Summary
Her beskriver vi detaljeret procedure af intestinal iskæmi-reperfusion hos mus, som resulterer i reproducerbar skade uden dødelighed at fremme standardisering af denne teknik over marken. Denne model af intestinal iskæmi-reperfusionsskade kan anvendes til at studere cellulære og molekylære mekanismer i skade og regenerering.
Abstract
Intestinal iskæmi er en livstruende tilstand forbundet med en bred vifte af kliniske tilstande, herunder atherosklerose, trombose, hypotension, nekrotiserende enterocolitis, tarm transplantation, trauma og kronisk inflammation. Intestinal iskæmi-reperfusion (IR) skade er en følge af akut mesenterisk iskæmi, skyldes utilstrækkelig blodgennemstrømning gennem mesenteriale fartøjer, hvilket resulterer i intestinal skade. Reperfusion efter iskæmi kan yderligere forværre skader af tarmen. Mekanismerne i IR skade er komplekse og dårligt forstået. Derfor eksperimentelle små dyremodeller er kritiske for forståelsen af patofysiologien af IR skade og udviklingen af nye terapier.
Her beskriver vi en musemodel for akut intestinal IR skade, der giver reproducerbar skade af tyndtarmen uden dødelighed. Dette opnås ved at inducere iskæmi i området ved den distale ileum ved tidsmæssigt occluding de perifere og terminal sikkerhedsstillelse grene af den overlegne mesenterialarterie for 60 min ved hjælp af mikrovaskulære klip. Reperfusion i 1 time, eller 2 timer efter skaden medfører reproducerbar skade af undersøgt ved histologisk analyse tarmen. Korrekt placering af mikrovaskulære klemmer er kritisk for proceduren. Derfor videoklippet giver en detaljeret visuel trin-for-trin beskrivelse af denne teknik. Denne model af intestinal IR skade kan anvendes til at studere cellulære og molekylære mekanismer i skade og regenerering.
Introduction
Tarmen er meget følsom over for afbrydelse af blodgennemstrømningen som forårsager iskæmi og epitelial beskadigelse. Reperfusion efter iskæmi giver fornyet iltning af vævet, og kan yderligere fremme patologi. Derfor er intestinal iskæmi og reperfusionsskade forbundet med en lang række af patologier, herunder nekrotiserende enterocolitis, allograftafstødning i tyndtarmstransplantation, komplikationer ved abdominal aortaaneurisme kirurgi, kardiopulmonær bypass, og inflammatorisk tarmsygdom 1,2. Intestinal IR skade, især akut mesenterisk iskæmi, er en livstruende tilstand resulterer i sygelighed og dødelighed 3.
Selvom dårligt forstået, menes intestinal iskæmi-reperfusion (IR) skade at være forbundet med ændringer i tarmen mikrobiota samt produktion af reaktive oxygenarter og inflammatoriske cytokiner og chemokiner 1,4-6. Dette fører til aktivering af bådeNate og adaptive immun mekanismer, der fremmer inflammation og vævsskade 1,7,8.
Dyremodeller er kritiske for at forstå mekanismerne i IR skade, da de tillader nem GAIN- og tab af funktion genetiske eksperimenter. Adskillige dyremodeller for IR er blevet udviklet, som omfatter komplet vaskulær okklusion, lav flow iskæmi, og segmenteret vaskulær okklusion (sammenfattet i en nylig omfattende gennemgang 9). Intestinal iskæmi forårsaget af fuldstændig vaskulær okklusion af øvre mesenteriske arterie (SMA) er en let og almindeligt anvendte model af IR i store dyr og gnavere 9-11. Men forskellige områder af tarmen har forskellige modtagelighed for skade. Desuden de mange forskellige anæstetika, analgetika, arterieokklusion teknikker, samt uoverensstemmelse i varigheden af iskæmisk beskadigelse og nyttiggørelse resultat i variable grader af skade confounding vores forståelse af biologien for IR tværs af flere studies. Tabel 1 viser disse uoverensstemmelser i murine IR undersøgelser. Den største ulempe at bruge kortere iskæmiske gange (30-45 min) er rettet mod vinduet for inddrivelse, hvorpå kan observeres mærkbare forskelle mellem sager og kontroller. Mild skade på epitel kan løses en time efter reperfusion, derfor specialiseret patologiske målinger kan være nødvendigt at finde forskelle i epitelial tilbagelevering. I modsætning hertil stor skade, som set af 100 min af iskæmisk skade kan resultere i fuldstændig denudement af epitelet, hvis tilbagegivelse ikke længere er muligt, at øge dødeligheden, og restitutionstid. Derfor her vi beskriver den detaljerede procedure af intestinal IR i mus, som resulterer i reproducerbar skade uden dødelighed at fremme standardisering af denne teknik på tværs af vores område. Denne model af intestinal IR skade kan anvendes til at studere cellulære og molekylære mekanismer i skade og regenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med National Institute of Health retningslinjer og blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg Trudeau Institute. 8-12 uger gamle C57BL / 6 mus blev anvendt til undersøgelsen.
1. Forberedelse til Kirurgi
- Forberede og sterilisere kirurgiske instrumenter.
- Forbered isofluran-baseret anæstesi-system med næsekegle og opvarmet pad. Sørg opvarmet pad er ikke overophedet (<39 ºC).
- Kontroller, at isofluran gas fjernende beholder er anbragt korrekt for at sikre udstødningsportene i bunden af beholderen ikke er blokerede eller okkluderet på nogen måde. Afvejes gas scavenging dunk før proceduren og dokumentere vægten på dåse. Kassér beholderen når beholderen vægt overstiger 50 g akkumulerede vægt (~ 12 timer).
2. Anæstesi
- Bedøver musen med 3% isofluran i en induktion kammer (1 l / minO 2).
- Vurdere bedøvelse dybde af en manglende evne til at forblive oprejst, at tab af målrettet frivillige bevægelser, tab af blink reflex, muskel afslapning, og tab af respons refleks stimulation (toe eller hale knivspids med fast tryk).
- Vurdere respirationsfrekvens og mønster ved at observere brystvæggen og abdominale bevægelser. Under optimale anæstesi, bør ånde sats være ~ 55-65 vejrtrækninger per minut.
- Fjern musen fra induktion kammeret og hurtigt barbere maven område af musen.
- For at forhindre corneal udtørring, placere kedelig oftalmologiske salve i øjnene.
- Placer musen på den opvarmede pad og tilslut den via næse kegle til anæstesi-system. Sørg latex næse kegle membran fast passer over hovedet på musen og der er ingen lækage af isofluran.
- Reducere isofluran sats til 1,5%, og injicere buprenorphin (0,1 mg / kg) og ketamin (10 mg / kg) subkutant for at forhindre afvikling af smerte-kaskaden.
- Tør the huden af operationsområdet med en steril vatpind gennemvædet med Betadine kirurgiske opløsning efterfulgt af 70% ethanol.
3. Kirurgi
- Lav en mid-line 3-5 cm laparotomi med drifts- saks. Cover drift område med steril ikke-klæbende pude fugtet med saltvand. Isoler coecum og ileum og eksponere den overlegne mesenterialarterie hjælp vatpinde fugtet i saltvand.
- For at lette klip anvende, lave små rifter i mesenterium omkring overlegne mesenterialarterie hjælp fine iris scissors.To gøre dette, forsigtigt løfte tarmen med dressing pincet og skære mesenterium på begge sider af den overlegne mesenterialarterie på det ønskede klip position (figur 1A). Derefter tilsættes nogle dråber af sterilt saltvand til området med ønskede klip position før påføring klip.
Bemærk: For at udføre fingeret kirurgi, skal du følge den kirurgiske procedure op til trin 3.2. Må ikke anvendes klip. I stedet opretholde vævet fugtig ved tilsat varm saline som beskrevet i 3.6 i 1 time. Bagefter gå videre til trin 4.1, - Okkludere den første ordre grene af den øvre mesenteriske arterie med mikrovaskulære klemmer (70 g kraft) under anvendelse af en klemmeapplikator at skabe en 5-7 cm region af den iskæmiske ileum tilstødende til cecum (figur 1B). Selvom positionen af fartøjer er konservative, kan der være små variationer mellem mus (se eksempler på figur 1). Derfor er 2 eller 3 klip normalt kræves (se en oversigt over de klip på figur 1A, D, E, sorte pile).
Bemærk: Brug af høj kvalitet fartøj klip. Højtryksrensere klip kan skade skibe og forhindre regenerering mens lavt tryk clips (<30 g), kan ikke helt blokere blodgennemstrømningen. - Blokere sikkerhed blodstrømmen gennem tarmen under anvendelse af to mikrovaskulære klemmer tværs fartøjer (40 g kraft), demarking regionen iskæmisk tarm (figur 1). Okklusion af kollaterale kar er forpligtet til atforhindre blodforsyning fra tilstødende blodkar (se en oversigt over de klip på figur 1A, D, E, grønne pile).
- Valgfrit: Tilføj heparinopløsning (6 USP enheder / ml), til forebyggelse af blodpropper. Dråbevis tilsættes 0,5 ml heparin-opløsning til den isolerede tarmen.
- Våde sterile ikke-klæbende pad sarte klude med saltvand præ-opvarmet til 37 ° C og anvendes til kirurgiske område. Sørg for, at servietter forbliver våd under hele proceduren.
- Oprethold iskæmi i 60 minutter under anvendelse af 1-1,5% isofluran anæstesi overalt. Hvis iskæmi procedure udføres korrekt, vil den iskæmiske region skifte til vinrød farve i ca. 30 min. Bemærk, at blodkar distalt for clip position er forstørret under iskæmi (figur 1, højre paneler) indikerer vellykket okklusion.
- Nøje overvåge musen under iskæmi scenen. Fortsat anvende saltvand til den ikke-klæbende pude dækker operationsstedet.
- Mærkekanterne af det iskæmiske område ved pipettering 20 pi Gill`s 3 hematoxylin på vævet for at lette høst af iskæmisk væv og tilstødende sunde væv fra den samme mus til sammenligning (figur 1E, højre panel).
4. Reperfusion Stage
- Ved slutningen af iskæmi tilføje nogle dråber saltvand på clipsen område og forsigtigt fjerne mikrovaskulære klemmer med klemmeapplikator. Derefter forsigtigt skubbe tarmen tilbage til bughulen ved hjælp saltvand fugtet bomuld tips. Fjerne ikke-adhærerende pude og lukke bugvæggen og hud under anvendelse af 9 mm rustfri sårklemmer. Hvis reperfusion udføres mere end 3 timer, skal du bruge en absorberbar Vicryl sutur for at lukke bugvæggen, før du anvender sår klip på huden.
- Oprethold mus i en opvarmet rent bur for ønskede mængde tid (30 min, 60 min, 120 min, eller 180 minutter) for reperfusion fase.
- Check dyr mindst hver 30 min til forsikre stabilitet.
- Aflive mus ved CO 2 overdosis efterfulgt af cervikal dislokation på det ønskede tidspunkt efter reperfusion.
- Åbne bughulen og indsamle det iskæmiske tarmvæv til yderligere analyse. Harvest sundt normale væv ved siden af skadede væv som en intern kontrol til grund for enhver systemisk reaktion på skade.
Note: Denne bestemmelse er mere passende end fingeret opererede kontrol mus, fordi skinopererede mus ikke undergår en systemisk reaktion på IR-induceret skade. - Skyl tarmindhold hjælp 30 ml sprøjte med påsat sondeernæring kanyle fyldt med saltvand og derefter skære tarmen på langs. Hvis en prøve af tarmen er påkrævet til genekspression analyse, skære et 1,5 mm fragment på langs, og bruge den resterende stykke til histologisk analyse.
- For histologisk analyse, udarbejde en roulade ved hjælp af en pincet til at rulle INTESTINE.
- For at opretholde den valsede form placere stykker af tarmen mellem biopsi skumpuder i væv kassetter (figur 2). Placer kassetterne i 10% pufret formalin.
- Fix væv i formalin i mindst 24 timer. Erstat formalin med 70% ethanol i yderligere 24 timer. Store væv i 70% ethanol i ubegrænset tid ved stuetemperatur.
- Integrere i paraffin, skåret 5 um snit og pletten med hematoxylin og eosin under anvendelse af en standardprotokol (figur 3).
6. Scoring
- Score det murine iskæmi-reperfusion skade som sammenfattet i tabel 2. Vælg en passende scoring metode.
- Valgfrit: Opdel synsfeltet i fire sektioner siden alvorligheden af skaden varierer i løbet af afsnittet.
- Beregn den gennemsnitlige kvalitet af hvert afsnit fra scoringer opnået blindt.
- Sammenlign kvalitet af det skadede væv mellem tilfælde og kontrol samt til the ubeskadigede væv ved anvendelse af en Kruskal-Wallis test, efterfulgt af en Dunns multiple sammenligninger test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi optimeret forsøgsprotokollen IR operation for at opnå reproducerbar IR-induceret skade af ileum hos mus. Repræsentative resultater er vist i dette afsnit.
Figur 1 viser eksempler på mikrovaskulære klemmer stand til at inducere iskæmi af ileum. Sorte pile viser placeringen af de vigtigste klip okkluderende første ordens grene af overlegen mesenterialarterie. Grønne pile viser placeringen af yderligere klip til at blokere blodforsyningen fra kollaterale kar. Bemærk øgede størrelse af okkluderede fartøjer distalt for klip position og farveændring af den iskæmiske region intestinte. Efter fjernelse af clipsene ved slutningen af iskæmi blodkar genvinde blodgennemstrømning og vende tilbage til normal størrelse.
Figur 2 viser et eksempel på et væv kassette indeholdende schweiziske ruller fremstillet fra control og iskæmiske områder af ileum efter 1 time af iskæmi, efterfulgt af 1 times reperfusion. Et stykke af milten blev inkluderet for at lette positionering af kontrol og IR tarmen under bearbejdning og farvning. Bemærk farveforskellen mellem kontrol og iskæmisk væv.
Figur 3 viser repræsentative hematoxylin og eosin-farvning af kontrol og iskæmiske områder af ileum Efter 1 time af iskæmi, eller 1 time af iskæmi efterfulgt af en 2 timers reperfusion. Bemærk de alvorlige skader af epitelet efter 1 time af iskæmi kendetegnet ved hæmoragisk villi, epitel denudement med delvis til fuldstændig ablation af krypter, og immun celleinfiltration (asterisk). Efter en 2 timers reperfusion villi beskadigelse og inflammation vedvarer (asterisk), men der er ingen væv blødning.
Figur 4 viser et eksempel på analysen af inflammatoriske cytokines ekspression efter 1 time og 2 timer efter iskæmi-reperfusion af iskæmisk og kontrol tarmen. Bemærk opregulering af mRNA-ekspression af TNF, IL-1b, IL-6 og CXCL2 efter 1 time og 2 timer efter iskæmi-reperfusion sammenlignet med kontrol sundt væv.
Figur 1: Induktion af iskæmi under anvendelse Vaskulære Clips (A) isoleret område af tarmen indeholdende cecum og ileum.. Små nedskæringer i mesenterium omgiver overlegne mesenterialarterie er lavet for at lette klip ansøgning. (B) mikrovaskulære klip program ved hjælp af klip applier. (C) Placering af mikrovaskulære klip på overlegen mesenterialarterie at fremkalde iskæmi. (D, E). Eksempler på vaskulatur struktur og klip positionering i forskellige mus. Pile viser det iskæmiske område af ileum præget af hæmatoxylin. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53881/53881fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:.. Tissue Forberedelse til Histologisk analyse Tissue kassette indeholder schweiziske ruller fremstillet af iskæmiske og kontrol regioner af ileum efter 1 time af iskæmi efterfulgt af en 1 time af reperfusion Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Hematoxylin og eosin Farvning af ileum efter iskæmi Hematoxylin og eosin-farvning af kontrol- og iskæmiske områder af ileum efter 1 time af iskæmi, eller 1 time af iskæmi.efterfulgt af en 2 timers reperfusion. Barer = 500 um (top paneler), 200 um (nederste paneler). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Ekspression af inflammatoriske cytokiner under iskæmi-reperfusion Ekspression af CXCL2, TNF, IL-6, blev IL-1b målt efter 1 time og 2 timer efter iskæmi-reperfusion af iskæmisk væv (IR) og normal kontrol væv (C). der støder op til den iskæmiske region ved real-time PCR. n = 3-8 mus pr gruppe, * p <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001. Fejl søjler repræsenterer sem Klik her for at se en større version af dette tal.
| murine Arter | Anæstesi / Analgesi | Arterieokklusion metode | iskæmitid | Time efter reperfusion | Reference | |||
| Sprague-Dawley-rotter | natriumpentobarbital | Okklusion af SMA og cøliaki arterie under anvendelse aneurisme clips eller klemme | 45 min | 2 timer | 12 | |||
| C57BL6 / 129 | 2% halothan | Okklusion af mesenterisk arteriole, og de proximale og distale dele af iskæmisk væv. | 30 til 130 minutter | 6 timer | 13 | |||
| C57BL / 6 | Ketamin, Isofluran | Okklusion af SMA hjælp aneurismeklemmer. Okklusion af sikkerhedsstillelse circulation ved den proksimale og distale områder. | 1 time | 1,5 timer | 4,8,11 | |||
| C3H / Hej | natriumpentobarbital | Okklusion hjælp aneurisme clips eller klemme | 40 min | 6 timer | 14 | |||
| C56BL / 6 | isofluran | Okklusion af SMA og ileocolic arterie hjælp aneurisme clips eller klemme | 100 min | 1, 2, 4, 24 hr | 15 | |||
| C57BL / 6 | urethane | Okklusion hjælp aneurisme clips eller klemme | 45 min | 60 min | 16 | |||
Tabel 1: Variationer i metodologi i murine Intestinal IR-induceret skade
| Histologi pointsystem | Reference | ||
| Grad 0: Normal mucosa | 13,17,18 | ||
| Grad 1: subepiteliale plads i villøs spids | |||
| Grad 2: Mere udvidet subepiteliale plads | |||
| Grad 3: Epithelial løft langs villøse sider | |||
| Grad 4: Denuded villi | |||
| Grad 5: Tab af villøs væv | |||
| Grade 6: Crypt lag infarkt | |||
| Grade 7: Transmukosal infarkt | |||
| Grade 8: Transmural infarkt | |||
| Grad 0: Normal mucosa | 4,8,11,19-21 | ||
| Grad 1: Afskalning af celler på villøse tips | |||
| Grad 3: Villi var fraværende, men krypter var stadig let påviselige | |||
| Grad 4: Komplet fravær af epitelial strukturer og transmural nekrose | |||
| Grad 0: Normal villus | 6,22-31 | ||
| Grad 1: Villi med spids forvrængning | |||
| Grad 2: Goblet celler og Gugenheims 'rum mangler | |||
| Grad 3: Villi med pletvis afbrydelse af epitelceller | |||
| Grad 4: Villi med blotlagt, men intakt lamina propria med epitelcelle sloughing | |||
| Grad 5: Lamina propria er væskende | |||
| Grade 6: Villi at display blødning eller villi, der er blottet | |||
| Grad 0: Normal histologi 32,33 | |||
| Grad 1: Let forstyrrelse af overfladen epitel | |||
| Grad 2: epitelcelle tab skade på villus tip | |||
| Grad 3: Mucosal vasokongestion, blødning, og fokal nekrose med tab på mindre end halvdelen af villi | |||
| Grad 4: Skader strækker sig til mere end halvdelen af villi | |||
Tabel 2: Histologi pointsystemer i murine Intestinal IR-induceret skade
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Udviklingen af musemodeller af tarm IR skade har forbedret forståelsen af mekanismerne i vævsbeskadigelse og hjulpet i udviklingen af potentielle terapeutiske strategier for at minimere vævsskader 7,9,11,34. De kritiske trin i denne protokol er korrekt positionering af mikrovaskulære klip, korrekt timing af iskæmi og korrekt histologisk evaluering af IR skade.
Varigheden af iskæmi er kritisk for efterfølgende epitelbeskadigelse. Den typiske tid, der kræves for at inducere reproducerbar IR skade uden sygelighed og dødelighed af eksperimentel mus er 45-60 minutter, efterfulgt af en 2-3 timers reperfusion. Længere perioder med iskæmi kan resulterer i fuldstændig tab af epitel og øget dødelighed. For eksempel i et porcint model af jejunal iskæmi, 60 min okklusion førte til delvis tab af villa epitel, hvorimod okklusion i 120 minutter førte til fuldstændigt tab af villus epithelium 35. jegmportantly kan kim-fri og genetisk manipulerede mus viser en forøget følsomhed over for IR skade, og derfor optimale tidspunkt for iskæmi og reperfusion kan være nødvendigt at være optimeret i præliminære eksperimenter. Selvom typiske tid for evaluering af vævsskade efter reperfusion er 2-3 timer, længere tid (12 timer) er nødvendig for analysen af intestinal stamcelle mobilisering 36. Derudover kan ændringer i kommensale mikrobiota og TLR / Nod-medieret signalering væsentlig indflydelse på resultatet af den IR skade 4,8,37-39.
Den korrekte placering af mikrovaskulære klip er også kritisk for reproducerbar IR skade. Her beskriver vi den model af IR skade af den murine distal ileum. Forskellige dele af tarmen er kendt for at vise forskellige følsomhed over for IR skade. For eksempel, jejunum er mere følsomme over for IR skade end ileum og colon 9,34,40. Faktisk iskæmi-reperfusion model af jejunum ved at okkludere SMA med en enkeltklip er almindeligt anvendt til at studere mekanismerne i IR skade (se ref. 9 for en omfattende gennemgang af forskellige metoder til IR-skade hos dyr). Men den nøjagtige position af klemmen og analyse af forskellige sektioner af tarmen, samt forskellige metoder til anæstesi varierer mellem disse undersøgelser, hvilket gør det vanskeligt at reproducere (se tabel 1). En yderligere komplikation ved IR skade af jejunum er høj dødelighed siden position af vaskulære clips tæt på roden af SMA påvirker blodforsyningen til brede område tarmen. Derfor, i den aktuelle undersøgelse udviklede vi en protokol til at fremkalde ensartet IR skade af terminale ileum, der er let at reproducere. For at inducere reproducerbar IR skade af ileum, den korrekte position af vaskulære clips er kritisk. Dette opnås ved at tilstoppe de perifere og sikkerhedsstillelse grene af den overlegne mesenteriske artery.The grad af IR-skade kan vurderes ved evaluering af hematoxylin og eosin dele med originale Chiu / Park eller modificerede score systemer 11,18,34,41,42. Derudover kan der gennemføres en vurdering af vævsskade under anvendelse af terminal deoxynukleotidyltransferase biotin-dUTP nick endemærkning (TUNEL) farvning af fragmenteret DNA, eller aktiv caspase-3 immunhistokemisk farvning, analyse af neutrofiler ved at måle myeloperoxidase aktivitet eller immunhistokemisk evaluering af neutrofiler ved anvendelse af Gr -1, eller Ly6G antistoffarvning 7,11. Inflammatoriske cytokiner og chemokiner, såsom IL-1b, TNF, IL-6, CXCL1, CXCL2, kan CCL2 evalueres ved real-time PCR 2,4,8. Et eksempel på analysen af inflammatoriske cytokin-ekspression er vist på figur 4.
Det er vigtigt at bemærke, at på trods af den høje reproducerbarhed og tilgængeligheden af IR skade af ileum, kan denne model ikke afspejler alle kliniske tegn på sygdom hos mennesker, i særligt kroniske tilstande og vilkår med delvis okklusion af den overlegne mesenterialarterie 9 sygdom 9,43. Derfor modeller med store dyr, såsom grise udvikles 9,44. Omhyggelig udvælgelse af dyremodellen afhængigt af den menneskelige tilstand blev undersøgt er kritisk. Sammenfattende beskriver vi en let og robust model af intestinal IR skade, som kan anvendes til at studere cellulære og molekylære mekanisme af epitelial skade og regenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af russiske Science Foundation, give no. 14-50-00060 og LLC RUSCHEMBIO. Dette arbejde blev også støttet af Crohn`s og Colitis Foundation of America giver 294.083 (til AVT), og ved NIH tilskud RO1 DK47700 (til CJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heated Pad | Sunbeam | E12107-819 | Alternative: Braintree Scientific heated pad |
| Table top research anesthesia Machine | Vasco | UCAP 0001-0000171 | Alternative: Parkland Scientific, V3000PS |
| Nose Cone | Parkland Scientific | ARES500 | |
| Scavenger canister and replacement cartridge | Parkland Scientific | 80000, 80120 | |
| Induction Chamber | Surgivet | V711802 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-10 | Controlled substance, contact IACUC |
| Animal clipper | Oster | Oster Golden A5 078005-050-003 | |
| Ophthalmic ointment | Webster | 8804604 | |
| Buprenorphine | McKesson | 562766 | Controlled substance,contact IACUC |
| Ketaset (Ketamine HCl) | Pfizer | NADA 45-290 | Controlled substance, contact IACUC |
| Cotton tips | Puritan medical products | 806-WC | Autoclave before use |
| Betadine | Purdue Products | 67618-150-17 | 10% Povidone-Iodine |
| Sterile saline solution | Aspen | 46066-807-60 | Adjust to room temperature before use |
| IR rodent thermometer | BIOSEB | BIO-IRB153 | |
| Micro vascular clips, 70 g | Roboz Surgical | RS5424, RS5435 | Alternative: WPI 14121, for SMA occlusion |
| Micro vascular clips, 40 g | Roboz Surgical | RS6472 | Alternative:WPI 14120, for collateral vessels occlusion |
| Clip applying forceps | World Precision Instruments | 14189 | Alternative: Roboz #RS-5410 or #RS-5440 |
| Gill's 3 hematoxylin | Thermo Scientific | 14-390-17 | |
| Surgical staples, Reflex 9 mm | Cell Point Scientific | 201-1000 | |
| Autoclip applier | Beckton Dickinson | 427630 | |
| Byopsy foam pad | Simport | M476-1 | |
| Tissue cassette | Fisher Healthcare | 15182701A | Histosette II combination lid and base |
| 10% buffered formalin | Fisher Scientific | 245-684 | |
| Surgical iris scissors | World Precision Instruments | 501263-G SC | Alternative: Roboz RS6816 |
| Operating scissors | World Precision Instruments | 501219-G | Alternative: Roboz RS6814 |
| Dressing forceps | Roboz Surgical | RS-5228, RS-8122 | Alternative: World Precision Instruments 1519-G |
| Heparin, endotoxin free, 300 USP units/vial, 50 mg | Sigma | 2106 | |
| Reflex wound clip removing forceps | Roboz Surgical | RS-9263 | Alternative: World Precision Instruments: 500347 |
| Mice C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | Stock No 0664 | |
| Telfa non-adherent dressings, 3 x 4, sterile | Coviden | 1050 | |
| Fisherbrand transfer pipets | Fischer Scientific | 13-711-5AM | Use pipets to dropwise add saline |
References
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nat Med. 17, 1391-1401 (2011).
- Lenaerts, K., et al. New insights in intestinal ischemia-reperfusion injury: implications for intestinal transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 18, 298-303 (2013).
- Yasuhara, H. Acute mesenteric ischemia: the challenge of gastroenterology. Surg Today. 35, 185-195 (2005).
- Perez-Chanona, E., Muhlbauer, M., Jobin, C. The microbiota protects against ischemia/reperfusion-induced intestinal injury through nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 2 (NOD2) signaling. Am J Pathol. 184, 2965-2975 (2014).
- Lee, H., et al. Delineating the relationships among the formation of reactive oxygen species, cell membrane instability and innate autoimmunity in intestinal reperfusion injury. Mol Immunol. 58, 151-159 (2014).
- Yoshiya, K., et al. Depletion of gut commensal bacteria attenuates intestinal ischemia/reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 301, G1020-G1030 (2011).
- Wu, M. C., et al. The receptor for complement component C3a mediates protection from intestinal ischemia-reperfusion injuries by inhibiting neutrophil mobilization. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 9439-9444 (2013).
- Muhlbauer, M., Perez-Chanona, E., Jobin, C. Epithelial cell-specific MyD88 signaling mediates ischemia/reperfusion-induced intestinal injury independent of microbial status. Inflamm Bowel Dis. 19, 2857-2866 (2013).
- Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: progress and promise for translational research. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308, G63-G75 (2015).
- Megison, S. M., Horton, J. W., Chao, H., Walker, P. B. A new model for intestinal ischemia in the rat. J Surg Res. 49, 168-173 (1990).
- Goldsmith, J. R., et al. Intestinal epithelial cell-derived mu-opioid signaling protects against ischemia reperfusion injury through PI3K signaling. Am J Pathol. 182, 776-785 (2013).
- Cuzzocrea, S., et al. Glycogen synthase kinase-3beta inhibition attenuates the development of ischaemia/reperfusion injury of the gut. Intensive Care Med. 33, 880-893 (2007).
- Farber, A., et al. A specific inhibitor of apoptosis decreases tissue injury after intestinal ischemia-reperfusion in mice. J Vasc Surg. 30, 752-760 (1999).
- Ben, D. F., et al. TLR4 mediates lung injury and inflammation in intestinal ischemia-reperfusion. J Surg Res. 174, 326-333 (2012).
- Watson, M. J., et al. Intestinal ischemia/reperfusion injury triggers activation of innate toll-like receptor 4 and adaptive chemokine programs. Transplant Proc. 40, 3339-3341 (2008).
- Watanabe, T., et al. Activation of the MyD88 signaling pathway inhibits ischemia-reperfusion injury in the small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303, G324-G334 (2012).
- Murayama, T., et al. JNK (c-Jun NH2 terminal kinase) and p38 during ischemia reperfusion injury in the small intestine. Transplantation. 81, 1325-1330 (2006).
- Park, P. O., Haglund, U., Bulkley, G. B., Falt, K. The sequence of development of intestinal tissue injury after strangulation ischemia and reperfusion. Surgery. 107, 574-580 (1990).
- Jilling, T., Lu, J., Jackson, M., Caplan, M. S. Intestinal epithelial apoptosis initiates gross bowel necrosis in an experimental rat model of neonatal necrotizing enterocolitis. Pediatr Res. 55, 622-629 (2004).
- Aprahamian, C. J., Lorenz, R. G., Harmon, C. M., Dimmit, R. A. Toll-like receptor 2 is protective of ischemia-reperfusion-mediated small-bowel injury in a murine model. Pediatr Crit Care Med. 9, 105-109 (2008).
- Tatum, P. M., Harmon, C. M., Lorenz, R. G., Dimmitt, R. A. Toll-like receptor 4 is protective against neonatal murine ischemia-reperfusion intestinal injury. J Pediatr Surg. 45, 1246-1255 (2010).
- Fleming, S. D., et al. Anti-phospholipid antibodies restore mesenteric ischemia/reperfusion-induced injury in complement receptor 2/complement receptor 1-deficient mice. J. Immunol. 173, 7055-7061 (2004).
- Fleming, S. D., et al. Mice deficient in complement receptors 1 and 2 lack a tissue injury-inducing subset of the natural antibody repertoire. J. Immunol. 169, 2126-2133 (2002).
- Lapchak, P. H., et al. Platelets orchestrate remote tissue damage after mesenteric ischemia-reperfusion. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, G888-G897 (2012).
- Rehrig, S., et al. Complement inhibitor, complement receptor 1-related gene/protein y-Ig attenuates intestinal damage after the onset of mesenteric ischemia/reperfusion injury in mice. J. Immunol. 167, 5921-5927 (2001).
- Hoffman, S. M., Wang, H., Pope, M. R., Fleming, S. D. Helicobacter infection alters MyD88 and Trif signalling in response to intestinal ischaemia-reperfusion. Exp Physiol. 96, 104-113 (2011).
- Moses, T., Wagner, L., Fleming, S. D. TLR4-mediated Cox-2 expression increases intestinal ischemia/reperfusion-induced damage. J Leukoc Biol. 86, 971-980 (2009).
- Feinman, R., et al. HIF-1 mediates pathogenic inflammatory responses to intestinal ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 299, G833-G843 (2010).
- Lapchak, P. H., et al. The role of platelet factor 4 in local and remote tissue damage in a mouse model of mesenteric ischemia/reperfusion injury. PloS one. 7, e39934 (2012).
- Wen, S. H., et al. Ischemic postconditioning during reperfusion attenuates intestinal injury and mucosal cell apoptosis by inhibiting JAK/STAT signaling activation. Shock. 38, 411-419 (2012).
- Wang, F., et al. Temporal variations of the ileal microbiota in intestinal ischemia and reperfusion. Shock. 39, 96-103 (2013).
- Zou, L., Attuwaybi, B., Kone, B. C. Effects of NF-kappa B inhibition on mesenteric ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 284, G713-G721 (2003).
- Hassoun, H. T., et al. Alpha-melanocyte-stimulating hormone protects against mesenteric ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 282, G1059-G1068 (2002).
- Stallion, A., et al. Ischemia/reperfusion: a clinically relevant model of intestinal injury yielding systemic inflammation. J Pediatr Surg. 40, 470-477 (2005).
- Blikslager, A. T., Roberts, M. C., Rhoads, J. M., Argenzio, R. A. Is reperfusion injury an important cause of mucosal damage after porcine intestinal ischemia? Surgery. 121, 526-534 (1997).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
- Victoni, T., et al. Local and remote tissue injury upon intestinal ischemia and reperfusion depends on the TLR/MyD88 signaling pathway. Med Microbiol Immunol. 199, 35-42 (2010).
- Watanabe, T., et al. Toll-like receptor 2 mediates ischemia-reperfusion injury of the small intestine in adult mice. PloS one. 9, e110441 (2014).
- Pope, M. R., Fleming, S. D. TLR2 modulates antibodies required for intestinal ischemia/reperfusion-induced damage and inflammation. J. Immunol. 194, 1190-1198 (2015).
- Leung, F. W., Su, K. C., Passaro, E. Jr, Guth, P. H. Regional differences in gut blood flow and mucosal damage in response to ischemia and reperfusion. Am J Physiol. 263, G301-G305 (1992).
- Chiu, C. J., McArdle, A. H., Brown, R., Scott, H. J., Gurd, F. N. Intestinal mucosal lesion in low-flow states. I. A morphological, hemodynamic, and metabolic reappraisal. Arch Surg. 101, 478-483 (1970).
- Quaedackers, J. S., et al. An evaluation of methods for grading histologic injury following ischemia/reperfusion of the small bowel. Transplant Proc. 32, 1307-1310 (2000).
- Bianciardi, P., Scorza, R., Ghilardi, G., Samaja, M. Xanthine oxido-reductase activity in ischemic human and rat intestine. Free Radic Res. 38, 919-925 (2004).
- Yandza, T., et al. The pig as a preclinical model for intestinal ischemia-reperfusion and transplantation studies. J Surg Res. 178, 807-819 (2012).
