Summary
Hier beschreiben wir die Einzelheiten des Verfahrens der intestinalen Ischämie-Reperfusion bei Mäusen, die ohne Mortalität in reproduzierbarer Verletzungen führt die Standardisierung dieser Technik auf dem Gebiet zu fördern. Dieses Modell der intestinalen Ischämie-Reperfusions-Verletzung kann die zellulären und molekularen Mechanismen der Schädigung und Regeneration zu studieren verwendet werden.
Abstract
Intestinale Ischämie ist ein lebensbedrohlicher Zustand in Verbindung mit einem breiten Spektrum von klinischen Zuständen, einschließlich Atherosklerose, Thrombose, Blutdruckabfall, nekrotisierende Enterokolitis, Darmtransplantation, Trauma und chronische Entzündungen. Intestinale Ischämie-Reperfusions (IR) Schädigung ist eine Folge der akuten mesenterialen Ischämie, hervorgerufen durch unzureichende Durchblutung der mesenterialen Gefäße, was zu Darmschäden. Reperfusion nach Ischämie können weitere Schäden des Darms verstärken. Die Mechanismen der IR-Verletzungen sind komplex und kaum verstanden. Daher sind kleine Versuchstiermodellen kritisch für das Verständnis der Pathophysiologie der IR Verletzung und die Entwicklung neuer Therapien.
Hier beschreiben wir ein Mausmodell der akuten Darm IR Verletzung, die ohne Mortalität reproduzierbaren Verletzung des Dünndarms zur Verfügung stellt. Dies wird durch Induzieren von Ischämie in dem Bereich des distalen Ileums durch zeitliches Occludin erreichtg die peripheren und Terminalnebenzweige der A. mesenterica superior für 60 min mikrovaskulären Clips. Reperfusion für 1 Stunde oder 2 Stunden nach einer Verletzung führt zu reproduzierbaren Schädigung des Darms durch die histologische Analyse untersucht. Die richtige Position der mikrovaskulären Clips ist für das Verfahren kritisch. Daher bietet der Videoclip eine detaillierte visuelle Schritt-für-Schritt-Beschreibung dieser Technik. Dieses Modell der intestinalen IR Verletzung kann die zellulären und molekularen Mechanismen der Schädigung und Regeneration zu studieren verwendet werden.
Introduction
Der Darm ist sehr empfindlich auf Unterbrechung des Blutflusses, die Ischämie und epithelialen Schaden verursacht. Reperfusion nach Ischämie stellt Wiedersauerstoffversorgung des Gewebes und kann weiter Pathologie fördern. Daher wird intestinale Ischämie und Reperfusionsverletzung mit einer breiten Palette von Erkrankungen verbunden sind , einschließlich nekrotisierender Enterokolitis, Allograft Abstoßung in Dünndarmtransplantation, Komplikationen der Bauchaortenaneurysma Chirurgie, kardiopulmonalen Bypass und entzündlicher Darmerkrankung 1,2. Intestinale IR Verletzungen, vor allem akute Mesenterialischämie, ist ein lebensbedrohlicher Zustand , was zu Morbidität und Mortalität 3.
Obwohl wenig verstanden wird intestinale Ischämie-Reperfusions (IR) Schädigung dachte mit Veränderungen in der Darmflora verbunden zu sein , sowie die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies und inflammatorische Zytokine und Chemokine 1,4-6. Dies führt zur Aktivierung von sowohl innate und adaptive Immunmechanismen , die eine Entzündung und Gewebeschädigung 1,7,8 fördern.
Tiermodelle sind von entscheidender Bedeutung für die Mechanismen der IR Verletzungs verstehen, da sie leicht Verstärkungs- und loss-of-function genetische Experimente ermöglichen. Mehrere Tiermodelle von IR wurden die komplette Gefäßverschluss, Low - Flow - Ischämie entwickelt und segmentierten Gefäßverschluss (kürzlich in einem umfassenden Überblick zusammengefasst 9). Intestinale Ischämie verursacht durch vollständige Gefäßverschluss der Arteria mesenterica superior (SMA) ist eine einfache und häufig verwendete Modell von IR bei großen Tieren und Nagetiere 11.09. Jedoch verschiedene Bereiche des Darmes haben unterschiedliche Verletzungsanfälligkeit. Darüber hinaus Verwechselung die breite Palette von Anästhetika, Analgetika, Arterienverschluss Techniken sowie Inkonsistenz in der Dauer von ischämischen Verletzungen und Erholung führen zu variablen Grad der Verletzung unser Verständnis der Biologie des IR über mehrere studies. Tabelle 1 zeigt diese Inkonsistenzen in murine IR - Studien. Der größte Nachteil von mit kürzeren Ischämiezeiten (30-45 min) zielt auf das Fenster der Erholung, auf die erkennbaren Unterschiede zwischen Fällen und Kontrollen beobachtet werden können. Mild Schädigung des Epithels kann eine Stunde nach der Reperfusion gelöst werden, deshalb spezialisierte pathologische Metriken erforderlich sein können Unterschiede in der epithelialen Restitution zu finden. Im Gegensatz dazu, wie übermäßigen Schaden durch 100 min von ischämischer Verletzung gesehen kann in der vollständigen denudement des Epithels führen, wenn eine Rückerstattung nicht mehr möglich ist, die Rate der Sterblichkeit erhöhen und Recovery-Zeit. Deshalb beschreiben wir die Einzelheiten des Verfahrens der intestinalen IR bei Mäusen, die ohne Mortalität in reproduzierbarer Verletzungen führt die Standardisierung dieser Technik in unserem Bereich zu fördern. Dieses Modell der intestinalen IR Verletzung kann die zellulären und molekularen Mechanismen der Schädigung und Regeneration zu studieren verwendet werden.
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Protocol
Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem National Institute of Health Richtlinien durchgeführt und wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee des Trudeau Institute genehmigt. 8-12 Wochen alte C57BL / 6-Mäuse wurden für die Studie verwendet.
1. Vorbereitung für Chirurgie
- Bereiten Sie und chirurgische Instrumente zu sterilisieren.
- Bereiten Sie Isofluran-basierte Anästhesiesystem mit Nasenkegel und Heizkissen. Stellen Sie sicher, Heizkissen ist nicht überhitzt (<39 ° C).
- Stellen Sie sicher, dass das Isofluran Gasspül- Kanister richtig positioniert ist, um die Auslassöffnungen an der Unterseite des Behälters, um sicherzustellen, sind nicht in irgendeiner Weise blockiert oder verstopft. Wiegen Gasspül Kanister vor dem Verfahren und Dokumentengewicht auf Kanister. Entsorgen Kanister, wenn Kanister Gewicht 50 g akkumulierte Gewicht übersteigt (~ 12 h).
2. Anesthesia
- Anästhesieren Maus mit 3% Isofluran in einer Induktionskammer (1 L / minO 2).
- Beurteilen Sie Narkosetiefe durch die Unfähigkeit, aufrecht zu bleiben, Verlust der gezielte freiwillige Bewegung, Verlust des Lidschlussreflexes, Muskelentspannung, und der Verlust der Reaktion Stimulation (toe oder Schwanz Prise mit festem Druck) zu Reflex.
- Beurteilen Sie die Atemfrequenz und Muster von Brustwand und Bauchbewegungen zu beobachten. Unter optimalen Anästhesie sollte die Atemfrequenz ~ 55-65 Atemzüge pro Minute sein.
- Entfernen Sie die Maus aus der Induktionskammer und rasieren schnell den Bauchbereich der Maus.
- Hornhautaustrocknungs, legen fad Augensalbe in die Augen zu verhindern.
- Platzieren Sie die Maus auf dem Heizkissen und verbinden Sie es über Bugspitze an Anästhesiesystem. Achten Sie darauf, Latex Bugnase Membran passt fest über den Kopf der Maus, und es gibt kein Leck von Isofluran.
- Reduzieren Sie Isofluran Rate auf 1,5%, und injizieren Buprenorphin (0,1 mg / kg) und Ketamin (10 mg / kg) subkutan Wind-up der Schmerz-Kaskade zu verhindern.
- Wischen Sie the Haut des Operationsgebietes mit einem sterilen mit Betadine von 70% Ethanol gefolgt chirurgische Lösung getränkten Wattestäbchen.
3. Chirurgie
- Machen Sie eine Mittellinie 3-5 cm Laparotomie mit Betriebs Schere. Abdeckung Betriebsbereich mit sterilem nicht-haftenden Unterlage mit Kochsalzlösung angefeuchtet ist. Isolieren Blinddarm und Ileum und setzen die A. mesenterica superior mit Wattestäbchen in Kochsalzlösung angefeuchtet ist.
- Zur Erleichterung der Clip anwenden, machen kleine Scharten im Gekröse rund um die A. mesenterica superior mit feinen Iris scissors.To dies zu tun, vorsichtig den Darm mit Dressing Zange heben und Gekröse auf beiden Seiten der A. mesenterica superior an der gewünschten Clip Position geschnitten (Abbildung 1A). Dann fügen einige Tropfen steriler Kochsalzlösung auf den Bereich der gewünschten Clip Position vor Clips anwenden.
Hinweis: Um die Scheinoperation durchzuführen, folgen Sie dem chirurgischen Eingriff bis 3.2 zu treten. Wenden Sie keine Clips. Stattdessen halten das Gewebe feucht durch hinzugefügt warme saline wie in 3.6 für 1 Stunde beschrieben. Danach gehen 4.1 zu Schritt, - Verschließen Sie die ersten Ordnung Zweige der A. mesenterica superior mit mikrovaskulären Clips (70 g Kraft) zur Anbringung von Klammern mit einem 5-7 cm Bereich des ischämischen Ileum zu schaffen neben Blinddarms (1B). Obwohl die Position der Schiffe konservativ ist, könnte es zwischen Mäusen (siehe Beispiele auf Abbildung 1) leichte Variationen. Deshalb, 2 oder 3 Clips sind in der Regel erforderlich (siehe die Position der Clips auf 1A, D, E, schwarze Pfeile).
Hinweis: Verwenden Sie qualitativ hochwertige Behälter Clips. Hochdruck-Clips können Gefäße schädigen und zu verhindern, Regeneration während Niederdruck-Clips (<30 g) nicht vollständig Blutfluss blockieren. - Blockieren Sicherheiten Blutfluss durch den Darm mit Hilfe von zwei mikrovaskulären Clips über Gefäße (40 g Kraft), Demarkieren den Bereich des ischämischen Darms (Abbildung 1). Occlusion von Kollateralen ist erforderlich, umBlutversorgung von benachbarten Blutgefäßen verhindern (siehe die Position der Clips auf 1A, D, E, grüne Pfeile).
- Optional: Fügen Sie Heparin-Lösung (6 USP-Einheiten / ml), die Blutgerinnung zu verhindern. Tropfenweise 0,5 ml Heparin-Lösung auf den isolierten Darm hinzuzufügen.
- Nasse sterile nicht-haft Pad zarte Tücher mit Kochsalzlösung vorgewärmt auf 37 ° C und OP-Bereich gelten. Stellen Sie sicher, dass bleibt Tücher während des gesamten Verfahrens nass.
- Pflegen Ischämie für 60 min unter Verwendung von 1-1,5% Isofluran-Narkose im gesamten Gebäude. Wenn Ischämie Verfahren korrekt durchgeführt wird, wird der ischämischen Region Wein in der Farbe rot in etwa 30 Minuten ändern. Beachten Sie, dass die Blutgefäße distal der Clipposition während der Ischämie (Abbildung 1, rechts Platten) , die erfolgreiche Okklusion vergrößert.
- genau überwachen die Maus während der Ischämie-Phase. Weiterhin Kochsalzlösung in die nicht-adhärenten pad anzuwenden Abdecken der Operationsstelle.
- Kennzeichendie Ränder des ischämischen Bereich von 20 & mgr; l auf dem Gewebe Gill`s 3 Hämatoxylin Pipettieren zum Vergleich (1E, rechte Tafel) Ernten der ischämischen Gewebe und benachbarte gesunde Gewebe aus der gleichen Maus zu erleichtern.
4. Reperfusion Bühne
- Am Ende der Ischämie fügen einige Tropfen Kochsalzlösung auf der Clip und sanft mikrovaskulären Clips mit Clip-Anbringvorrichtung entfernen. Dann drücken Sie vorsichtig den Darm wieder in die Bauchhöhle Salzlösung angefeuchtete Wattestäbchen verwenden. Nicht ausreichend tragfähige Unterlage und schließen Sie die Bauchdecke und die Haut mit 9 mm Edelstahl Wundklammern. Wenn Reperfusion durchgeführt wird, die länger als 3 Stunden, eine resorbierbare Vicryl Naht verwenden, um die Bauchdecke zu schließen, bevor Wundklammern auf die Haut aufgebracht wird.
- Pflegen Mäuse in einem geheizten sauberen Käfig für die gewünschte Zeitdauer (30 min, 60 min, 120 min bzw. 180 min) für die Reperfusionsphase.
- Überprüfen Tiere mindestens alle 30 min Stabilität zu gewährleisten.
- Euthanize Mäuse durch CO 2 Überdosis gefolgt durch zervikale Dislokation zu der gewünschten Zeit nach Reperfusion.
- Öffnen Sie Bauchhöhle und sammeln das ischämische Darmgewebe zur weiteren Analyse. Ernte gesund normales Gewebe neben dem verletzten Gewebe als interne Kontrolle zu Konto für jede systemische Reaktion auf eine Verletzung.
Hinweis: Diese Kontrolle ist besser geeignet als die Scheinkontrollmäuse betrieben, weil scheinoperierten Mäusen keine systemische Reaktion auf IR-induzierte Schädigung erleiden. - Waschen Sie den Darminhalt 30 ml Spritze mit aufgesetzter Sondennadel mit Kochsalzlösung gefüllt und anschließend schneiden Sie den Darm in Längsrichtung. Wenn eine Probe des Darmes für die Genexpressionsanalyse erforderlich ist, schneiden Sie ein 1,5 mm-Fragment in Längsrichtung, und verwenden Sie das restliche Stück für die histologische Analyse.
- Für die histologische Analyse, bereiten eine Schweizer Rolle ein Paar Zangen mit dem intest rollenine.
- Zur Aufrechterhaltung der gerollter Form, legen Sie die Stücke des Darms zwischen Biopsie Schaumstoffpolster in Gewebekassetten (Abbildung 2). Legen Sie die Kassetten in 10% gepuffertem Formalin.
- Fix Gewebe in Formalin für mindestens 24 Stunden. Ersetzen Formalin mit 70% Ethanol für weitere 24 hr. Store Gewebe in 70% igem Ethanol bei Raumtemperatur unbegrenzt.
- Einbetten von in Paraffin, schneiden 5 um - Schnitte und flecken mit Hämatoxylin und Eosin ein Standardprotokoll (Abbildung 3) verwendet wird .
6. Scoring
- Ergebnis der Maus - Ischämie-Reperfusionsschaden wie in Tabelle 2 zusammengefasst. Wählen Sie eine geeignete Scoring - Methode.
- Optional: Teilen Sie das Sichtfeld in vier Abschnitte, da die Schwere der Verletzung im gesamten Abschnitt variiert.
- Berechnen Sie den durchschnittlichen Grad von jedem Abschnitt von Partituren blind erhalten.
- Vergleichen Sie die Klasse des verletzten Gewebes zwischen den Fällen und Kontrolle sowie zu the heil Gewebe einen Kruskal-Wallis-Test verwenden, gefolgt von einem mehrVergleichsTest Dunn.
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Representative Results
Wir optimieren das Versuchsprotokoll von IR-Operation reproduzierbare IR induzierte Schädigung des Ileum bei Mäusen zu erhalten. Repräsentative Ergebnisse sind in diesem Abschnitt dargestellt.
Abbildung 1 zeigt Beispiele von mikrovaskulären Clips Position Ischämie des Ileum zu induzieren. Schwarze Pfeile zeigen Position der Haupt Clips erster Ordnung Zweige der A. mesenterica superior Okkludieren. Grüne Pfeile zeigen die Position von zusätzlichen Clips Blutversorgung von Kollateralen zu blockieren. Hinweis erhöhte Größe an eingeschlossenem Gefäße distal der Clips Position und Farbänderung des ischämischen Region intestinte. Nach dem Entfernen der Clips am Ende der Ischämie Blutgefäße wieder Blutfluss und die Rückkehr zur normalen Größe.
Abbildung 2 zeigt ein Beispiel einer Gewebekassette enthält , Rouladen aus con vorbereitettrol und ischämische Regionen des Ileums nach 1 Stunde von Ischämie, durch ein 1 Stunde Reperfusion. Ein Stück Milz wurde aufgenommen während der Verarbeitung und Färbung Positionierung der Kontrolle und IR-Darm zu erleichtern. Beachten Sie die Farbdifferenz zwischen Kontrolle und ischämischem Gewebe.
Abbildung 3 zeigt repräsentative Hämatoxylin und Eosin - Färbung der Kontrolle und der ischämischen Bereiche des Ileum nach 1 Stunde von Ischämie oder 1 h durch eine 2 h Reperfusion Ischämie. Notieren Sie sich die schweren Schäden des Epithels nach 1 Stunde von Ischämie durch hämorrhagischen Zotten gekennzeichnet, Epithel denudement mit Teilablation der Krypten zu vervollständigen, und Immunzellinfiltration (Stern). Nach 2 h Reperfusion Zotten Schädigung und Entzündung persistieren (Sternchen), aber es gibt keine Gewebeblutungen.
Figur 4 zeigt ein Beispiel für die Analyse von Entzündungs cytokines Ausdruck bei 1 Stunde und 2 Stunden nach der Ischämie-Reperfusion bei ischämischen und Kontrolle Darm. Hinweis Aufregulation der mRNA-Expression von TNF, IL-1b, IL-6 und CXCL2 bei 1 h und 2 h nach der Ischämie-Reperfusion gesundes Gewebe im Vergleich zur Kontrolle.
Abbildung 1: Die Induktion von Ischemia mit Gefäßclips (A) Isolierte Bereich des Darms enthalten , Blinddarm und Ileum.. Kleine Schnitte in der Gekröse die A. mesenterica superior umgibt gemacht Clip Anwendung zu erleichtern. (B) mikrovaskuläre Clip - Anwendung mit Clip - Anbringvorrichtung. (C) Position der mikrovaskulären Clips auf A. mesenterica superior Ischämie zu induzieren. (D, E). Beispiele für Gefäßstruktur und Clip Positionierung in verschiedenen Mäusen. Die Pfeile zeigen die ischämischen Bereich von Ileum durch Hämatoxylin gekennzeichnet. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53881/53881fig1large.jpg" target = "_ blank"> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2:.. Gewebepräparation für die histologische Analyse Gewebekassette Rouladen , hergestellt aus ischämischen und Kontrollregionen des Ileum nach 1 Stunde von Ischämie durch eine 1 Stunde Reperfusion enthält Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Hämatoxylin und Eosin - Färbung von Ileum nach Ischemia Hämatoxylin und Eosin - Färbung der Kontrolle und der ischämischen Bereiche des Ileum nach 1 Stunde von Ischämie oder 1 Stunde von Ischämie.durch einen 2 h Reperfusion. Balken = 500 & mgr; m (Deckplatten), 200 & mgr; m (Bodenplatten). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Expression von inflammatorischen Zytokinen während der Ischämie-Reperfusion Expression von CXCL2, TNF, IL-6, IL-1b in 1 h und 2 h nach der Ischämie-Reperfusion in ischämischem Gewebe (IR) und normalen Kontrollgewebe (C) gemessen. neben dem ischämischen Bereich, der durch Echtzeit-PCR. n = 3 bis 8 Mäuse pro Gruppe, * p <0,05; ** P <0.01; *** P <0,001. Fehlerbalken stellen Sem Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Murine Species | Anästhesie / Analgesie | Artery Occlusion Verfahren | Ischemia Zeit | Zeit nach der Reperfusion | Referenz | |||
| Sprague-Dawley-Ratten | Natriumpentobarbital | Occlusion von SMA und Zöliakie-Arterie mit Aneurysma-Clip oder eine Klemme | 45 min | 2 Stunden | 12 | |||
| C57Bl6 / 129 | 2% Halothan | Occlusion der mesenterialen Arteriolen und die proximalen und distalen Abschnitte des ischämischen Gewebes. | 30 bis 130 min | 6 Stunden | 13 | |||
| C57BL / 6 | Ketamin, Isofluran | Occlusion von SMA mit Aneurysma-Clips. Occlusion von Sicherheiten circulation am proximalen und distalen Bereichen. | 1 Stunde | 1,5 Stunden | 4,8,11 | |||
| C3H / Hej | Natriumpentobarbital | Occlusion mit Aneurysma-Clip oder eine Klemme | 40 min | 6 Stunden | 14 | |||
| C56BL / 6 | Isofluran | Occlusion von SMA und Ileocolische Arterie mit Aneurysmaklammer oder Klemme | 100 min | 1, 2, 4, 24 hr | 15 | |||
| C57BL / 6 | Urethane | Occlusion mit Aneurysma-Clip oder eine Klemme | 45 min | 60 min | 16 | |||
Tabelle 1: Variationen in Methodik in Murine Intestinale IR-induzierten Verletzung
| Histologie Scoring - System | Referenz | ||
| Grad 0: Normal Schleimhaut | 13,17,18 | ||
| Grad 1: Subepitheliales Raum an der Villi Spitze | |||
| Grade 2: ausgedehntere subepithelialer Raum | |||
| Grad 3: Epithelial Anheben entlang der Seiten villous | |||
| Grad 4: Denuded Zotten | |||
| Grad 5: Verlust von Zottengewebe | |||
| Klasse 6: Crypt Schicht Infarkt | |||
| Grade 7: Transmukosale Infarkt | |||
| Grade 8: Transmurale Infarkt | |||
| Grad 0: Normal Schleimhaut | 4,8,11,19-21 | ||
| Grad 1: Ablösung von Zellen auf villous Tipps | |||
| Grad 3: Villi waren abwesend, aber Krypten waren noch leicht nachweisbar | |||
| Grad 4: Das vollständige Fehlen von epithelialen Strukturen und transmurale Nekrose | |||
| Grad 0: Normal villus | 6,22-31 | ||
| Grad 1: Villi mit Spitze Verzerrung | |||
| Grade 2: Becherzellen und Gugenheims "Räume fehlen | |||
| Grad 3: Villi mit fleckige Unterbrechung der Epithelzellen | |||
| Grad 4: Villi mit sichtbaren, aber intakte Lamina propria mit Epithelzelle Häutung | |||
| Grad 5: Lamina propria ist nässende | |||
| Klasse 6: Villi, dass Display-Blutungen oder zu Zotten, die entblößt werden | |||
| Grad 0: Normal Histologie 32,33 | |||
| Grade 1: Leichte Störung des Deckepithel | |||
| Grade 2: Epithelial Zellverlust Verletzung bei villus Spitze | |||
| Grad 3: Mucosal vasocongestion, Blutungen, und fokale Nekrosen mit einem Verlust von weniger als die Hälfte der Zotten | |||
| Grad 4: Schäden an mehr als der Hälfte der Zotten Verlängerung | |||
Tabelle 2: Histologie Scoring - Systeme in Murine Intestinale IR-induzierten Verletzung
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Discussion
Die Entwicklung von Mausmodellen der intestinalen Verletzungen IR haben stark verbessert das Verständnis der Mechanismen der Gewebeverletzung und bei der Entwicklung von potentiellen therapeutischen Strategien Aided zu Gewebeschäden 7,9,11,34 minimieren. Die kritischen Schritte dieses Protokolls sind die richtige Positionierung der mikrovaskulären Clips, richtige Timing der Ischämie und korrekte histologische Untersuchung des IR-Verletzung.
Die Dauer der Ischämie ist kritisch für die nachfolgende epithelialen Schaden. Die typische Zeit ohne reproduzierbare IR Schädigung induzieren erforderlich Morbidität und Mortalität der Versuchsmäuse 45-60 min durch eine 2-3 h Reperfusion. Verlängerte Perioden der Ischämie kann zu einer vollständigen Verlust des Epithels und erhöhter Mortalität. Zum Beispiel resultierte in einem Schweinemodell von jejunal Ischämie, 60 min Okklusion in teilweisem Verlust von villa Epithel, während Okklusion für 120 min zum vollständigen Verlust der villus Epithel 35 geführt. ichmportantly, keimfrei und genetisch manipulierten Mäusen kann eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber IR Verletzungs anzuzeigen, und daher optimale Zeit der Ischämie und Reperfusion müssen in Vorversuchen optimiert werden. Obwohl typische Zeit für die Reperfusion nach der Auswertung der Gewebeschädigung 2-3 h ist, längere Zeit (12 h) wird für die Analyse der intestinalen Stammzellmobilisierung 36 erforderlich. Darüber hinaus Änderungen in symbiotischer Mikrobiota und TLR / Nod-vermittelten Signal signifikant das Ergebnis der von IR beeinflussen Verletzung 4,8,37-39.
Die richtige Position der mikrovaskulären Clips ist auch entscheidend für die reproduzierbare IR-Verletzung. Hier beschreiben wir das Modell der IR Verletzung des murinen distalen Ileum. Verschiedene Teile des Darms sind bekannt unterschiedlichen Empfindlichkeit gegenüber IR Verletzung anzuzeigen. Zum Beispiel ist Jejunum empfindlicher IR Verletzungen als 9,34,40 Ileum und Colon. In der Tat, Ischämie-Reperfusion-Modell von Jejunum von SMA mit einem einzigen OkkludierenClip wird üblicherweise für die Mechanismen der IR-Verletzung zu untersuchen (siehe Nr. 9 für eine umfassende Überprüfung der verschiedenen Methoden der IR-Verletzungen bei Tieren). Jedoch variiert die genaue Position des Clips und die Analyse von verschiedenen Abschnitten des Darmes sowie verschiedene Methoden der Anästhesie zwischen diesen Untersuchungen, ist es schwierig zu reproduzieren (siehe Tabelle 1) zu machen. Eine zusätzliche Komplikation der IR Verletzung von Jejunum ist eine hohe Mortalität seit Position des Gefäßclip nahe an der Wurzel von SMA Blutversorgung weiten Bereich des Darms beeinträchtigt. Daher wird in der vorliegenden Studie haben wir ein Protokoll konsistent IR Verletzung des terminalen Ileums zu induzieren, die leicht zu reproduzieren ist. Um reproduzierbare IR Verletzung von Ileum induzieren, ist die richtige Position des Gefäßclips kritisch. Dies wird erreicht, indem die peripheren und Nebenzweige des mesenterica superior Arterie Grad der IR Verletzung Okkludieren kann durch Auswertung von Hämatoxylin und Eosin Abschnitte mit Original-Chiu / Par bewertet werdenk oder modifizierte Score Systeme 11,18,34,41,42. Zusätzlich können Auswertung von Gewebeschäden durchgeführt werden Desoxyribonukleotidyltransferase Biotin-dUTP nick end-Kennzeichnung (TUNEL) Färbung von fragmentierten DNA oder aktive Caspase-3 immunhistochemischen Färbung, die Analyse von Neutrophilen durch Myeloperoxidase-Aktivität messen oder immunhistochemischen Auswertung von Neutrophilen Gr mit -1 oder Ly6G Antikörper - Färbung 7,11. Inflammatorische Zytokine und Chemokine, wie IL-1b, TNF, IL-6, CXCL1, CXCL2 kann CCL2 durch Echtzeit - PCR 2,4,8 ausgewertet werden. Ein Beispiel für die Analyse der inflammatorischen Cytokin - Expression wird auf Abbildung 4 dargestellt.
Es ist wichtig , trotz der hohen Reproduzierbarkeit und die Zugänglichkeit von IR Verletzung des Ileum zu beachten , dass dieses Modell nicht alle klinischen Anzeichen einer Krankheit beim Menschen, in besonders chronischen Krankheitszuständen und Bedingungen mit teilweiser Verschluss der Arteria mesenterica superior zurückgelegt werden 9 9,43. Daher Modelle große Tiere, wie Schweine verwendet werden 9,44 entwickelt. Eine sorgfältige Auswahl des Tiermodells auf den menschlichen Zustand abhängig sucht kritisch. Zusammenfassend beschreiben wir eine einfache und robuste Ausführung der intestinalen IR Verletzung, die verwendet werden können, die zellulären und molekularen Mechanismen der epithelialen Verletzungen und Regeneration zu studieren.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von russischen Science Foundation unterstützt wurde, gewähren keine. 14-50-00060 und LLC RUSCHEMBIO. Diese Arbeit wurde von der Morbus und Colitis Grundlage von Amerika gewähren 294.083 (AVT), und von NIH Zuschusses RO1 DK47700 (CJ) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heated Pad | Sunbeam | E12107-819 | Alternative: Braintree Scientific heated pad |
| Table top research anesthesia Machine | Vasco | UCAP 0001-0000171 | Alternative: Parkland Scientific, V3000PS |
| Nose Cone | Parkland Scientific | ARES500 | |
| Scavenger canister and replacement cartridge | Parkland Scientific | 80000, 80120 | |
| Induction Chamber | Surgivet | V711802 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-10 | Controlled substance, contact IACUC |
| Animal clipper | Oster | Oster Golden A5 078005-050-003 | |
| Ophthalmic ointment | Webster | 8804604 | |
| Buprenorphine | McKesson | 562766 | Controlled substance,contact IACUC |
| Ketaset (Ketamine HCl) | Pfizer | NADA 45-290 | Controlled substance, contact IACUC |
| Cotton tips | Puritan medical products | 806-WC | Autoclave before use |
| Betadine | Purdue Products | 67618-150-17 | 10% Povidone-Iodine |
| Sterile saline solution | Aspen | 46066-807-60 | Adjust to room temperature before use |
| IR rodent thermometer | BIOSEB | BIO-IRB153 | |
| Micro vascular clips, 70 g | Roboz Surgical | RS5424, RS5435 | Alternative: WPI 14121, for SMA occlusion |
| Micro vascular clips, 40 g | Roboz Surgical | RS6472 | Alternative:WPI 14120, for collateral vessels occlusion |
| Clip applying forceps | World Precision Instruments | 14189 | Alternative: Roboz #RS-5410 or #RS-5440 |
| Gill's 3 hematoxylin | Thermo Scientific | 14-390-17 | |
| Surgical staples, Reflex 9 mm | Cell Point Scientific | 201-1000 | |
| Autoclip applier | Beckton Dickinson | 427630 | |
| Byopsy foam pad | Simport | M476-1 | |
| Tissue cassette | Fisher Healthcare | 15182701A | Histosette II combination lid and base |
| 10% buffered formalin | Fisher Scientific | 245-684 | |
| Surgical iris scissors | World Precision Instruments | 501263-G SC | Alternative: Roboz RS6816 |
| Operating scissors | World Precision Instruments | 501219-G | Alternative: Roboz RS6814 |
| Dressing forceps | Roboz Surgical | RS-5228, RS-8122 | Alternative: World Precision Instruments 1519-G |
| Heparin, endotoxin free, 300 USP units/vial, 50 mg | Sigma | 2106 | |
| Reflex wound clip removing forceps | Roboz Surgical | RS-9263 | Alternative: World Precision Instruments: 500347 |
| Mice C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | Stock No 0664 | |
| Telfa non-adherent dressings, 3 x 4, sterile | Coviden | 1050 | |
| Fisherbrand transfer pipets | Fischer Scientific | 13-711-5AM | Use pipets to dropwise add saline |
References
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