Introduction
De flesta av dagens studier av cell- och molekylärbiologi är baserade på medelvärden befolknings. Emellertid kan viktiga biologiska händelser maskeras av dessa traditionella populationsbaserade analyser, eftersom små populationer kan spela viktiga roller i biologiska processer och sjukdomar resultatet. Förstå genuttryck i heterogena populationer vid den enda cellnivå kan (och har) leda till relevanta biologiska och kliniska insikter 1,2. Berör embryonala utvecklingsstudier, i en större population av celler, stamceller är ofta underrepresenterade, vilket gör det svårt att upptäcka subtila förändringar i genuttryck som slutligen initiativ till beslut cell öde 3. På liknande sätt kan en enda cell typ har olika expressionsprofiler som svar på mikromiljön 4. Till exempel, bosatta endotelceller i samma organ eller i olika organ (t ex., Aorta eller njure) uppvisar signifikant heterogenitet trots att dela gemensamma MORPhological och funktionella egenskaper 5. Dessutom kan cancerceller befolka samma tumör också ha varierande molekyl profiler eller mutationer vid den enda cellnivå 6.
I modellsystem har transkriptomik i enstaka celler framgångsrikt identifierat nya cellpopulationer, kännetecknad mellantillstånd som uppstår under celldifferentiering, och avslöjade differential cellulära svar på stimuli 7,8,9. Sådana insikter skulle ha maskerats i konventionella populationsbaserade studier. Zebrafisk embryon är en oerhört underutnyttjade källa stam, stamfader, och differentierande celler för att utforska frågor om en enda cell heterogenitet och molekylär reglering av cellulära identiteter under utveckling. Deras mycket stereotypa, ex vivo utveckling och enkel genetisk manipulation gör dem till en utmärkt modellsystem för detta synsätt 10,11. Närmare bestämt en stor begränsning för tolkning av en enda cell gene uttryck data är att säker identifiering av nya mellancelltillstånd under utveckling kräver mycket noggrann timing av vävnad samling 9. Detta är nödvändigt för att säkerställa att heterogenitet mellan infångade cellerna representerar heterogenitet i en vävnad vid en enda tidpunkt snarare än heterogenitet i genuttryck presenteras av åldersberoende celldifferentiering. Jämfört med möss, kan zebrafisk embryoutveckling exakt synkroniseras över ett stort antal embryon 12. Dessutom, med stora kopplingsstorlekar, zebrafisk embryon kan användas som en rik källa till stam- och stamfaderceller.
Detta protokoll beskriver en metod för att isolera celler från zebrafisk embryon och fånga enskilda celler med hjälp av en kommersiellt tillgänglig integrerad mikrofluidik krets (IFC) chip och autoprep system för QRT-PCR genexpressionsanalys. Detta protokoll kan vara snabbt överföras till någon hög genomströmning multiplexering analyser inklusive helatranskriptom sekvense som tillåter mer omfattande analys av cell heterogenitet 13. Det finns också flera fördelar för traditionella genuttryck analyser. Den enda cell isolering protokoll ger hög lönsamhet efter FACS, vilket minskar andelen komprometterade celler som ingår i program nedströms. Genom att använda en IFC, kan infångade cellerna observeras direkt för att utvärdera en avskiljningsnivå och bedöma cell hälsa morfologiskt. Dessutom är detta protokoll i stort sett tillämpas på zebrafisk forskarsamhället, som endast kräver en märkt transgen fisk linje och tillgång till mikroflödescell tekniker för avskiljning.
Som bevis på principen, var enskilda celler härledda från hjärt stamceller isoleras och fångas på ett IFC-chip, och sedan den relativa förekomsten av hjärtdifferentieringsmarkörer mättes med QRT-PCR. Genexpressionsanalys vid den enda cellnivå visar att hjärt progenitorceller samexistera med deras differentiating avkomma. Insikten från encelliga profilering av hjärt stamceller kan belysa heterogenitet i genuttryck mönster bland hjärt progenitorceller under ryggrads utveckling, som kan ha maskerats i traditionella populationsbaserade analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll kräver användning av levande, vuxna zebrafisk för att producera embryon. Embryona skördas för vävnadssamling. Det är viktigt att få godkännande från lämpliga etik prövningsnämnder för att genomföra detta experiment.
1. Skaffa Lansering i Embryon
- Dagen före experimentet, förbereda friska, vuxna zebrafisk för avel. Placera en hane och en hona på motsatta sidor av en tydlig avdelare i en avel tank.
- Upprepa 1.1 för så många avelstankar som behövs för tillräcklig embryoproduktions för nedströms ansökan. Erhålla embryon från både vildtyp fisk och transgen fisk som uttrycker fluorescerande proteiner i celltypen av intresse.
OBS: Antalet embryon som behövs för nedströms applikationer i steg 2-8 beror på den relativa förekomsten av cellerna av intresse vid tidpunkten av intresse. Även om detta kan variera beroende på celltyp, 200 embryon producera 2000-5000 sorterade celler när calnar av intresse representerar <1,0% av de totala cellerna vid 24 HPF (timmar efter befruktning). - Nästa morgon, byta vatten i panering tanken genom att överföra fisk till en ny avel tank och ta bort avdelare. Luta tanken vid en vinkel för att uppmuntra avel.
- Samla iscensatt embryon.
- Varje 15 min, samla embryon genom att överföra de vuxna till en ny avel tank och passerar äggen som är kvar genom en tesil.
OBS: zebrafisk embryon utvecklas synkront när hålls vid jämförbara densiteter och temperaturer. - Skölj äggen med ägg vatten (0,21 g / L Omedelbar Ocean salter i en L dubbel destillerat vatten) och överför till en petriskål. Överför petriskål till en fuktig inkubator vid 28,5 ° C med luftcirkulation.
- Varje 15 min, samla embryon genom att överföra de vuxna till en ny avel tank och passerar äggen som är kvar genom en tesil.
- Två timmar efter den sista samlingen, sortera befruktade, flercelliga embryon i 10 cm petriskålar och minska densiteten till 50 embryon per skål. Välj embryon från en enda, 15min tid för insamling för tillämpning nedströms. Inkubera embryon vid 28,5 ° C.
OBS: Till exempel, samla embryon vid 08:30, 08:45, 09:00, 09:15, 09:30, 09:45, 10:00 och 10:15. Jämföra över tidpunkter, om det största antalet befruktade embryon från kopplingar samlats vid 09:00, då endast använda dessa embryon för tillämpningar nedströms.
2. Ställ upp för Single Cell Dissociation
- Cirka 30 minuter före tidpunkten av intresse (18 HPF) bort embryon från deras chorion manuellt med fin pincett.
- Samla och märka följande för varje tillstånd: två 2 ml mikrocentrifugrör, en 40 ìm cell sil, en 35 mm cell odlingsskål, och två FACS rör toppad med en 35 ìm cell sil.
- Chill följande reagenser på is: ägg vatten innehållande 0,21 g / L Omedelbar Ocean alter i 1L dubbel destillerat vatten; De-yolking buffert innehållande 55 mM NaCl, 1,8 mM KCl, och 1,25 mM NaHCOs 3; och FACS-buffert innehållande Leibovitz L-15-medium kompletterat med 5% värmeinaktiverat fetalt bovint serum.
- Ta 1 ml per prov av Cell Dissociation Reagens 1 till RT. Tina en ml Cell Dissociation Reagens 2 per prov på is. Sätta till RT omedelbart före användning.
3. Single Cell Dissociation
- Med hjälp av en bred borrning glas pipett 100-300 embryon till en 2 ml mikrocentrifugröret i en minimivolym av ägg vatten.
- Avliva embryon genom att ersätta vatten med 1 ml iskall Egg vatten och sänka ned röret i is under 20 min.
VARNING! Det är viktigt att få godkännande från lämplig institutionell djurvård tillsynsutskott för dödshjälp metod (kylning på is följt av cell dissociation som sekundär dödshjälp). Standard dödshjälp kräver vanligtvis att embryon <3 dagar efter befruktningen bleks efter det att de kylda, som inte är lämpligt för att få livskraftiga celler. - Tvätta embryona två gånger med 1 ml iskall ägg vatten. Att tvätta, använda ett brett hål glaspipett för att ta bort ägg vatten och en P1000 för att lägga ägg vatten.
- Ta äggulan genom att ersätta embryot vatten med en ml Deyolking buffert och finfördelning 8-12 gånger med en P1000 spets, eller tills äggulan är upplöst och endast kroppar embryona är synliga.
- Samla vävnaden genom centrifugering vid 300 xg under 1 min. Använd en pipett för att försiktigt ta bort supernatanten utan att störa vävnad. Återsuspendera i en ml ägg vatten.
- Upprepa steg 3,5 för totalt tre tvättningar, men på den sista tvätten, återsuspendera i 1 ml RT Cell Dissociation Reagent 1.
- Inkubera i Cell Dissociation Reagens 1 under 10 min vid RT med rör placeras horisontellt. Varje 2-3 min, försiktigt mal sönder med en P1000 pipett för att förhindra klumpar.
OBS: Hantera prover försiktigt under finfördelning steg. Någon gång en enda stor klump bildas i röret från en härva av embryoorgan. Det här kommer attskingra med ytterligare nedbrytning med hjälp av mild finfördelning. INTE VORTEX. - Samla in vävnad genom centrifugering vid 300 xg under 3 min. Avlägsna supernatanten och återsuspendera i 1 ml Cell Dissociation Reagens 2.
- Inkubera i 5-15 min vid rumstemperatur. Placera rören horisontellt. Varje 2-3 min, försiktigt mal sönder för att förhindra klumpar. Varje 5 min, bedöma matsmältningen framsteg.
- För att bedöma matsmältningen framsteg, späd två il supernatant i 18 pl FACS buffert och pipett som en droppe på en cellodlingsskål.
- Placera en täck över provet och provet i en vävnadsodling mikroskop vid 10X och 20X förstoringar.
OBS: Beredningen ska visas som en blandning av enskilda celler, små kluster, stora kluster, och enstaka mestadels intakt embryo kroppen. - Visuellt bedöma den andel av beredningen som är enskilda celler och små klungor.
OBS: Över matsmältningen kommer att minska lönsamheten; under rötning minskar enda cell avkastning. </ Li>
- Samla in cellpreparatet genom centrifugering vid 300 xg under 5 min. Kassera supernatanten och återsuspendera i 1 ml kall FACS-buffert.
- Fukta en 40 ìm cell sil med FACS buffert. Passera cellsuspensionen genom 40 | im cellfilter på en 35 mm cellodlingsskål. Tvätta cellfilter en gång med 1 ml FACS-sortering buffert.
- Överföra genomströmning till ett 2 ml mikrocentrifugrör. Samla cellerna genom centrifugering vid 300 xg under 5 min och återsuspendera i 100 pl FACS-buffert.
- Räkna cell utbyte med användning av en hemocytometer. Ytterligare späda prover till 5x10 6 celler per ml, eller optimala koncentrationen rekommenderas för FACS maskin val. Valfri När räknar cell avkastningen på hemocytometer, kontrast döda celler med trypanblått för att bekräfta lönsamhet cellberedningen före FACS sortering.
OBS: Preparat som också är utspädda tar överskjutande tid att sortera. Preparat som är för concentrated tenderar att klumpa till multimerer och är suboptimal för att sortera en ren population. - Reserv 10-20% av varje prov som ska användas som ofärgade kontrollerna. För kvarvarande prover, färga döda celler genom tillsats av en fluorescerande levande / döda (L / D) diskriminering färgämne i varje provexemplar. Inte tvätta.
NOTERA: Alla fluorescerande färgämne som tränger celler med komprometterade cellmembran och fläckar nukleinsyror kan användas som L / D färgämne, förutsatt att den fluorescensspektra är kompatibel med FACS maskinen av primat och fluorofor märknings cellerna av intresse.- Tvätta inte preparatet efter tillsats av färgämnet som vissa celler kommer att dö på väg till FACS rening och bör undantas från den sorterade populationen.
- Fukta 35 ìm cell sil utjämnade FACS rör med 20 pl FACS buffert. Lägg celler till silen och samla av tyngdkraften. Förvara på is.
4. FACS Anrikning
- Använd FACS att anrika enda, Levande celler som uttrycker den fluorescerande markören.
- Ställ en grind för att särskilja celler från skräp på ett punktdiagram över framåtspridning (FSC-A) amplitud vs sidospridning amplitud (SSC-A), båda med linjär skalning.
Försiktighet! Zebrafish celler är typiskt mindre än mus eller humana celler. Detta återspeglas i en lägre basal separation mellan celler och skräp. - Från porten in i 4.1.1, satt en grind för att berika för enskilda celler och omfattar multimerer med hjälp av ett punktdiagram över framåtspridningshöjd (FSC-H) och låg sidospridning höjd (SSC-H), båda med linjär skalning.
OBS: Celler med oproportionerligt hög FSC-H och låg SSC-H är sannolikt multimerer och är undantagna från sortering. - Från porten som i 4.1.2, med hjälp av enkla färgkontroller, som en grind att endast levande celler med hjälp av en punktdiagram av FSA-A med linjär skalning och amplitud av kanalen används för att detektera L / D fläcken med log skalning. Innefattar L / D-negativa celler.
- Frångrinden som i 4.1.3, med hjälp av enstaka färgkontroller, som en grind till att omfatta endast levande celler med positiv fluorescens med hjälp av ett punktdiagram över FSA-A med linjär skalning och amplitud kanal som används för att detektera fluorescerande protein cellmarkör med log skalning . Inkludera positiva celler.
- Ställ alla kontroller ersättning, om det är nödvändigt att ta hänsyn till störningar mellan L / D fläcken och fluorescerande protein spektra.
- Ställ en grind för att särskilja celler från skräp på ett punktdiagram över framåtspridning (FSC-A) amplitud vs sidospridning amplitud (SSC-A), båda med linjär skalning.
- Ställ in sorterings logik celler som faller in alla portar som i steg 4,1.
- Använda dubbel märkta celler, kontrollera grind för cellsortering.
OBS: Celler för sortering kommer att vara celler snarare än skräp, enstaka celler snarare än multimerer, L / D-negativa och fluorescens-positiva celler.
- Använda dubbel märkta celler, kontrollera grind för cellsortering.
- Sorterings 2,000-4,000 celler från populationen av intresse i 5 | il kall FACS-buffert i ett mikrocentrifugrör på is. För att minimera skjuvning och påfrestningar på celler under sortering, använder de lägsta trycken möjligt för cellensorterare.
OBS: 5 | il droppe av FACS buffert tjänar som en kudde för celler som lämnar FACS-maskin. Samla 2,000-4,000 celler direkt in i FACS buffert eliminerar behovet av centrifugering före laddning på IFC chips. Denna strategi rekommenderas eftersom centrifugering kan leda till bildning av multimerer om celler vidhäftar till varandra i pelleten. - Utvärdera lönsamheten analys efter sort.
- Överför 1 il sorterade celler till ett färskt FACS-rör med 100 pl FACS-sortering buffert och 1: 1000 utspädning av L / D-färgning. Passera cellerna genom FACS sorterare med grindningsstrategi i steg 4,1. Använd proportionen av L / D negativ till positiv för att uppskatta livskraft sorterade celler.
5. Last celler på Microfluidics Chip
- Med användning av en hemocytometer, mäta både koncentrationen och storleken av sorterade celler.
- Späd sorterade celler till åtminstone 10 l. Späd en alikvot av 5 μ; L-celler med 5 ^ il trypanblått. Laddar in hemocytometer och tillämpa täck.
- Samla ljusa fält bilder av alla celler i 4 x 4 galler av hemocytometer. Räkna antalet levande celler och beräkna levande celler / ml. Levande celler tar inte upp trypanblått.
OBS: Använd en vanlig bildanalys programvara för att mäta diametern på alla levande celler. Beräkna den genomsnittliga och standardavvikelsen för cellstorleken, och väljer ett IFC platta lämplig för cellstorleksområde av intresse. Om cellstorlek grenslar en IFC platta cellstorlek, använda flera plattor för att fånga hela skalan av celler av intresse.
- Lastceller på att IFC Platta enligt tillverkarens instruktioner (se Material).
- Späd celler till 1x10 6 celler / ml och utför flyt optimering enligt tillverkarens anvisningar.
OBS: Buoyancy optimering säkerställer att cellerna varken sjunker till botten eller flyter upp av lastnings well för optimal laddning på IFC chip. Förhållandet av buffert till cellerna kan variera beroende på celltypen, men är vanligen inom området 6: 4 till 7: 3 av celler: buffert. - Lägg till celler till primas-IFC platta. Lastplattan till kompatibla Fluidics maskin, och kör en cellbelastning skript för att driva celler genom mikrofluidik kretsen och in fånga körfält.
- Späd celler till 1x10 6 celler / ml och utför flyt optimering enligt tillverkarens anvisningar.
- Bekräfta att celler lämnas in i fångstplatser på IFC plattan.
- Ta IFC plattan från Fluidics maskin. Montera IFC plattan på ett mikroskop utrustat med en plattadapter.
- Samla ögonblicksbilder av ljusa fält och fluorescens för varje infångningsställe vid 10x förstoring.
OBS: Bright fånga tiden kan variera från 10-50 ms, beroende på lampans intensitet. Fluorescens fånga tiden kan variera från 250-750 ms, beroende på fluoroforen ljusstyrka. Undvika överexponering celler för att förhindra fotoskada.
6. cDNA-syntes
- Utför cellys in situ enligt IFC platta tillverkarens anvisningar.
- Lägg lys buffertar till brunnarna på IFC plattan. Lastskylten på kompatibla Fluidics maskin och kör cellslys script enligt tillverkarens anvisningar.
- Utför omvänd transkription enligt IFC platta tillverkarens instruktioner.
- Lägg till omvänd transkription reagens IFC plattan. Lastskylten på kompatibla Fluidics maskin. Köra omvänd transkription skript. Provcykelbetingelser: 1 cykel vid 25 ° C under 10 min, en cykel vid 42 ° C under 1 timme, varefter en cykel vid 85 ° C under 5 min.
- Utföra pre-amplifiering med genspecifika prober enligt IFC plattan tillverkarens instruktioner.
OBS: På grund av sin större specificitet med låg kopietal, använder fluorogena-märkta sönder snarare än prober som är optimerade för användning med interkala färgämnen.- Pool primers och späd till slutlig 180 nM vardera. Lägg poolade primers till IFC plattan. Lastskylten på kompatibla fluidiserad bäddcs maskin. Kör förförstärknings skript.
- Utföra pre-amplifiering med följande cykelbetingelser: 1 cykel vid 95 ° C under 10 min, därefter 18 cykler med denaturering vid 95 ° C under 15 sek sedan hybridisering och förlängning vid 60 ° C under 4 min. Store pre-amplifierade cDNA vid 4 ° C fram till skörden. Harvest cDNA från mikroflödesPlatta enligt tillverkarens instruktioner och förvara vid -20 ° C fram till användning.
7. Välj cDNA från enstaka celler för enkel Target QRT-PCR
- Späd cDNA i 25 | il utspädnings reagens enligt tillverkarens instruktioner.
OBS: Ungefärlig slutliga utbytet är 28 pl av pre-förstärkta cDNA per cell. Reservera en alikvot av utspädningsmedel för användning som en no-template-kontroll i QRT-PCR.- Med hänvisning till ljusa fält och fluorescerande bilder som spelats in i steg 5.3.2, poäng varje infångningsplatsen. Manuellt räkna och registrera antalet celler. Bedöma och spela om varje cell är influensaorescent.
OBS: Varje enskild webbplats kan innehålla 0, 1 eller> 1 cell, där> 1 cell innefattar fångstplatser som innehåller flera celler och / eller oidentifierbara skräp. Om bilderna är tillräckligt hög kvalitet, kan ett pixelvärde också tilldelas för att kvantifiera intensiteten av fluorescenssignalen.
- Med hänvisning till ljusa fält och fluorescerande bilder som spelats in i steg 5.3.2, poäng varje infångningsplatsen. Manuellt räkna och registrera antalet celler. Bedöma och spela om varje cell är influensaorescent.
- Välj prover för QRT-PCR-analys.
- Välj cDNA prover från fångstplatser som identifierats i steg 7,2 som innehåller exakt en cell med en positiv fluorescens. Pool 1 il alikvoter av cDNA från varje prov.
OBS: Detta är "Pool" positiv kontroll används för att fastställa huruvida gener av intresse uttrycks i någon av de valda cellerna. - Välj cDNA från åtminstone en infångnings webbplats som innehåller exakt 0 celler som en negativ kontroll. Använd lösningsmedlet från steg 7.1.2 som en no-mall kontroll.
- Välj cDNA prover från fångstplatser som identifierats i steg 7,2 som innehåller exakt en cell med en positiv fluorescens. Pool 1 il alikvoter av cDNA från varje prov.
- Köra QRT-PCR-analys.
- Använd endast prober används för pre-förstärkning i steg 6.4.1. Ladda alla prover i triplicate. Cykelbetingelser för en 10 pl reaktion på en 384-brunnsplatta: 1 cykel 50 ° C 2 minuter, 1 cykel 95 ° C under 10 min, 40 cykler med denaturering vid 95 ° C 15 sek sedan hybridisering och förlängning vid 60 ° C under en min.
8. Dataanalys
- Validera QRT-PCR-produkter från standard-elektrofores. Bekräfta produkt är ett enda band vid den förväntade molekylvikt (varierar för varje sond).
OBS: Om en sond producerar flera band eller ett enda band vid en olämplig storlek, då specificitet är tveksamt, och detta utesluter genen från analys. - Undersök alla amplifieringskurvor och redogöra för eventuella avvikelser 14. Beräkna det genomsnittliga CT-värdet för varje prov / genkombinationen 15.
OBS: CT-värden för positiva kontroller sträcker sig typiskt 10-30. CT-värden för negativa kontroller sträcker sig typiskt 35-40 (ingen förstärkning). CT-värden 30-35 anses mycket låg uttryckoch bör tolkas med försiktighet 14. - Rapportdata
- Om proverna faller i CT = 10-30, kan data även rapporteras som faldig förändring i avskrift överflöd i förhållande till ett kontrollprov.
OBS: Vik förändring är lika med 2 ^ (- ΔΔCT) där ΔCT är relativt en housekeeping-gen genom att subtrahera medel CT av provet från housekeeping-genen och ΔΔCT är skillnaderna i ΔCT mellan provet och en positiv kontroll 15.
- Om proverna faller i CT = 10-30, kan data även rapporteras som faldig förändring i avskrift överflöd i förhållande till ett kontrollprov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som bevis i princip var genuttryck bedöms utforska differentieringsdynamik under hjärt utveckling. I zebrafisk, hjärt progenitorer uppstår från en mesodermal population av celler som migrerar till den anteriora lateralplattan mesoderm där de smälter samman för att bilda den linjära hjärta tub. Före fusion, hjärt stamceller börjar uttrycka transkriptionsfaktor Nkx2.5 (NK2 homeobox 5), som tros vara den tidigaste specifik markör för hjärt stamceller 16,17. Här, en tidigare beskriven BAC transgen fisk Tg (Nkx2.5: ZsYellow) 18, förkortat Nkx2.5: var ZsY används för att undersöka hjärtdifferentieringsmarkörer i enskilda celler i 18 somit scenen, 18 h efter befruktning (HPF) 12. Detta var den tidigaste tidpunkt vid vilken ZsYellow signalen var visuellt detekterbar. Som tidigare beskrivits för denna transgen linje, ZsYellow etiketter hjärt progenitorer som vill som några extra-kardiell celler som ger upphov till bågen pharyngeal endotelceller vid 28 HPF 19 (Figur 1A-B, data ej visade). Vid 18 HPF, Nkx2.5: ades ZsY embryon dissocieras till en enkelcellsuspension färgades sedan med Sytox Blue för att utesluta döda celler. Levande, ZsYellow positiv, Sytox Blue negativa celler var FACS sortering med användning av antingen en MoFloXDP eller Sony SH800Z sorterare utrustad med 100 | j, m munstycke (Figur 1C-F). För att bedöma renheten av den sorterade populationen och postsorterings viabilitet ades en alikvot av sorterade celler färgades med Sytox Blå och utvärderas procenten händelser som föll inom den ursprungliga sorteringsgrinden (Figur 1G-J).
Efter sortering cellerna ingått ett integrerat mikroflödeskrets (IFC) chip arbetsflödet (Figur 2A) enligt tillverkarens instruktioner. En hemocytometer, i kombination med trypanblått exclusion användes för att mäta celldiameter, koncentration och livsduglighet (figur 2B, och data ej visade). Cellflyt optimerades (6,5: 3,5 celler: buffert) enligt tillverkarens anvisningar, och celler laddades på en IFC att fånga celler diameter 5-10 pm. För att bedöma infångningseffektiviteten, fluorescens och / eller ljusa fältsignaler avbildades på alla fångstplatser, var en kakel funktion i Fiji för att sy en enda bild av mikrofluidik plattan. Varje fånga webbplats innehöll 0, 1 eller> 1 enskilda celler (Figur 2C-F). Som förväntat från FACS anrikning, infångade cellerna uttryckte ZsYellow (figur 2G). Infångningseffektivitet översteg 90% på 5 individuella experiment med användning Nkx2.5: ZsY sorterade celler, och åtminstone 70% av infångningsplatser ockuperades av en enda cell (data ej visade). Cellerna lyserades, RNA isolerat, cDNA som syntetiserats och specifika målgener amplifierades, allt enligt tillverkarens instruktioner.
En delmängd av cellinfångningsplatser valdes ut för QRT-PCR-analys såsom beskrivits i protokollet ovan. Specifikt förlängningsfaktor 1a (efl1a) 20 och glyceraldehyd-3-fosfat (GAPDH) 21 analyserades som hushållningsgener förväntas uttryckas i varje cell; GATA bindande protein 4 (GATA4) 22 och NK2 homeobox 5 (Nkx2.5) som tidiga hjärtgångarmarkörer; ISL LIM homeobox en låda 1 (isl1) som en andra hjärtfältmarkör 23,24; och myosin-lätt kedja (myl7) och ventrikulär myosin tung kedja (vmhc) 25 för att markera ventrikulära kardiomyocyter. Genspecifika prober validerades med cDNA från 48 HPF embryon (Figur 3). QRT-PCR användes för att bedöma relativa genuttrycket av dessa gener i 45 enskilda celler från 18 HPF embryon, en no-mall negativ kontroll, och en integrerade populations positiva kontroll containing cDNA från alla 96 fångstplatser. Raw CT-värden för 40 representativa celler och kontroller visas i Tabell 1. Särskilt från den pool av 46 celler undersöktes, var 6 celler uteslöts från analysen eftersom alla genuttryck CT-värden översteg CT = 35,0, och det är inte känt om dessa höga CT värden är hänförliga till sant, mycket låga uttrycksnivåer eller prov nedbrytning. Eftersom intervallet Ct-värdena för housekeeping-genen, ef1a, var för bred för att jämföra genuttryckning mellan prover, och många CT-värden översteg 30, hade CT-värden visualiseras som en värmekarta (figur 3). Jämföra över prover, var betydande heterogenitet i genuttryck observerades och celler klassificerades celler som typ 1-5 baserat på uttrycksmönster (Figur 3).
Figur 1. Single cell isolering av zebrafisk
Figur 2. Single cell fånga zebrafisk Nkx2.5: ZsY
igure 3 "src =" / filer / ftp_upload / 53.877 / 53877fig3.jpg "/>
Figur 3. genexpressionsanalys fångst enda zebrafisk Nkx2.5. ZsY positiva celler genuttrycket QRT-PCR i positiva kontroller (embryon vid 2 dagar-efter befruktning, poolade cDNA från enstaka celler), negativ kontroll (ingen mall ) och 40 enskilda celler (Cell 01-40). Raw CT värden färgkodade baserat som beskrivs i Key. Ef1a = förlängningsfaktor 1a, GATA4 = GATA bindande protein 4, Nkx2.5 = NK2 homeobox 5, myl7 = myosin lätta kedjan 7, vmhc = kammar myosin tung kedja, GAPDH = glyceraldehyd-3-fosfat, och isl1 = ISL LIM homeobox 1. klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Cykel Threshold (CT) | ||||||||
| ef1a | GATA4 | nkx25 | myl7 | vmhc | GAPDH | isl1 | ||
| Embryo | 20,69 | 20,92 | 28,59 | 32,87 | 26,30 | 27,00 | 33,57 | |
| Slå samman | 26,4 | 22,4 | 27,7 | 27,4 | 24,5 | 29,2 | 40,0 | |
| NTC | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| typ 1 | Cell-01 | 25,1 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 |
| Cell-02 | 25,4 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Cell-03 | 26,3 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Cell-04 | 27,4 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Cell-05 | 28,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Cell-06 | 28,2 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Cell-07 | 29,3 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 400,0 | |
| Cell-08 | 30,7 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Cell-09 | 34,3 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| typ 2 | Cell-10 | 23,5 | 28,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 26,3 | 40,0 |
| Cell-11 | 23,5 | 27,2 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Cell-12 | 23,7 | 17,9 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Cell-13 | 24,1 | 32,4 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Cell-14 | 24,9 | 27,5 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Cell-15 | 25,9 | 28,6 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Cell-16 | 26,0 | 28,1 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Cell-17 | 27,0 | 27,7 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 38,5 | 40,0 | |
| Cell-18 | 27,0 | 27,4 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Cell-19 | 27,0 | 30,2 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 38,2 | 40,0 | |
| Cell-20 | 27,0 | 28,2 | 40,0 | 40,0 | 400,0 | 39,2 | 40,0 | |
| Cell-21 | 27,7 | 30,3 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 38,6 | 40,0 | |
| Cell-22 | 30,4 | 26,2 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 38,3 | 40,0 | |
| Cell-23 | 31,3 | 22,4 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 39,7 | 40,0 | |
| Cell-24 | 31,5 | 28,8 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 39,5 | 40,0 | |
| Cell-25 | 33,8 | 27,4 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 37,3 | 40,0 | |
| Cell-26 | 40,0 | 27,4 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 36,6 | 40,0 | |
| typ 3 | Cell-27 | 24,7 | 19,9 | 28,8 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 |
| Cell-28 | 24,8 | 28,4 | 26,3 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Cell-29 | 25,1 | 23,5 | 27,6 | 40,0 | 40,0 | 32,5 | 40,0 | |
| Cell-30 | 26,3 | 21,4 | 27,5 | 40,0 | 40,0 | 39,9 | 40,0 | |
| Cell-31 | 26,9 | 24,8 | 28,2 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Cell-32 | 27,0 | 22,5 | 23,8 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Cell-33 | 27,8 | 27,6 | 27.7 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | 40,0 | |
| Cell-34 | 28,1 | 21,9 | 26,6 | 40,0 | 40,0 | 37,7 | 40,0 | |
| Cell-35 | 29,3 | 26,5 | 28,1 | 40,0 | 40,0 | 38,3 | 40,0 | |
| typ 4 | Cell-36 | 24,8 | 20,3 | 26,0 | 27,4 | 26,6 | 40,0 | 40,0 |
| Cell-37 | 28,7 | 22,3 | 25,9 | 28,9 | 22,9 | 38,5 | 40,0 | |
| Typ 5 | Cell-38 | 25,5 | 20,0 | 29,3 | 23,0 | 19,9 | 25,9 | 40,0 |
| Cell-39 | 25,9 | 21,8 | 28,6 | 25,1 | 21,7 | 25,7 | 40,0 | |
| Cell-40 | 28,9 | 22,0 | 27,0 | 23,0 | 21,3 | 27,6 | 40,0 | |
Tabell 1. Råmaterial CT-värden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metod som beskrivs häri använder uttryck av ett fluorescerande protein under kontroll av en celltypsspecifik promotor för att berika en population av hjärt progenitorceller från zebrafisk embryon för användning i mikroflödesassisterad enda cell capture system för bedömning expression av en underuppsättning av hjärt gener i singel celler. Förutsatt att FACS laser excitations- och emissionsförmåga är kompatibla med fluoroforen (er) för val, kan denna metod användas för något fluorescerande reporter linje. Många zebrafisk reporter linjer är redan existerar, och transgen fisk som bär nya reportrar kan genereras i så lite som tre månader. Dessutom kan detta arbetsflödet anpassas till att producera cDNA från hela transkriptom för enskild cell-RNA-sekvensering. För att göra detta, steg 5-7 kommer att behöva modifieras något för användning med kemiska optimerade för att förbereda cDNA för att generera bibliotek som är lämpliga för RNA-sekvensering. Det är dock tillrådligt att validera befolkning heterogenitetgenom att använda den metod som beskrivs här innan pursing hög genomströmning sekvensering applikationer.
Det är viktigt att notera att det finns vissa begränsningar den beskrivna metoden. Först, användning av integrerade mikroflödeskrets (IFC) plattor kräver specialiserad, dyr utrustning. Men mikroflödes chips erbjuder betydande fördelar jämfört med traditionella 96 brunnar och 384 brunnar format för analys enstaka celler. Genom att flöda celler och reagens genom mikrometerskala körfält, är enskilda celler placeras i enskilda infångningsplatser där de kan observeras direkt för att bekräfta att de är enskilda celler i god hälsa. RNA-extraktion och cDNA-syntes förekommer in situ på IFC chipet med användning av mycket små volymer för varje cell. Integrerade fluidic chips, vid tidpunkten för denna skrift, är kommersiellt tillgängliga genom endast en källa. Även icke-kommersiell tillverkning har utförts av flera grupper, är det utanför av kapaciteten för de flesta laboratorier. Steg 5-7 kanmåste ändras för plattformar som tillverkas av andra företag eller internt påhitt. För det andra, även om kommersiellt tillgängliga IFC plattor kan rymma upp till 96 gener, de utvalda generna begränsas av tillgången på fluorogena märkta genprober validerade för användning i zebrafisk. Tredje, zebrafisk celler är vanligtvis mindre än däggdjursceller, och denna lilla storlek innebär utmaningar att provet behandling. En liten förändring i celldiameter leder till en stor förändring i cellvolym, vilket minskar tillgängligt material och minskande sannolikheten för detektering av lågt uttryck av gener.
Det finns flera ytterligare överväganden för detta protokoll. I steg ett, är det viktigt att endast använda embryon befruktade inom en kort tid. Att hålla temperaturen konstant och utan att begränsa syreförhållanden, zebrafisk embryon utvecklas synkront. Den ultimata avläsning av detta protokoll (relativ genuttryck från enstaka celler) kan inte diskriminera källan heterogeneity mellan individuella celler. Av denna anledning tolkning av intercellulär heterogenitet bygger på noggrant iscensatt embryon och synkron utveckling. I steg 2-3, finns det en kompromiss mellan dissociation och viabilitet. Även steg 4 väljer för livsdugliga celler, och steg 3 innehåller flera filtreringssteg som hjälper utesluta multimerer, över matsmältningen kommer att minska livskraftigt material som finns tillgängligt för FACS och potentiellt minska sorterade cellutbyte. Åtgärder för att felsöka låg lönsamhet inkludera minska koktiden, minskar triturering intensitet, och optimera antalet embryon i utgångsmaterialet. FACS anrikning av cellpopulationen av intresse (steg 4) är utan tvekan den mest kritiska steget i detta protokoll. Stringenta sorteringskriterier är nödvändiga för att generera en enda cellberedning innehållande endast levande celler som uttrycker det fluorescerande proteinet av intresse. Förorena celler från andra populationer kan leda till falsk representation av intercellulär heterogenitet. I synnerhet,FACS anrikning av en population av intresse är inte begränsad till de två färgstrategi som visas i detta protokoll. Mer komplexa strategier kan producera mer förädlade cellpopulationer och är ett snabbt sätt att förlänga den metod som redovisas i proof of principle studie. I steg 5, kan celler observeras direkt för att bekräfta antalet celler infångade, cell hälsa och uttryck av fluorescerande protein. Men, beroende på cellstorlek och ljusstyrka, fluoroforen av intresse kan inte vara synliga och är inte en tillförlitlig avläsning. Framgångsrikt slutförande av steg 6-8 kräver noggrann anslutning till tillverkarens protokoll.
Som bevis på principen, var expressionsnivåer av en delmängd av kända hjärtmarkörer bedömas enda som härrör från en tidigare beskriven BAC transgen zebrafisk linje Nkx2.5: ZsY att undersöka hjärtdifferentieringsmarkörer i enskilda Nkx2.5: ZsY positiva celler vid 18 h efter fertilisering (HPF). För att utforska heterogeneity av differentieringsmarkörer uttryckta i fångade Nkx2.5: ZsY uttryckande celler, en svit av gener analyserades inklusive housekeeping-gener (ef1a, GAPDH), transkriptionsfaktorer är kända för att vara påslagen i början av hjärt specifikation (GATA4, Nkx2.5), en andra hjärt fält föregångare markör (isl1), och gener som är kända för att vara påslagen senare under hjärtdifferentiering (myl7, vmhc). Den relativa förekomsten av varje gen mättes genom QRT-PCR genom att beräkna cykel tröskel (CT). Den lägsta CT värde beräknas var 17,9 och den högsta var 40, vilket motsvarar ingen förstärkning (tabell 1). CT-värden av> 35,0 ansågs under detektions.
Av de 46 cellerna i datamängden, var 6 uteslutna på grund av misslyckade förstärkning av alla gener. De återstående cellerna underkategoriseras celler till 5 typer baserat på uttryck av GATA4, Nkx2.5, myl7 och vmhc och were sorterade efter ef1a värde inom grupper. Även GAPDH ursprungligen ingick som en möjlig housekeeping-gen, uttryck var mycket varierande över celler, vilket gör det olämpligt som en gen hushållning. GAPDH uttryck sannolikt bättre representerar förändringar i energimetabolism i samband med hjärt differentiering i denna celltyp. Intressant nog fanns en cell i vilken ef1a var un-detekterbara men en annan gen var detekterbar (gata1 i celler 26). Detta tyder på att medan ef1a är i allmänhet en lämplig housekeepinggen att skilja mellan lyckade och misslyckade encelliga omvänd transkriptionsreaktioner, kan det inte vara perfekt för alla applikationer. Bristen på ef1a uttryck i cellen 26 kan bero på encelliga transkriptions dynamik. Senaste singel-celler studier visar att gentranskription är grunden stokastisk, alternerande mellan faser av snabb och försumbar transkriptionsaktivitet 26. Thans transkriptions spricker modell tyder på att användning av en housekeepinggen för kvantitativa jämförelser mellan enskilda celler kan vara helt olämpligt.
I typ 1-gruppen, är ef1a den enda genen detekteras. Dessa cell kan innefatta antingen Nkx2.5: ZsY negativa celler eller celler med mycket lågt uttryck av andra gener av intresse. Typ 2-celler, med undantag av Cell-26, uttryckt både ef1a och GATA4 med ingen korrelation i de relativa expressionsnivåer av dessa gener. Anmärkningsvärt, kan Nkx2.5 uttryck i typ 1 och typ 2-celler bero på suboptimal FACS stringens, transkriptions spricker, transgen läckage eller sub-tröskeluttrycksnivåer. Typ 3 celler uttryckte detekterbara nivåer av ef1a, GATA4 och nkx-2,5. Dessa celler är sannolikt hjärt progenitorceller och kan inkludera differentiera förmakshjärtmuskelceller. Typ 4 celler uttryckte detekterbara nivåer av ef1a, GATA4, Nkx2.5, myl7 </ em> och vmhc och är sannolikt celler differentierande i ventrikulära kardiomyocyter. Typ 5 celler uttryckte ef1a, GATA4, Nkx2.5, myl7, vmhc och GAPDH. Tillsatsen av detekterbara nivåer av GAPDH antyder att dessa celler har kapacitet för ökad glykolytiska metabolismen hittades i differentierade cardiomyocytes. Det var spännande att trots sortering för ZsYellow positiva celler från Tg. (Nkx2.5: ZsYellow), embryon, 21/40 cellerna hade lägre värden av Nkx2.5 i vår QRT-PCR-analys Detta kan bero på transkriptions spricker eller kan återspegla skillnader i utskrift bearbetning mellan endogen Nkx2.5 och ZsYellow. Viktigare, det andra hjärtfältmarkör isl1 var odetekterbart i vilka celler som helst eller cDNA poolade från alla våra infångningsplatser. Sammanfattningsvis jämförelse mellan prover, var betydande heterogenitet uppenbar vid den enda cellnivå, vilket tyder på att vid 18 HPF, Nkx2.5: ZsY + cells innefattar hjärt stamceller samt avkomma i olika stadier av differentiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | For removing the chorion from embryos |
| Microcentrifuge tube 2 ml | GeneMate | C-3261-1 | |
| 40 um cell strainer | Biobasic | SP104151 | |
| 35 mm culture dish | Falcon | 351008 | |
| FACS tubes topped with 35 um cell strainer | Falcon | 352235 | |
| P1000 and tips | Rainin | 17005089 | |
| P20 and tips | Rainin | 17005091 | |
| IFC chip manufacturer's protocol | Fluidigm | 100-6117 | Version 100-6117 E1 was used in representative experiment |
| Wide bore pastuer glass pippette | VWR | 14673-010 | For transferring embryos |
| Adult wild type zebrafish | N/A | We used AB line | |
| Adult transgenic zebrafish | N/A | We used Tg(nkx2.5:ZsYellow) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for cell dissociation | |||
| Double distilled water | N/A | ||
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| NaCl | FisherScientific | S271-3 | make stock in water and use for de-yolking buffer |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405 | make stock in water and use for de-yolking buffer |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6014 | make stock in water and use for de-yolking buffer |
| Leibovitz's L-15 | Gibco | 21083-027 | |
| FBS | FisherScientific | 03-600-511 | Heat inactivate; any brand of FBS should be fine |
| Cell Dissociation Reagent 1 -TrypLE | Life Technologies | 12605-010 | Store at room temperature. |
| Cell Dissociation Reagent 2 - FACSmax | Genlantis | T200100 | Store -20; thaw on ice; bring to room temp before use |
| pronase (optional) | Sigma | P5147 | |
| L/D Dye - Sytox Blue | Life Technologies | S34857 | Any live/dead stain suitable for flow cytometry will work |
| Trypan Blue | Gibco | 15250-061 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for IFC plate use and qRT-PCR | |||
| Gene-specific probes | Probes will vary by experiment | ||
| TaqMan Probe ef1a | Life Technologies | Dr03432748_m1 | |
| TaqMan Probe gata4 | Life Technologies | Dr03443262_g1 | |
| TaqMan Probe nk2-5 | Life Technologies | Dr03074126_m1 | |
| TaqMan Probe myl7 | Life Technologies | Dr03105700_m1 | |
| TaqMan Probe vmhc | Life Technologies | Dr03431136_m1 | |
| TaqMan Probe isl1 | Life Technologies | Dr03425734_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Life Technologies | 4369016 | |
| Reagents listed in IFC manufacturer's protocol | |||
| C1 Reagent Kit | Fluidigm | 100-5319 | Reagents for loading cells onto IFC plate |
| Ambion Single Cell-to-CTTM | Life Technologies | 4458237 | Reagents for reverse transcription and pre-amplification steps |
| Molecular Biology Quality Water | Corning | 46-000CM | |
| C1 IFC for PreAmp (5-10 um) | Fluidigm | 100-5757 | IFC plate for small cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| C1 AutoPrep machine | Fluidigm | 100-5477 | For IFC plate use |
| Hemocytometer | Sigma Aldrich | Z359629 | For counting cells and assessing cell size |
| Dissecting microscope | For removing embryos from chorion | ||
| Tissue culture microscope | For assessing single cell digestion | ||
| FACS machine | For isolating cells of interest |
References
- Speicher, M. R. Single-cell analysis: toward the clinic. Genome medicine. 5, (2013).
- Macaulay, I. C., Voet, T. Single cell genomics: advances and future perspectives. PLoS genetics. 10, e1004126 (2014).
- Marco, E., et al. Bifurcation analysis of single-cell gene expression data reveals epigenetic landscape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 5643-5650 (2014).
- Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Current opinion in biotechnology. 23, 110-119 (2012).
- Garlanda, C., Dejana, E. Heterogeneity of endothelial cells. Specific markers. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 17, 1193-1202 (1997).
- Diaz-Cano, S. J. Tumor heterogeneity: mechanisms and bases for a reliable application of molecular marker design. International journal of molecular sciences. 13, 1951-2011 (2012).
- Guo, G., et al. Mapping cellular hierarchy by single-cell analysis of the cell surface repertoire. Cell stem cell. 13, 492-505 (2013).
- Guo, G., et al. Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst. Developmental cell. 18, 675-685 (2010).
- Treutlein, B., et al. Reconstructing lineage hierarchies of the distal lung epithelium using single-cell RNA-seq. Nature. 509, 371-375 (2014).
- Kimmel, C. B. Genetics and early development of zebrafish. Trends in genetics : TIG. 5, 283-288 (1989).
- Liu, J., Stainier, D. Y. Zebrafish in the study of early cardiac development. Circulation research. 110, 870-874 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 203, 253-310 (1995).
- Zhao, S., Fung-Leung, W. P., Bittner, A., Ngo, K., Liu, X. Comparison of RNA-Seq and microarray in transcriptome profiling of activated T cells. PloS one. 9, e78644 (2014).
- McCall, M. N., McMurray, H. R., Land, H., Almudevar, A. On non-detects in qPCR data. Bioinformatics. 30, 2310-2316 (2014).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature. 3, 1101-1108 (2008).
- Lyons, I., et al. Myogenic and morphogenetic defects in the heart tubes of murine embryos lacking the homeo box gene Nkx2-5. Genes & development. 9, 1654-1666 (1995).
- Chen, J. N., Fishman, M. C. Zebrafish tinman homolog demarcates the heart field and initiates myocardial differentiation. Development. 122, 3809-3816 (1996).
- Zhou, Y., et al. Latent TGF-beta binding protein 3 identifies a second heart field in zebrafish. Nature. 474, 645-648 (2011).
- Paffett-Lugassy, N., et al. Heart field origin of great vessel precursors relies on nkx2.5-mediated vasculogenesis. Nature cell biology. 15, 1362-1369 (2013).
- McCurley, A. T., Callard, G. V. Characterization of housekeeping genes in zebrafish: male-female differences and effects of tissue type, developmental stage and chemical treatment. BMC molecular biology. 9, 102 (2008).
- Tang, R., Dodd, A., Lai, D., McNabb, W. C., Love, D. R. Validation of zebrafish (Danio rerio) reference genes for quantitative real-time RT-PCR normalization. Acta biochimica et biophysica Sinica. 39, 384-390 (2007).
- Serbedzija, G. N., Chen, J. N., Fishman, M. C. Regulation in the heart field of zebrafish. Development. 125, 1095-1101 (1998).
- de Pater, E., et al. Distinct phases of cardiomyocyte differentiation regulate growth of the zebrafish heart. Development. 136, 1633-1641 (2009).
- Hami, D., Grimes, A. C., Tsai, H. J., Kirby, M. L. Zebrafish cardiac development requires a conserved secondary heart field. Development. 138, 2389-2398 (2011).
- Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. Y. Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish. Developmental biology. 214, 23-37 (1999).
- Molina, N., et al. Stimulus-induced modulation of transcriptional bursting in a single mammalian gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 20563-20568 (2013).
