для количественного определения интенсивности флуоресцентного сигнала.
- Ссылаясь на светлом поле и флуоресцентных изображений, записанных на этапе 5.3.2, оценка каждого участка захвата. Вручную подсчитывать и записывать количество клеток. Проведение оценки и записи каждая клетка является ли гриппorescent.
- Выбор образцов для анализа QRT-PCR.
- Выбор образцов кДНК из участков захвата, идентифицированных в шаге 7.2, которые содержат точную 1 ячейку с положительной флуоресценции. Пул 1 мкл аликвоты кДНК из каждого образца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это положительный контроль "бассейн", используемый для определения того, выражены гены интерес в любом из выбранных ячеек. - Выберите кДНК из по меньшей мере одного участка захвата, который содержит ровно 0 клеток в качестве отрицательного контроля. Использование разбавителя из стадии 7.1.2 в качестве контроля не-шаблона.
- Выбор образцов кДНК из участков захвата, идентифицированных в шаге 7.2, которые содержат точную 1 ячейку с положительной флуоресценции. Пул 1 мкл аликвоты кДНК из каждого образца.
- Запуск QRT-ПЦР.
- Используйте только зонды, используемые для предварительного усиления на этапе 6.4.1. Загрузите все образцы в triplicatе. Циклическую для реакции 10 мкл на 384-луночного планшета: 1 цикл 50 ° С 2 мин, 1 цикл 95 ° С в течение 10 мин, 40 циклов с денатурации при 95 ° С 15 сек, то отжиг и удлинение при 60 ° С в течение 1 минимум
Анализ 8. Данные
- Проверка продуктов QRT-PCR с помощью стандартного гель-электрофореза. Подтверждение продукт представляет собой одну полосу при ожидаемой молекулярной массы (изменяется для каждого зонда).
Примечание: Если зонд производит несколько полос или одну полосу в неподходящий размер, то специфичность вызывает сомнения, и это исключает ген из анализа. - Изучите все кривые усиления и счета для любых аномалий 14. Вычислить среднее значение CT для каждой комбинации образец / гена 15.
Примечание: значения CT для положительного контроля, как правило, в диапазоне от 10-30. значения CT для отрицательных контролей обычно находится в диапазоне от 35-40 (без усиления). Значения CT 30-35 считаются очень низкая экспрессияи их следует интерпретировать с осторожностью 14. - данные отчетов
- Если образцы попадают в КТ = 10-30, данные могут быть также представлены как кратное изменение в транскрипт численности по сравнению с контрольным образцом.
Заложите изменение равна 2 ^ (- ΔΔCT) , где & Delta ; CТ относительно к гену домашнего хозяйства путем вычитания среднего КТ образца из гена домашнего хозяйства и ΔΔCT является разница в & Delta ; CТ между образцом и положительным контролем 15.
- Если образцы попадают в КТ = 10-30, данные могут быть также представлены как кратное изменение в транскрипт численности по сравнению с контрольным образцом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В качестве доказательства принципа, экспрессия генов оценивали исследовать динамику дифференциации во время развития сердца. В данио, сердечные клетки-предшественники возникают из мезодермы популяции клеток, которые мигрируют к передней боковой пластинки мезодермы, где они сливаются, образуя линейную сердечную трубку. До слияния, сердечные клетки - предшественники начинают выражать фактор транскрипции Nkx2.5 (NK2 гомеобоксных 5), который , как полагают, является самым ранним маркером сердечных клеток - предшественников 16,17. Здесь, описано ранее BAC трансгенная рыба Tg (Nkx2.5: ZsYellow) 18, сокращенно Nkx2.5: ZSY был использован для изучения сердечных маркеров дифференцировки в одиночных камерах на 18 сомитов, 18 ч после оплодотворения (ФВЧ) 12. Это было самое раннее время точка, в которой ZsYellow сигнал был визуально обнаружить. Как было описано ранее для этой трансгенной линии, ZsYellow этикетки сердечные клетки-предшественники, так как мыLL как несколько экстра-сердечных клеток , которые приводят к жаберные дуги эндотелиальные клетки на 28 ФВЧ 19 (рис 1A-B, данные не показаны). В 18 часов после оплодотворения, Nkx2.5: ZSY эмбрионы были диссоциированы в единую клеточную суспензию затем окрашивали Sytox синим , чтобы исключить мертвые клетки. Живой, ZsYellow положительный, Sytox Синие отрицательные клетки были FACS отсортированы с использованием либо MoFloXDP или Sony SH800Z сортировщик , оснащенный насадкой 100 мкм (рис 1C-F). Для оценки чистоты отсортированной населения и после сортировки жизнеспособности аликвоту отсортированных клеток окрашивали Sytox синим и оценивали процент событий, выпавшую в пределах первоначального сортировочной ворот (рис 1G-J).
После сортировки клетки были введены в единую цепь Микрожидкостных (IFC) чип рабочего потока (рис 2А) в соответствии с инструкциями изготовителя. Гемоцитометра, в сочетании с трипановым синим exclusioп использовали для измерения диаметра клеток, концентрацию и жизнеспособность (Фигура 2В, и данные не показаны). Cell плавучести был оптимизирован (6,5: 3,5 клетки: буфер) в соответствии с инструкцией изготовителя, и клетки были загружены на МФЦ, чтобы захватить клетки диаметром 5-10 мкм. Для оценки эффективности улавливания, флуоресценции и / или яркие полевые сигналы были обследованы на всех объектах захвата, функция плиточные в ФИДЖИ использовалась, чтобы сшить одну картину пластины микрофлюидики. Каждый сайт захвата содержал 0, 1 или> 1 отдельные клетки (рис 2C-F). Как и следовало ожидать от FACS обогащения, захваченные клетки экспрессируют ZsYellow (рис 2G). Эффективность захвата превышала 90% в течение 5 отдельных экспериментов с использованием Nkx2.5: ZSY отсортирован клетки, и по меньшей мере 70% участков захвата были заняты одной клетки (данные не показаны). Клетки лизируют, РНК, выделенной, кДНК синтезировали и специфические гены-мишени были усилены, все в соответствии с инструкциями производителя.
Подмножество сайтов захвата клеток были отобраны для анализа QRT-PCR, как описано в протоколе выше. В частности, фактор элонгации 1а (efl1a) 20 и глицеральдегид 3-(GAPDH) 21 анализировали в качестве генов домашнего хозяйства , как ожидается, будут выражены в каждой клетке; GATA - связывающий белок 4 (GATA4) 22 и NK2 гомеобоксный 5 (Nkx2.5) , как ранние сердечные маркеры предшественников; ISL LIM гомеобоксный 1 коробка 1 (Isl1) в качестве второго поля сердца маркера 23,24; и легкой цепи миозина (myl7) и желудочковой тяжелой цепи миозина (vmhc) 25 , чтобы отметить желудочковых кардиомиоцитов. Гено-специфические зонды были проверены с использованием кДНК из 48 эмбрионов HPF (рисунок 3). QRT-ПЦР использовали для оценки относительного экспрессии генов этих генов в 45 отдельных клеток от 18 HPF эмбрионов, отрицательный контроль не-шаблон, и объединенный популяции положительных containi контролянг кДНК из всех 96 участков захвата. Значения Сырое CT для 40 репрезентативных клеток и органов управления, приведены в таблице 1. Следует отметить, что из пула 46 клеток исследованных 6 клеток были исключены из анализа, так как все значения КТ экспрессии генов превышена CT = 35,0, и неизвестно, являются ли эти высокой КТ значения могут быть отнесены к истинным, очень низким уровнем экспрессии или деградации образца. Поскольку диапазон значений CT для гена домашнего хозяйства, ef1a, был слишком широким , чтобы сравнить экспрессию генов между образцами, и многие значения CT превысили 30, значения CT визуализировали как тепловой карте (рисунок 3). Сравнение по образцам, наблюдалось существенное гетерогенность экспрессии генов, и клетки классифицировали клетки как тип 1-5 на основе паттерна экспрессии (рисунок 3).
Рисунок 1. Одиночные изоляцию клеток данио
Рисунок 2. Одноразовый захвата ячейки данио Nkx2.5: ZSY
igure 3 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 53877 / 53877fig3.jpg "/>
Не Рисунок 3. Экспрессия генов анализ захвата одного данио Nkx2.5:. ZSY положительных клеток экспрессии генов QRT-PCR в положительных контролей (эмбрионов на 2 дня-после оплодотворения, объединенные кДНК из одиночных клеток), отрицательный контроль (не-шаблон ) и 40 отдельных клеток (Cell 01-40). Значения Сырое CT были закодированы на основе цвета , как это описано в ключе. Ef1a = фактор элонгации 1а, GATA4 = GATA - связывающий белок 4, Nkx2.5 = NK2 Гомеобоксный 5, myl7 = легкой цепи миозина 7, vmhc = желудочковой тяжелой цепи миозина, GAPDH = глицеральдегид-3 фосфат и Isl1 = ISL LIM гомеобоксный 1. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Цикл Threshold (КТ) | ||||||||
| ef1a | GATA4 | nkx25 | myl7 | vmhc | GAPDH | Isl1 | ||
| эмбрион | 20.69 | 20.92 | 28.59 | 32.87 | 26.30 | 27.00 | 33.57 | |
| Бассейн | 26,4 | 22,4 | 27,7 | 27,4 | 24.5 | 29,2 | 40,0 | |
| NTC | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Тип 1 | Cell-01 | 25,1 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 |
| Cell-02 | 25.4 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Cell-03 | 26,3 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Cell-04 | 27,4 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Cell-05 | 28,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Cell-06 | 28,2 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Cell-07 | 29,3 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40+0,0 | |
| Cell-08 | 30,7 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Cell-09 | 34,3 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Тип 2 | Cell-10 | 23.5 | 28,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 26,3 | 40,0 |
| Cell-11 | 23.5 | 27,2 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Cell-12 | 23,7 | 17,9 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Cell-13 | 24,1 | 32,4 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Cell-14 | 24,9 | 27.5 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Cell-15 | 25,9 | 28,6 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Cell-16 | 26,0 | 28,1 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Cell-17 | 27,0 | 27,7 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 38,5 | 40,0 | |
| Cell-18 | 27,0 | 27,4 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Cell-19 | 27,0 | 30,2 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 38,2 | 40,0 | |
| Cell-20 | 27,0 | 28,2 | 40,0 | 40,0 | 40+0,0 | 39,2 | 40,0 | |
| Cell-21 | 27,7 | 30,3 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 38,6 | 40,0 | |
| Cell-22 | 30,4 | 26,2 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 38,3 | 40,0 | |
| Cell-23 | 31,3 | 22,4 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 39,7 | 40,0 | |
| Cell-24 | 31.5 | 28,8 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 39,5 | 40,0 | |
| Cell-25 | 33,8 | 27,4 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 37,3 | 40,0 | |
| Cell-26 | 40,0 | 27,4 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 36.6 | 40,0 | |
| Тип 3 | Cell-27 | 24,7 | 19,9 | 28,8 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 |
| Cell-28 | 24,8 | 28,4 | 26,3 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Cell-29 | 25,1 | 23.5 | 27,6 | 40,0 | 40,0 | 32,5 | 40,0 | |
| Cell-30 | 26,3 | 21,4 | 27.5 | 40,0 | 40,0 | 39,9 | 40,0 | |
| Cell-31 | 26,9 | 24,8 | 28,2 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Cell-32 | 27,0 | 22,5 | 23,8 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Cell-33 | 27,8 | 27,6 | 27.7 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Cell-34 | 28,1 | 21,9 | 26,6 | 40,0 | 40,0 | 37,7 | 40,0 | |
| Cell-35 | 29,3 | 26.5 | 28,1 | 40,0 | 40,0 | 38,3 | 40,0 | |
| Тип 4 | Cell-36 | 24,8 | 20,3 | 26,0 | 27,4 | 26,6 | 40,0 | 40,0 |
| Cell-37 | 28,7 | 22,3 | 25,9 | 28,9 | 22,9 | 38,5 | 40,0 | |
| Тип 5 | Cell-38 | 25.5 | 20,0 | 29,3 | 23,0 | 19,9 | 25,9 | 40,0 |
| Cell-39 | 25,9 | 21,8 | 28,6 | 25,1 | 21,7 | 25,7 | 40,0 | |
| Cell-40 | 28,9 | 22,0 | 27,0 | 23,0 | 21,3 | 27,6 | 40,0 | |
Таблица 1. Значения Raw CT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанный в данном способе используется выражение флуоресцентного белка под контролем специфического промотора клеточного типа, чтобы обогатить популяцию сердечных клеток-предшественников из эмбрионов данио для использования в микрожидком системе Assisted захвата одной клетки, чтобы оценить экспрессию подгруппы сердечных генов в однослойных клетки. При условии, что FACS лазерного возбуждения и излучения возможности совместимы с флуорофором (ы) выбора, этот метод может быть использован для любого флуоресцентного репортера линии. Многие данио репортер линии уже существуют, и трансгенная рыба проведения новых репортеров могут быть получены в качестве лишь 3-х месяцев. Кроме того, эта работа поток может быть приспособлен для получения кДНК из всей транскриптома для одной клетки-РНК-последовательности. Чтобы сделать это, шаги 5-7 должны быть слегка модифицирован для использования с химий оптимизированных для получения кДНК для создания библиотек, пригодных для РНК последовательности. Тем не менее, желательно, чтобы утвердить гетерогенность популяциис помощью метода, описанного здесь до поджимая секвенсорных приложений высокой пропускной способностью.
Важно отметить, что существуют некоторые ограничения описанного способа. Во-первых, использование интегрированных Микрожидкостных схемы (МФК) пластин требует специального и дорогостоящего оборудования. Тем не менее, микрофлюидальные чипы имеют существенные преимущества по сравнению с традиционными 96-луночного и 384-луночных форматов пластин для опробования отдельных клеток. Пропусканием клеток и реагентов через микронных масштабах полос движения, отдельные клетки расположены в отдельных местах захвата, где они могут быть непосредственно наблюдаемыми, чтобы подтвердить, что они являются отдельные клетки в хорошем здоровье. Выделение РНК и синтез кДНК происходят на месте на чипе МФК с использованием очень малых объемов для каждой ячейки. Интегрированные жидкостный чипы, на момент написания этой статьи, являются коммерчески доступными только через один источник. Хотя некоммерческий изготовление было выполнено несколькими группами, оно находится за пределами возможностей большинства лабораторий. Шаги 5-7 маядолжны быть модифицированы для платформ, производимых другими компаниями или в доме измышлений. Во-вторых, хотя коммерчески доступные планшеты МФК может вместить до 96 генов, гены, выбранные ограничены наличием флуорогенными-меченых зондов генов валидированных для использования в данио. В-третьих, данио клетки, как правило, меньше, чем клетки млекопитающих, и этот маленький размер создает проблемы для обработки образцов. Небольшое изменение диаметра клеток приводит к большому изменению объема клеток, уменьшая имеющийся материал и уменьшая вероятность обнаружения низкой экспрессии генов.
Есть несколько дополнительных соображений по этому протоколу. На этапе 1 важно только эмбрионов используют оплодотворенные в течение короткого временного окна. Поддержание постоянной и без ограничения условий кислорода температуры, данио эмбрионов развиваются синхронно. Конечной считывание этого протокола (относительное экспрессии генов из одной клетки) не может различить источник heterogeneity между отдельными клетками. По этой причине, интерпретация межклеточной гетерогенности опирается на тщательно постановочные эмбрионов и синхронное развитие. На этапах 2-3, существует компромисс между диссоциации и жизнеспособности. Хотя шаг 4 выбирает для жизнеспособных клеток, и шаг 3 состоит из нескольких шагов фильтрации, которые помогают исключить мультимеры, чрезмерное пищеварения уменьшит жизнеспособного материала доступны для FACS и потенциально снизить отсортированный выхода клеток. Шаги для устранения низкой жизнеспособности включают сокращение времени пищеварения, снижение интенсивности растирания и оптимизации количества эмбрионов в исходном материале. FACS обогащение клеточной популяции интереса (этап 4), возможно, самый важный шаг в этом протоколе. Строгие критерии сортировки имеют важное значение для генерации один клеточный препарат, содержащий только живые клетки, экспрессирующие флуоресцентный белок, представляющий интерес. Заражение клеток из других популяций может привести к ложному представлению межклеточной неоднородности. Примечательно, чтоFACS-обогащение популяции интерес не ограничивается стратегией два цвета, показанного в данном протоколе. Более сложные стратегии могут производить популяции более изощренные клеток и быстрый способ расширить методологию сообщили в доказательстве принципа исследования. На шаге 5, клетки могут быть непосредственно наблюдали, чтобы подтвердить количество клеток, захваченных, здоровье клеток и экспрессию флуоресцентного белка. Но, в зависимости от размера ячейки и яркостью, флуорофор интерес не может быть визуально обнаруживаемой и не является надежным считывания. Успешное завершение этапов 6-8 требует тщательного соблюдение протоколов изготовителя.
В качестве доказательства принципа, уровни экспрессии подмножества известных кардиомаркеров были оценены в одноместном , полученный из описанного выше BAC трансгенной линии данио Nkx2.5: ZSY для изучения кардиомаркеров дифференциации в индивидуальном Nkx2.5: ZSY позитивных клеток в 18 часов после Внесение удобрений (ФВЧ). Для изучения heterogeneiти маркеров дифференцировки , выраженных в захваченном Nkx2.5: ZSY экспрессирующих клеток, набор генов анализировали в том числе генов домашнего хозяйства (ef1a, GAPDH), транскрипционные факторы , как известно, включен в начале сердечной спецификации (GATA4, Nkx2.5), A второе поле сердца прародитель маркер (Isl1), и гены , как известно, включается позже при остановке дифференцировки (myl7, vmhc). Относительное содержание каждого гена измеряли с помощью QRT-PCR путем расчета порогового цикла (CT). Минимальное значение КТ рассчитывается 17,9 и самый высокий был 40, что составляет не усиление (таблица 1). Значения КТ> 35.0 были рассмотрены ниже обнаружения.
Из 46 клеток в наборе данных, 6 были исключены из-за неудачной амплификации любых генов. Остальные клетки к югу от клетки подразделяются на 5 типов , основанных на экспрессии GATA4, Nkx2.5, myl7 и vmhc и WERе сортируются по значению ef1a внутри групп. Хотя GAPDH был первоначально включен в качестве возможного гена домашнего хозяйства, экспрессия была неодинакова клеток, что делает его непригодным в качестве гена домашнего хозяйства. GAPDH выражение , вероятно , лучше отражает изменения энергетического метаболизма , связанных с сердечной дифференциации в этом типе клеток. Интересно отметить , что была одна ячейка , в которой ef1a было обнаружено не-а другой ген был обнаружен (GATA1 в клетках 26). Это говорит о том, что в то время как ef1a , как правило , адекватной ген домашнего хозяйства , чтобы проводить различие между успешными и неуспешными одиночных клеточных реакций обратной транскрипции, оно не может быть идеальным для всех приложений. Отсутствие экспрессии ef1a в камере 26 может быть связано с одноклеточных транскрипционных динамики. Недавние одноядерные клетки исследования показывают , что транскрипция генов фундаментально стохастической, чередуя между фазами быстрого и незначительной транскрипционной активности 26. Tего транскрипционной модель разрывной предполагает, что использование гена домашнего хозяйства для количественных сравнений между отдельными клетками, может быть совершенно неуместно.
В группе Тип 1, ef1a единственный ген обнаруживается. Эти ячейки могут содержать либо Nkx2.5: ZSY отрицательных клеток или клеток с очень низкой экспрессии других генов , представляющих интерес. 2 -го типа клеток, за исключением Cell-26, выражается как ef1a и GATA4 без каких - либо корреляции в относительных уровней экспрессии этих генов. Следует отметить, что выражение Nkx2.5 в типа 1 и типа 2 -х ячеек может быть связано с неоптимальным FACS строгостью, транскрипционный лопнул, трансгенной неплотности или уровни экспрессии подпороговых. Тип 3 клетки экспрессировали детектируемые уровни ef1a, GATA4 и Nkx-2.5. Эти клетки являются вероятными клетки сердца предшественников и может включать в себя дифференцировать предсердных кардиомиоцитов. Тип 4 клетки экспрессировали детектируемых уровней ef1a, GATA4, Nkx2.5, myl7 </ EM> и vmhc и, вероятно , клетки дифференцироваться в кардиомиоциты желудочков. Тип 5 клеток выражается ef1a, GATA4, Nkx2.5, myl7, vmhc и GAPDH. Добавление детектируемых уровней GAPDH предполагает , что эти клетки обладают способностью к повышенной гликолитического метаболизма , найденного в дифференцированных кардиомиоцитов. Это было интригующим , что, несмотря на сортировку для ZsYellow положительных клеток от Tg. (Nkx2.5: ZsYellow), эмбрионов, 21/40 клетки были суб-пороговые уровни Nkx2.5 в нашем анализе QRT-PCR Это может быть связано с транскрипционной лопнувшего или может отражать различия в обработке транскриптов между эндогенной Nkx2.5 и ZsYellow. Важно отметить, что второе сердце поле маркера Isl1 не был обнаружен ни в каких клетках или кДНК объединяли от всех наших сайтов захвата. В целом, сравнивая по образцам, существенная гетерогенность была очевидна на уровне одной клетки, предполагая , что на 18 часов после оплодотворения, Nkx2.5: ZSY + челLs включают сердечные клетки-предшественники, а также потомство на разных стадиях дифференцировки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | For removing the chorion from embryos |
| Microcentrifuge tube 2 ml | GeneMate | C-3261-1 | |
| 40 um cell strainer | Biobasic | SP104151 | |
| 35 mm culture dish | Falcon | 351008 | |
| FACS tubes topped with 35 um cell strainer | Falcon | 352235 | |
| P1000 and tips | Rainin | 17005089 | |
| P20 and tips | Rainin | 17005091 | |
| IFC chip manufacturer's protocol | Fluidigm | 100-6117 | Version 100-6117 E1 was used in representative experiment |
| Wide bore pastuer glass pippette | VWR | 14673-010 | For transferring embryos |
| Adult wild type zebrafish | N/A | We used AB line | |
| Adult transgenic zebrafish | N/A | We used Tg(nkx2.5:ZsYellow) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for cell dissociation | |||
| Double distilled water | N/A | ||
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| NaCl | FisherScientific | S271-3 | make stock in water and use for de-yolking buffer |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405 | make stock in water and use for de-yolking buffer |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6014 | make stock in water and use for de-yolking buffer |
| Leibovitz's L-15 | Gibco | 21083-027 | |
| FBS | FisherScientific | 03-600-511 | Heat inactivate; any brand of FBS should be fine |
| Cell Dissociation Reagent 1 -TrypLE | Life Technologies | 12605-010 | Store at room temperature. |
| Cell Dissociation Reagent 2 - FACSmax | Genlantis | T200100 | Store -20; thaw on ice; bring to room temp before use |
| pronase (optional) | Sigma | P5147 | |
| L/D Dye - Sytox Blue | Life Technologies | S34857 | Any live/dead stain suitable for flow cytometry will work |
| Trypan Blue | Gibco | 15250-061 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for IFC plate use and qRT-PCR | |||
| Gene-specific probes | Probes will vary by experiment | ||
| TaqMan Probe ef1a | Life Technologies | Dr03432748_m1 | |
| TaqMan Probe gata4 | Life Technologies | Dr03443262_g1 | |
| TaqMan Probe nk2-5 | Life Technologies | Dr03074126_m1 | |
| TaqMan Probe myl7 | Life Technologies | Dr03105700_m1 | |
| TaqMan Probe vmhc | Life Technologies | Dr03431136_m1 | |
| TaqMan Probe isl1 | Life Technologies | Dr03425734_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Life Technologies | 4369016 | |
| Reagents listed in IFC manufacturer's protocol | |||
| C1 Reagent Kit | Fluidigm | 100-5319 | Reagents for loading cells onto IFC plate |
| Ambion Single Cell-to-CTTM | Life Technologies | 4458237 | Reagents for reverse transcription and pre-amplification steps |
| Molecular Biology Quality Water | Corning | 46-000CM | |
| C1 IFC for PreAmp (5-10 um) | Fluidigm | 100-5757 | IFC plate for small cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| C1 AutoPrep machine | Fluidigm | 100-5477 | For IFC plate use |
| Hemocytometer | Sigma Aldrich | Z359629 | For counting cells and assessing cell size |
| Dissecting microscope | For removing embryos from chorion | ||
| Tissue culture microscope | For assessing single cell digestion | ||
| FACS machine | For isolating cells of interest |
References
- Speicher, M. R. Single-cell analysis: toward the clinic. Genome medicine. 5, (2013).
- Macaulay, I. C., Voet, T. Single cell genomics: advances and future perspectives. PLoS genetics. 10, e1004126 (2014).
- Marco, E., et al. Bifurcation analysis of single-cell gene expression data reveals epigenetic landscape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 5643-5650 (2014).
- Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Current opinion in biotechnology. 23, 110-119 (2012).
- Garlanda, C., Dejana, E. Heterogeneity of endothelial cells. Specific markers. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 17, 1193-1202 (1997).
- Diaz-Cano, S. J. Tumor heterogeneity: mechanisms and bases for a reliable application of molecular marker design. International journal of molecular sciences. 13, 1951-2011 (2012).
- Guo, G., et al. Mapping cellular hierarchy by single-cell analysis of the cell surface repertoire. Cell stem cell. 13, 492-505 (2013).
- Guo, G., et al. Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst. Developmental cell. 18, 675-685 (2010).
- Treutlein, B., et al. Reconstructing lineage hierarchies of the distal lung epithelium using single-cell RNA-seq. Nature. 509, 371-375 (2014).
- Kimmel, C. B. Genetics and early development of zebrafish. Trends in genetics : TIG. 5, 283-288 (1989).
- Liu, J., Stainier, D. Y. Zebrafish in the study of early cardiac development. Circulation research. 110, 870-874 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 203, 253-310 (1995).
- Zhao, S., Fung-Leung, W. P., Bittner, A., Ngo, K., Liu, X. Comparison of RNA-Seq and microarray in transcriptome profiling of activated T cells. PloS one. 9, e78644 (2014).
- McCall, M. N., McMurray, H. R., Land, H., Almudevar, A. On non-detects in qPCR data. Bioinformatics. 30, 2310-2316 (2014).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature. 3, 1101-1108 (2008).
- Lyons, I., et al. Myogenic and morphogenetic defects in the heart tubes of murine embryos lacking the homeo box gene Nkx2-5. Genes & development. 9, 1654-1666 (1995).
- Chen, J. N., Fishman, M. C. Zebrafish tinman homolog demarcates the heart field and initiates myocardial differentiation. Development. 122, 3809-3816 (1996).
- Zhou, Y., et al. Latent TGF-beta binding protein 3 identifies a second heart field in zebrafish. Nature. 474, 645-648 (2011).
- Paffett-Lugassy, N., et al. Heart field origin of great vessel precursors relies on nkx2.5-mediated vasculogenesis. Nature cell biology. 15, 1362-1369 (2013).
- McCurley, A. T., Callard, G. V. Characterization of housekeeping genes in zebrafish: male-female differences and effects of tissue type, developmental stage and chemical treatment. BMC molecular biology. 9, 102 (2008).
- Tang, R., Dodd, A., Lai, D., McNabb, W. C., Love, D. R. Validation of zebrafish (Danio rerio) reference genes for quantitative real-time RT-PCR normalization. Acta biochimica et biophysica Sinica. 39, 384-390 (2007).
- Serbedzija, G. N., Chen, J. N., Fishman, M. C. Regulation in the heart field of zebrafish. Development. 125, 1095-1101 (1998).
- de Pater, E., et al. Distinct phases of cardiomyocyte differentiation regulate growth of the zebrafish heart. Development. 136, 1633-1641 (2009).
- Hami, D., Grimes, A. C., Tsai, H. J., Kirby, M. L. Zebrafish cardiac development requires a conserved secondary heart field. Development. 138, 2389-2398 (2011).
- Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. Y. Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish. Developmental biology. 214, 23-37 (1999).
- Molina, N., et al. Stimulus-induced modulation of transcriptional bursting in a single mammalian gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 20563-20568 (2013).
