Summary
Hier beschrijven we de gedetailleerde procedure van intestinale ischemie-reperfusie bij muizen waardoor reproduceerbaar letsel zonder sterfte aan de standaardisatie van deze techniek in het veld bevorderen. Dit model van intestinale ischemie-reperfusieschade kan worden gebruikt om de cellulaire en moleculaire mechanismen van schade en regeneratie te bestuderen.
Abstract
Darmischemie is een levensbedreigende aandoening geassocieerd met een breed scala aan klinische aandoeningen waaronder atherosclerose, trombose, hypotensie, necrotiserende enterocolitis, darm transplantatie, trauma en chronische ontsteking. Intestinale ischemie-reperfusie (IR) letsel het gevolg is van acute mesenterische ischemie, veroorzaakt door onvoldoende bloedstroom door de mesenterische vaten, waardoor schade aan de ingewanden. Reperfusie na ischemie kan verder verergeren beschadiging van de darm. De mechanismen van IR letsel zijn complex en slecht begrepen. Daarom experimentele kleine diermodellen zijn cruciaal voor het begrip van de pathofysiologie van IR letsel en de ontwikkeling van nieuwe therapieën.
Hier beschrijven we een muismodel van acute intestinale IR verwonding die reproduceerbaar letsel van de dunne darm verschaft zonder sterfte. Dit wordt bereikt door het induceren van ischemie in het gebied van het distale ileum door tijdelijk occludinG de perifere en terminale collaterale takken van de mesenterica superior gedurende 60 min met behulp van microvasculaire clips. Reperfusie gedurende 1 uur of 2 uur na het ongeval leidt tot reproduceerbare letsel van de darm onderzocht door histologische analyse. De juiste positie van de microvasculaire clips is van cruciaal belang voor de procedure. Dus de videoclip verschaft een nauwkeurig visueel stap-voor-stap beschrijving van deze techniek. Dit model van intestinale schade IR kan worden gebruikt om de cellulaire en moleculaire mechanismen van schade en regeneratie te bestuderen.
Introduction
De darm is zeer gevoelig voor onderbreking van de bloedtoevoer die ischemie en epitheliale schade veroorzaakt. Reperfusie na ischemie biedt opnieuw oxygenatie van het weefsel, en kan verder bevorderen pathologie. Daarom is intestinale ischemie en reperfusieletsel geassocieerd met een breed scala aan aandoeningen, zoals necrotiserende enterocolitis, allograft afstoting bij transplantatie dunne darm, complicaties van abdominale aorta aneurysma chirurgie, cardiopulmonale bypass, en ontstekingsdarmziekte 1,2. Intestinale IR blessure, in het bijzonder acute mesenteriale ischemie, is een levensbedreigende aandoening resulteert in morbiditeit en mortaliteit 3.
Hoewel slecht begrepen, is intestinale ischemie-reperfusie (IR) schade waarschijnlijk samenhangen met veranderingen in de darmflora en de productie van reactieve zuurstofdeeltjes en inflammatoire cytokines en chemokines 1,4-6. Dit leidt tot activatie van zowel innate en adaptieve immuunsysteem mechanismen die ontstekingen en weefselschade 1,7,8 te promoten.
Diermodellen zijn cruciaal voor het begrijpen van de mechanismen van IR schade mocht eenvoudig gain en loss-of-function genetische experimenten mogelijk. Verschillende diermodellen van IR ontwikkeld die volledige vasculaire occlusie, ischemie lage stroom omvatten en gesegmenteerde vasculaire occlusie (samengevat in een recente algemene beoordeling 9). Intestinale ischemie veroorzaakt door volledige vasculaire occlusie van mesenterica superior (SMA) is een eenvoudige en veel gebruikte model van IR in grote dieren en knaagdieren 9-11. Echter, verschillende gebieden van de darm verschillende gevoeligheid voor schade. Daarnaast is de brede waaier van anesthetica, analgetica, slagader occlusie technieken, evenals inconsistentie in de duur van ischemische schade en herstel leiden tot een variabele mate van letsel verwarren ons begrip van de biologie van IR over meerdere studies. Tabel 1 toont deze inconsistenties in muizen IR studies. Het grootste nadeel van het gebruik van kortere ischemische tijd (30-45 min) richt het raam van herstel waarop waarneembare verschillen tussen patiënten en controles worden waargenomen. Milde verwonding aan het epitheel kan worden opgelost uur na reperfusie derhalve gespecialiseerd pathologische metrics nodig zijn om verschillen in epitheliale restitutie vinden. Daarentegen sterke beschadiging, zoals gezien door 100 min van ischemisch letsel kan resulteren in een totale denudement van het epitheel, mocht teruggave niet meer mogelijk, waardoor het sterftecijfer en hersteltijd. Daarom hier beschrijven we de gedetailleerde procedure van intestinale IR bij muizen, wat resulteert in reproduceerbare letsel zonder sterfte aan de standaardisatie van deze techniek in ons gebied aan te moedigen. Dit model van intestinale schade IR kan worden gebruikt om de cellulaire en moleculaire mechanismen van schade en regeneratie te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Animal studies werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Institute of Health richtlijnen en werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Trudeau Institute. 8-12 weken oude C57BL / 6 muizen werden gebruikt voor de studie.
1. Voorbereiding voor Heelkunde
- Voor te bereiden en steriliseren chirurgische instrumenten.
- Bereid-isofluraan gebaseerde anesthesie-systeem met neuskegel, en verwarmde pad. Zorg ervoor dat verwarmd pad is niet oververhit (<39 ºC).
- Zorg ervoor dat de isofluraan gas wegvangende canister correct gepositioneerd is om te zorgen voor de uitlaatpoorten aan de onderkant van de bus niet geblokkeerd of afgesloten in any way. Weeg gas scavenging bus voorafgaand aan de procedure en document gewicht op de bus. Gooi bus bij bus gewicht van meer dan 50 g van de geaccumuleerde gewicht (~ 12 uur).
2. Anesthesie
- Verdoven muis met 3% isofluraan in een inductie kamer (1 l / minO 2).
- Assess narcose diepte door een onvermogen rechtop te blijven, verlies van doelgerichte vrijwillige beweging, verlies van knipperreflex, ontspanning van de spieren, en het verlies van de respons op stimulatie (teen of staart knijpen met stevige druk) reflex.
- Evalueren ademfrequentie en patroon door het observeren borstwand en buik bewegingen. Onder optimale narcose moet de adem tarief ~ 55-65 ademhalingen per minuut.
- Verwijder muis van de inductie kamer en snel scheert onderlijf van de muis.
- Om het hoornvlies uitdroging te voorkomen, plaatst u flauw oogzalf in de ogen.
- Plaats de muis op het verwarmde pad en sluit deze via neuskegel aan anesthesie-systeem. Zorg ervoor dat latex neuskegel membraan stevig over het hoofd van de muis en is er geen lekken van isofluraan.
- Verlaag isofluraan percentage op 1,5%, en injecteer buprenorfine (0,1 mg / kg) en ketamine (10 mg / kg) subcutaan aan wind-up van de pijn-cascade te voorkomen.
- veeg the huid van het operatiegebied met een steriel wattenstaafje gedrenkt chirurgische betadine oplossing gevolgd door 70% ethanol.
3. Chirurgie
- Maak een cm laparotomie mid-lijn 3-5 met de exploitatie van een schaar. Cover operatiegebied met een steriel niet-klevende pad bevochtigd met een zoutoplossing. Isoleer blindedarm en ileum en bloot de mesenterica superior met behulp van wattenstaafjes bevochtigd in een zoutoplossing.
- Om clip toepassen van te vergemakkelijken, maken kleine inkepingen in het mesenterium rond de mesenterica superior met behulp van fijne iris scissors.To dit te doen, voorzichtig verhogen van de darm met dressing pincet en snijd mesenterium aan beide zijden van de mesenterica superior op de gewenste clip positie (Figuur 1A). Voeg vervolgens enkele druppels steriele zoutoplossing om het gebied van gewenste clip positie alvorens clips.
Opmerking: Om de sham operatie uit te voeren, volg dan de chirurgische procedure tot stap 3.2. Niet clips van toepassing. In plaats daarvan, in stand houden van het weefsel vochtig door toegevoegde warme saline zoals in 3,6 gedurende 1 uur. Daarna, ga dan naar stap 4.1, - Af te sluiten van de eerste orde takken van de mesenterica superior met microvasculaire klemmen (70 g kracht) met behulp van een clip aanvrager naar een 5-7 cm regio van de ischemische ileum grenzend aan blindedarm (Figuur 1B) te creëren. Hoewel de positie van de vaten conservatief, kunnen er kleine verschillen tussen muizen (zie voorbeelden in figuur 1). Daarom worden 2 of 3 bevat meestal nodig (de locatie van de fragmenten in Figuur 1A, D, E, zwarte pijlen).
Let op: gebruik van hoge kwaliteit vat clips. Hoge druk clips kunnen schepen beschadigen en regeneratie terwijl lage druk clips (<30 g) te voorkomen mag niet volledig bloedstroom blokkeren. - Blok collaterale bloedstroom door de darm met twee microvasculaire klemmen in vaten (40 g kracht), markeren van regio ischemische darm (Figuur 1). Occlusie van collaterale vaten is nodig omvoorkomen bloedtoevoer van aangrenzende bloedvaten (de locatie van de fragmenten in Figuur 1A, D, E, groene pijlen).
- Optioneel: Voeg heparineoplossing (6 USP eenheden / ml), ter voorkoming van bloedstolling. Voeg druppelsgewijs 0,5 ml heparine oplossing van de geïsoleerde darm.
- Nat steriel niet-hechtende pad delicate doekjes zoutoplossing voorverwarmd tot 37 ° C en gelden voor chirurgische gebied. Zorg ervoor dat de doekjes tijdens de gehele procedure nat blijft.
- Handhaving van ischemie gedurende 60 min met behulp van 1-1,5% isofluraananesthesie overal. Als ischemie procedure correct is uitgevoerd, zal de ischemische regio veranderen in wijn rood van kleur in ongeveer 30 minuten. Merk op dat de bloedvaten distaal van de clip positie worden vergroot tijdens ischemie (figuur 1, rechts panelen) dat aangeeft succesvolle afsluiting.
- Nauwlettend toezien op de muis tijdens de ischemie podium. Blijven zoutoplossing gelden voor de niet-hechtende pad voor de operatie plaats.
- Markde randen van het ischemische gebied pipetteren van 20 ul Gill`s 3 hematoxyline op het weefsel te vergemakkelijken oogsten van het ischemische weefsel en aangrenzend gezond weefsel van dezelfde muizen ter vergelijking (Figuur 1E, rechter paneel).
4. reperfusie Stage
- Aan het einde van de ischemie voeg enkele druppels zoutoplossing op de clip stippellijn verwijder microvasculaire klemmen met klemaanbrenger. Dan duw de darm naar de buikholte met behulp van een zoutoplossing bevochtigd katoenen tips. Verwijder niet hechtende pad en sluit de buikwand en de huid met behulp van 9 mm RVS wond clips. Als reperfusie langer wordt uitgevoerd dan 3 uur, gebruik maken van een absorbeerbare Vicryl hechtdraad aan de buikwand te sluiten alvorens wond clips op de huid.
- Handhaven muizen in een verwarmde schone kooi voor de gewenste tijdsduur (30 min, 60 min, 120 min, 180 min en) voor de reperfusie fase.
- Raadpleeg dieren ten minste om de 30 minuten om de stabiliteit te verzekeren.
- Euthanaseren muizen door CO 2 overdosis gevolgd door cervicale dislocatie op het gewenste tijdstip na reperfusie.
- Open buikholte en laat het ischemische darmweefsel voor verdere analyse. Oogst gezond normaal weefsel grenzend aan de gewonde weefsel als een interne controle om rekening te houden voor een systemische reactie op letsel.
Noot: Deze post is meer geschikt dan de schijn-geopereerde controle muizen omdat sham bediend muizen niet een systemische reactie op IR-geïnduceerd letsel ondergaan. - Spoel de intestinale inhoud met behulp van 30 ml spuit met aangehechte maagsonde naald gevuld met een zoutoplossing en snijd de darmen in de lengte. Indien een monster darm vereist voor genexpressie analyse, snijd een 1,5 mm fragment lengte en gebruik de reststuk voor histologische analyse.
- Voor histologische analyse, bereiden een Swiss roll met behulp van een tang om de INTEST rollenine.
- Om de opgerolde vorm te handhaven, plaatst de darmeenheden tussen biopsie vullingen in weefselcassettes (figuur 2). Plaats de cassettes in 10% gebufferde formaline.
- Fix weefsel in formaline gedurende ten minste 24 uur. Vervang formaline met 70% ethanol voor nog eens 24 uur. WINKEL weefsel in 70% ethanol voor onbepaalde tijd bij kamertemperatuur.
- Inbedden in paraffine, gesneden 5 um secties en kleuring met hematoxyline en eosine onder toepassing van een standaardprotocol (figuur 3).
6. Scoring
- Ril de muizen ischemie-reperfusieschade zoals samengevat in Tabel 2. Kies een geschikte scoremethode.
- Optioneel: Verdeel het gezichtsveld in vier secties, omdat de ernst van de verwonding varieert in de sectie.
- Bereken het gemiddelde cijfer van elke sectie van scores blindelings verkregen.
- Vergelijk de rang van de gewonde weefsel tussen de gevallen en controle, alsmede aan The ongedeerd weefsel met behulp van een Kruskal-Wallis test, gevolgd door meerdere vergelijkingen-test een Dunn's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We geoptimaliseerde het experimentele protocol van de IR-operatie om reproduceerbare IR geïnduceerd letsel van het ileum in muizen te verkrijgen. Representatieve resultaten worden getoond in deze sectie.
Figuur 1 toont voorbeelden van microvasculaire klemmen positie ischemie van het ileum induceren. Zwarte pijlen geven positie van de belangrijkste clips het afsluiten van de eerste orde takken van mesenterica superior. Groene pijlen geven de positie van de extra clips aan bloedtoevoer van collaterale vaten te blokkeren. Opmerking toegenomen omvang van verstopte vaten distaal van de clips positie en kleurverandering van de ischemische regio intestinte. Na verwijdering van de klemmen aan het einde van ischemie bloedvaten weer bloedstroom en de normale grootte.
Figuur 2 toont een voorbeeld van een weefsel cassette die Swiss roll bereid uit conbestrijding en ischemische gebieden van het ileum na 1 uur van ischemie, gevolgd door een 1 uur reperfusie. Een stuk milt werd opgenomen om plaatsing van controle en IR darm tijdens verwerking en kleuring vergemakkelijken. Let op het kleurverschil tussen controle en ischemisch weefsel.
Figuur 3 toont representatieve hematoxyline en eosine kleuring van controle en ischemische gebieden van het ileum na 1 uur van ischemie, of 1 uur van ischemie, gevolgd door 2 uur reperfusie. Zie de ernstige beschadiging van het epitheel na 1 uur ischemie gekenmerkt door hemorragische villi, epitheel denudement met gedeeltelijke ablatie crypten voltooien en immuuncellen infiltratie (asterisk). Na 2 uur van reperfusie villi schade en ontsteking aanhouden (asterisk), maar er is geen weefsel bloeding.
Figuur 4 toont een voorbeeld van de analyse van inflammatoire cytokines expressie bij 1 uur en 2 uur na ischemie-reperfusie van ischemische en controle darm. Opmerking opregeling van mRNA-expressie van TNF, IL-1b, IL-6 en CXCL2 bij 1 uur en 2 uur na ischemie-reperfusie in vergelijking met gezond weefsel beheersen.
Figuur 1: Inductie van ischemie gebruik Vasculaire klemmen (A) Afgelegen van de darm met caecum en ileum.. Kleine sneetjes in het mesenterium rond de mesenterica superior worden gemaakt om clip toepassing te vergemakkelijken. (B) microvasculaire clip applicatie met behulp van klemaanbrenger. (C) Positie van microvasculaire clips op superieure mesenterica ischemie induceren. (D, E). Voorbeelden van vasculatuur structuur en clip positionering in verschillende muizen. Pijlen geven het ischemische gebied ileum gekenmerkt door hematoxyline. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53881/53881fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:.. Tissue Voorbereiding voor histologische analyse Tissue cassette die Zwitserse broodjes bereid uit ischemische en de controle regio's van de ileum na 1 uur van ischemie, gevolgd door een 1 uur reperfusie Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: hematoxyline en eosine kleuring van de ileum na ischemie hematoxyline en eosine kleuring van controle en ischemische gebieden van het ileum na 1 uur van ischemie, of 1 uur ischemie.gevolgd door 2 uur reperfusie. Bars = 500 pm (bovenste panelen), 200 urn (onderste panelen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Expressie van ontstekingscytokinen Tijdens ischemie-reperfusie Expressie van CXCL2, TNF, IL-6, IL-1b werd gemeten bij 1 uur en 2 uur na ischemie-reperfusie van ischemisch weefsel (IR) en normale controle weefsel (C). grenzend aan het ischemische gebied door real-time PCR. n = 3-8 muizen per groep, * p <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001. Error bars vertegenwoordigt sem Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| murine Species | Anesthesie / analgesie | Slagader occlusie methode | ischemie tijd | Tijd na reperfusie | Referentie | |||
| Sprague-Dawley-ratten | natriumpentobarbital | Occlusie van SMA en coeliakie slagader met behulp van aneurysma clip of klem | 45 min | 2 uur | 12 | |||
| C57Bl6 / 129 | 2% halothaan | Occlusie van mesenteriale arteriole en de proximale en distale delen van het ischemische weefsel. | 30-130 min | 6 hr | 13 | |||
| C57BL / 6 | Ketamine, Isofluraan | Occlusie van SMA met behulp van aneurysma clips. Occlusie van onderpand circulatie aan het proximale en distale gebieden. | 1 hr | 1,5 hr | 4,8,11 | |||
| C3H / Hej | natriumpentobarbital | Occlusie met behulp van aneurysma clip of klem | 40 min | 6 hr | 14 | |||
| C56BL / 6 | isofluraan | Occlusie van SMA en ileocolic slagader met behulp van aneurysma clip of klem | 100 min | 1, 2, 4, 24 hr | 15 | |||
| C57BL / 6 | urethaan | Occlusie met behulp van aneurysma clip of klem | 45 min | 60 min | 16 | |||
Tabel 1: Verschillen in methodologie in Muizen Intestinale IR-geïnduceerde Injury
| Histologie scoresysteem | Referentie | ||
| Graad 0: Normaal slijmvlies | 13,17,18 | ||
| Grade 1: Subepitheliale ruimte aan het villous tip | |||
| Grade 2: Meer uitgebreide subepitheliale ruimte | |||
| Grade 3: Epitheliale opheffen langs de zijkanten villous | |||
| Graad 4: Beroofd villi | |||
| Grade 5: Verlies van villous weefsel | |||
| Rang 6: Crypt layer infarct | |||
| Grade 7: Transmucosale infarct | |||
| Grade 8: Transmurale infarct | |||
| Graad 0: Normaal slijmvlies | 4,8,11,19-21 | ||
| Grade 1: vervelling van cellen op villous tips | |||
| Grade 3: Villi afwezig waren, maar crypten waren nog steeds gemakkelijk detecteerbaar | |||
| Graad 4: volledige afwezigheid van epitheliale structuren en transmurale necrose | |||
| Graad 0: Normaal villus | 6,22-31 | ||
| Grade 1: Villi met tip vervorming | |||
| Grade 2: Goblet cellen en Gugenheims 'ruimtes ontbreken | |||
| Graad 3: Villi met fragmentarische verstoring van de epitheelcellen | |||
| Graad 4: Villi met zichtbare, maar intact lamina propria met epitheelcellen vervelling | |||
| Grade 5: Lamina propria is uitademt | |||
| Rang 6: Villi dat beeldscherm bloeding of villi die worden beroofd | |||
| Graad 0: Normaal histologie 32,33 | |||
| Grade 1: Lichte verstoring van het oppervlak epitheel | |||
| Grade 2: Epitheliale cel verlies letsel op villus tip | |||
| Grade 3: Mucosale doorbloeding, bloedingen, en focale necrose met een verlies van minder dan de helft van de villi | |||
| Graad 4: Schade uit te breiden tot meer dan de helft van de villi | |||
Tabel 2: histologie Scoring Systems in Muizen Intestinale IR-geïnduceerde Injury
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De ontwikkeling van muizen met IR intestinale schade sterk verbeterd begrip van de mechanismen van weefselschade en geholpen bij de ontwikkeling van mogelijke therapeutische strategieën om weefselschade 7,9,11,34 minimaliseren. De kritische stappen van dit protocol zijn de juiste positionering van de microvasculaire clips, de juiste timing van de ischemie en de juiste histologische evaluatie van IR letsel.
De duur van ischemie is essentieel voor daaropvolgende beschadiging van het epitheel. De typische tijd die nodig is om reproduceerbare IR letsel veroorzaken zonder morbiditeit en mortaliteit van de experimentele muizen 45-60 minuten, gevolgd door een 2-3 uur reperfusie. Langere ischemie kan leidt tot volledig verlies van het epitheel en verhoogde mortaliteit. Bijvoorbeeld, in een varkensmodel van jejunale ischemie, 60 min occlusie geleid gedeeltelijk verlies van Villa epitheel, terwijl occlusie van 120 minuten tot het volledige verlies van villi 35 epitheel. ikmportantly kan kiemvrije en genetisch gemanipuleerde muizen een verhoogde gevoeligheid voor IR letsel, en dus optimale tijd van ischemie en reperfusie weer moet worden geoptimaliseerd in voorlopige experimenten. Hoewel typische tijd voor de evaluatie van weefselschade na reperfusie is 2-3 uur, langere tijd (12 uur) nodig voor de analyse van intestinale stamcelmobilisatie 36. Bovendien, veranderingen in commensale microbiota TLR / Nod-gemedieerde signalering kan aanzienlijke invloed op de resultaten van de IR schade 4,8,37-39.
De juiste positie van microvasculaire clips is ook van cruciaal belang voor reproduceerbare IR letsel. Hier beschrijven we het model van IR schade van het muizen distale ileum. Afzonderlijke delen van de darm is bekend dat verschillende gevoeligheid voor IR schade geven. Bijvoorbeeld, jejunum gevoeliger voor schade dan IR ileum en colon 9,34,40. In feite, ischemie-reperfusie model jejunum door occlusie SMA met éénclip wordt vaak gebruikt om de mechanismen van IR letsel te bestuderen (zie ref. 9 voor een uitgebreid overzicht van de verschillende methoden van IR-letsel bij dieren). De precieze positie van de clip en de analyse van de verschillende delen van darmen, en verschillende werkwijzen voor anesthesie varieert deze studies, waardoor het moeilijk te reproduceren (zie tabel 1). Een extra complicatie van IR letsel van jejunum is hoog sterftecijfer sinds positie van de vasculaire klem aan de wortel van SMA invloed bloedtoevoer naar brede terrein van de darm. Daarom is in deze studie hebben we een protocol om consistente IR schade terminal ileum, die gemakkelijk te reproduceren induceren. Reproduceerbare IR letsel ileum induceren, de juiste positie van vasculaire clips kritisch. Dit wordt bereikt door het afsluiten van de perifere en collaterale takken van de superieure mesenteriale artery.The mate van IR schade kan worden beoordeeld door de evaluatie van hematoxyline en eosine secties met originele Chiu / Park of gewijzigde score systemen 11,18,34,41,42. Bovendien kan beoordeling van weefselbeschadiging worden uitgevoerd met eindstandig deoxynucleotidyltransferase biotine- dUTP nick end labeling (TUNEL) kleuring van gefragmenteerd DNA of actieve caspase-3 immunohistochemische kleuring, analyse van neutrofielen door het meten van myeloperoxidase activiteit of immunohistochemische evaluatie van neutrofielen gebruik Gr -1 of Ly6G antilichaam kleuring 7,11. Inflammatoire cytokines en chemokines zoals IL-1b, TNF, IL-6, CXCL1, CXCL2 kan CCL2 worden geëvalueerd door real-time PCR 2,4,8. Een voorbeeld van de analyse van inflammatoire cytokine expressie wordt getoond op figuur 4.
Het is belangrijk op te merken dat ondanks de hoge reproduceerbaarheid en toegankelijkheid van IR schade van het ileum, kan dit model niet tijdens alle klinische tekenen van ziekte bij de mens, in het bijzonder chronische ziektetoestanden en aandoeningen met gedeeltelijke occlusie van de arteria mesenterica superior 9 9,43. Daarom modellen met grote dieren, zoals varkens ontwikkeld 9,44. Zorgvuldige selectie van het diermodel afhankelijk van de menselijke conditie bestudeerd kritisch. Samengevat beschrijven we een eenvoudige en robuuste uitvoering van intestinale IR schade die kan worden gebruikt om de cellulaire en moleculaire mechanisme van epitheliale schade en regeneratie te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Russische Science Foundation, verlenen geen. 14-50-00060 en LLC RUSCHEMBIO. Dit werk werd ook gesteund door de Crohn en Colitis Foundation of America verlenen 294.083 (naar AVT), en door het NIH-subsidie RO1 DK47700 (CJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heated Pad | Sunbeam | E12107-819 | Alternative: Braintree Scientific heated pad |
| Table top research anesthesia Machine | Vasco | UCAP 0001-0000171 | Alternative: Parkland Scientific, V3000PS |
| Nose Cone | Parkland Scientific | ARES500 | |
| Scavenger canister and replacement cartridge | Parkland Scientific | 80000, 80120 | |
| Induction Chamber | Surgivet | V711802 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-10 | Controlled substance, contact IACUC |
| Animal clipper | Oster | Oster Golden A5 078005-050-003 | |
| Ophthalmic ointment | Webster | 8804604 | |
| Buprenorphine | McKesson | 562766 | Controlled substance,contact IACUC |
| Ketaset (Ketamine HCl) | Pfizer | NADA 45-290 | Controlled substance, contact IACUC |
| Cotton tips | Puritan medical products | 806-WC | Autoclave before use |
| Betadine | Purdue Products | 67618-150-17 | 10% Povidone-Iodine |
| Sterile saline solution | Aspen | 46066-807-60 | Adjust to room temperature before use |
| IR rodent thermometer | BIOSEB | BIO-IRB153 | |
| Micro vascular clips, 70 g | Roboz Surgical | RS5424, RS5435 | Alternative: WPI 14121, for SMA occlusion |
| Micro vascular clips, 40 g | Roboz Surgical | RS6472 | Alternative:WPI 14120, for collateral vessels occlusion |
| Clip applying forceps | World Precision Instruments | 14189 | Alternative: Roboz #RS-5410 or #RS-5440 |
| Gill's 3 hematoxylin | Thermo Scientific | 14-390-17 | |
| Surgical staples, Reflex 9 mm | Cell Point Scientific | 201-1000 | |
| Autoclip applier | Beckton Dickinson | 427630 | |
| Byopsy foam pad | Simport | M476-1 | |
| Tissue cassette | Fisher Healthcare | 15182701A | Histosette II combination lid and base |
| 10% buffered formalin | Fisher Scientific | 245-684 | |
| Surgical iris scissors | World Precision Instruments | 501263-G SC | Alternative: Roboz RS6816 |
| Operating scissors | World Precision Instruments | 501219-G | Alternative: Roboz RS6814 |
| Dressing forceps | Roboz Surgical | RS-5228, RS-8122 | Alternative: World Precision Instruments 1519-G |
| Heparin, endotoxin free, 300 USP units/vial, 50 mg | Sigma | 2106 | |
| Reflex wound clip removing forceps | Roboz Surgical | RS-9263 | Alternative: World Precision Instruments: 500347 |
| Mice C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | Stock No 0664 | |
| Telfa non-adherent dressings, 3 x 4, sterile | Coviden | 1050 | |
| Fisherbrand transfer pipets | Fischer Scientific | 13-711-5AM | Use pipets to dropwise add saline |
References
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nat Med. 17, 1391-1401 (2011).
- Lenaerts, K., et al. New insights in intestinal ischemia-reperfusion injury: implications for intestinal transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 18, 298-303 (2013).
- Yasuhara, H. Acute mesenteric ischemia: the challenge of gastroenterology. Surg Today. 35, 185-195 (2005).
- Perez-Chanona, E., Muhlbauer, M., Jobin, C. The microbiota protects against ischemia/reperfusion-induced intestinal injury through nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 2 (NOD2) signaling. Am J Pathol. 184, 2965-2975 (2014).
- Lee, H., et al. Delineating the relationships among the formation of reactive oxygen species, cell membrane instability and innate autoimmunity in intestinal reperfusion injury. Mol Immunol. 58, 151-159 (2014).
- Yoshiya, K., et al. Depletion of gut commensal bacteria attenuates intestinal ischemia/reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 301, G1020-G1030 (2011).
- Wu, M. C., et al. The receptor for complement component C3a mediates protection from intestinal ischemia-reperfusion injuries by inhibiting neutrophil mobilization. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 9439-9444 (2013).
- Muhlbauer, M., Perez-Chanona, E., Jobin, C. Epithelial cell-specific MyD88 signaling mediates ischemia/reperfusion-induced intestinal injury independent of microbial status. Inflamm Bowel Dis. 19, 2857-2866 (2013).
- Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: progress and promise for translational research. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308, G63-G75 (2015).
- Megison, S. M., Horton, J. W., Chao, H., Walker, P. B. A new model for intestinal ischemia in the rat. J Surg Res. 49, 168-173 (1990).
- Goldsmith, J. R., et al. Intestinal epithelial cell-derived mu-opioid signaling protects against ischemia reperfusion injury through PI3K signaling. Am J Pathol. 182, 776-785 (2013).
- Cuzzocrea, S., et al. Glycogen synthase kinase-3beta inhibition attenuates the development of ischaemia/reperfusion injury of the gut. Intensive Care Med. 33, 880-893 (2007).
- Farber, A., et al. A specific inhibitor of apoptosis decreases tissue injury after intestinal ischemia-reperfusion in mice. J Vasc Surg. 30, 752-760 (1999).
- Ben, D. F., et al. TLR4 mediates lung injury and inflammation in intestinal ischemia-reperfusion. J Surg Res. 174, 326-333 (2012).
- Watson, M. J., et al. Intestinal ischemia/reperfusion injury triggers activation of innate toll-like receptor 4 and adaptive chemokine programs. Transplant Proc. 40, 3339-3341 (2008).
- Watanabe, T., et al. Activation of the MyD88 signaling pathway inhibits ischemia-reperfusion injury in the small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303, G324-G334 (2012).
- Murayama, T., et al. JNK (c-Jun NH2 terminal kinase) and p38 during ischemia reperfusion injury in the small intestine. Transplantation. 81, 1325-1330 (2006).
- Park, P. O., Haglund, U., Bulkley, G. B., Falt, K. The sequence of development of intestinal tissue injury after strangulation ischemia and reperfusion. Surgery. 107, 574-580 (1990).
- Jilling, T., Lu, J., Jackson, M., Caplan, M. S. Intestinal epithelial apoptosis initiates gross bowel necrosis in an experimental rat model of neonatal necrotizing enterocolitis. Pediatr Res. 55, 622-629 (2004).
- Aprahamian, C. J., Lorenz, R. G., Harmon, C. M., Dimmit, R. A. Toll-like receptor 2 is protective of ischemia-reperfusion-mediated small-bowel injury in a murine model. Pediatr Crit Care Med. 9, 105-109 (2008).
- Tatum, P. M., Harmon, C. M., Lorenz, R. G., Dimmitt, R. A. Toll-like receptor 4 is protective against neonatal murine ischemia-reperfusion intestinal injury. J Pediatr Surg. 45, 1246-1255 (2010).
- Fleming, S. D., et al. Anti-phospholipid antibodies restore mesenteric ischemia/reperfusion-induced injury in complement receptor 2/complement receptor 1-deficient mice. J. Immunol. 173, 7055-7061 (2004).
- Fleming, S. D., et al. Mice deficient in complement receptors 1 and 2 lack a tissue injury-inducing subset of the natural antibody repertoire. J. Immunol. 169, 2126-2133 (2002).
- Lapchak, P. H., et al. Platelets orchestrate remote tissue damage after mesenteric ischemia-reperfusion. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, G888-G897 (2012).
- Rehrig, S., et al. Complement inhibitor, complement receptor 1-related gene/protein y-Ig attenuates intestinal damage after the onset of mesenteric ischemia/reperfusion injury in mice. J. Immunol. 167, 5921-5927 (2001).
- Hoffman, S. M., Wang, H., Pope, M. R., Fleming, S. D. Helicobacter infection alters MyD88 and Trif signalling in response to intestinal ischaemia-reperfusion. Exp Physiol. 96, 104-113 (2011).
- Moses, T., Wagner, L., Fleming, S. D. TLR4-mediated Cox-2 expression increases intestinal ischemia/reperfusion-induced damage. J Leukoc Biol. 86, 971-980 (2009).
- Feinman, R., et al. HIF-1 mediates pathogenic inflammatory responses to intestinal ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 299, G833-G843 (2010).
- Lapchak, P. H., et al. The role of platelet factor 4 in local and remote tissue damage in a mouse model of mesenteric ischemia/reperfusion injury. PloS one. 7, e39934 (2012).
- Wen, S. H., et al. Ischemic postconditioning during reperfusion attenuates intestinal injury and mucosal cell apoptosis by inhibiting JAK/STAT signaling activation. Shock. 38, 411-419 (2012).
- Wang, F., et al. Temporal variations of the ileal microbiota in intestinal ischemia and reperfusion. Shock. 39, 96-103 (2013).
- Zou, L., Attuwaybi, B., Kone, B. C. Effects of NF-kappa B inhibition on mesenteric ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 284, G713-G721 (2003).
- Hassoun, H. T., et al. Alpha-melanocyte-stimulating hormone protects against mesenteric ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 282, G1059-G1068 (2002).
- Stallion, A., et al. Ischemia/reperfusion: a clinically relevant model of intestinal injury yielding systemic inflammation. J Pediatr Surg. 40, 470-477 (2005).
- Blikslager, A. T., Roberts, M. C., Rhoads, J. M., Argenzio, R. A. Is reperfusion injury an important cause of mucosal damage after porcine intestinal ischemia? Surgery. 121, 526-534 (1997).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
- Victoni, T., et al. Local and remote tissue injury upon intestinal ischemia and reperfusion depends on the TLR/MyD88 signaling pathway. Med Microbiol Immunol. 199, 35-42 (2010).
- Watanabe, T., et al. Toll-like receptor 2 mediates ischemia-reperfusion injury of the small intestine in adult mice. PloS one. 9, e110441 (2014).
- Pope, M. R., Fleming, S. D. TLR2 modulates antibodies required for intestinal ischemia/reperfusion-induced damage and inflammation. J. Immunol. 194, 1190-1198 (2015).
- Leung, F. W., Su, K. C., Passaro, E. Jr, Guth, P. H. Regional differences in gut blood flow and mucosal damage in response to ischemia and reperfusion. Am J Physiol. 263, G301-G305 (1992).
- Chiu, C. J., McArdle, A. H., Brown, R., Scott, H. J., Gurd, F. N. Intestinal mucosal lesion in low-flow states. I. A morphological, hemodynamic, and metabolic reappraisal. Arch Surg. 101, 478-483 (1970).
- Quaedackers, J. S., et al. An evaluation of methods for grading histologic injury following ischemia/reperfusion of the small bowel. Transplant Proc. 32, 1307-1310 (2000).
- Bianciardi, P., Scorza, R., Ghilardi, G., Samaja, M. Xanthine oxido-reductase activity in ischemic human and rat intestine. Free Radic Res. 38, 919-925 (2004).
- Yandza, T., et al. The pig as a preclinical model for intestinal ischemia-reperfusion and transplantation studies. J Surg Res. 178, 807-819 (2012).
