Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

דגם Murine של פגיעת המעיים איסכמיה reperfusion

Published: May 11, 2016 doi: 10.3791/53881
Automatic Translation
1,2, 3, 1, 3, 1,2
1Trudeau Institute, 2Engelhardt Institute of Molecular Biology, 3Departments of Medicine and Infectious Diseases and Pathology, University of Florida

Summary

כאן אנו מתארים את ההליך המפורט של reperfusion איסכמיה מעיים בעכברים שתוצאתה הפגיעה לשחזור ללא תמותה לעודד סטנדרטיזציה של טכניקה זו על פני השדה. מודל זה של פגיעת איסכמיה-רה-פרפוזיה במעי יכול להיות מנוצל כדי לחקור את המנגנונים התאיים ומולקולריים של פציעה והתחדשות.

Abstract

איסכמיה מעיים הוא מצב מסכן חיים הקשורים מגוון רחב של מצבים רפואיים, כולל טרשת עורקים, פקקת, תת לחץ דם, דלקת מעי נמקית, השתלת מעי, טראומה ודלקת כרונית. פציעה איסכמיה-רה-פרפוזיה מעיים (IR) היא תוצאה של איסכמיה mesenteric חריפה, הנגרמת על ידי זרימת דם מספקת דרך כלי mesenteric, וגרמו נזק מעיים. Reperfusion איסכמיה הבאים יכולים להחמיר נזק של המעי. המנגנונים של פגיעת IR הם מורכבים לא ידועים ולא מובנים. לכן, במודלים של בעלי חיים קטנים ניסיוניים הם קריטיים להבנת הפתופיזיולוגיה של פציעת IR לבין ההתפתחות של טיפולים חדשניים.

כאן אנו מתארים במודל עכבר של פגיעה IR חריפה במעי המספק פגיעה לשחזור של המעי הדק ללא תמותה. זו מושגת על ידי איסכמיה התרמה באזור של מעי דיסטלי ידי זמנית occluding ענפים בטחונות הפריפריה הטרמינל של עורק mesenteric המעולה במשך 60 דקות באמצעות קטעי כלי דם. Reperfusion עבור שעה 1, או 2 שעות לאחר תוצאות פגיעות פגיע לשחזור של המעי נבדק על ידי ניתוח היסטולוגית. עמדה הנכונה של קליפים כלי הדם היא קריטית עבור ההליך. לכן את הסרטון ממחיש באופן חזותי מפורט צעד אחר צעד תיאור של הטכניקה הזו. מודל זה של פציעת IR במעי יכול להיות מנוצל כדי לחקור את המנגנונים התאיים ומולקולריים של פציעה והתחדשות.

Introduction

המעי רגיש מאוד הפרעה של זרימת הדם הגורמת לנזק איסכמיה ו אפיתל. Reperfusion לאחר איסכמיה מספק מחדש חמצון של רקמות, והוא יכול לקדם פתולוגיה. לכן, פגיעה איסכמיה ו reperfusion מעיים מזוהה עם מגוון רחב של פתולוגיות, כולל דלקת מעי נמקית, דחייה של השתל בהשתלות מעי דק, סיבוכי ניתוח מפרצת אבי העורקים בבטן, מכונת לב-ריאה, ו 1,2 מחלת מעי דלקתית. פגיעה במעיים IR, במיוחד איסכמיה mesenteric חריפה, הוא מצב מסכן חיים וכתוצאה מכך תחלואה ותמותה 3.

למרות לא ידוע ולא מובן,-reperfusion איסכמיה של המעי (IR) פציעה הוא חשב להיות קשורה לשינויים החיידקים במעיים כמו גם את הייצור של מינים החמצן מגיב וציטוקינים דלקתיים וכמוקינים 1,4-6. זה מוביל הפעלה של שניהםנייט ומנגנוני החיסון אדפטיבית אשר לקדם 1,7,8 פגיעה דלקת רקמות.

במודלים של בעלי חיים הם קריטיים להבנת המנגנונים של פגיעה IR, מאחר שהם מאפשרים gain- קל ניסויים גנטיים הפסד של פונקציה. במודלים של בעלי חיים כמה IR פותחו הכוללים חסימה של כלי דם מלא, איסכמיה זרימה נמוכה, ו מפולח חסימה של כלי דם (שהעיקריים בם פורטו סקירה מקיפה אחרונה 9). איסכמיה מעיים הנגרמת על ידי חסימה של כלי דם מלא של עורק mesenteric המעולה (SMA) היא מודל קל נפוץ של IR בחיות גדולות ומכרסמים 9-11. עם זאת, באזורים שונים של המעי יש רגישות שונה על פשע. בנוסף, המגוון הרחב של חומרי הרדמה, משככי כאבים, טכניקות חסימה בעורק, כמו גם חוסר עקביות משך פגיעת איסכמית תוצאת התאוששות מעלות משתנות של פציעת בלבול הבנתנו את הביולוגיה של IR ברחבי studie המרובהים. טבלה 1 מדגים סתירות אלה במחקרים IR בעכברים. החסרון הגדול ביותר מהשימוש פעמים איסכמי קצרות (30-45 דקות) הוא מיקוד החלון של התאוששות שעליו הבדלים להבחין בין מקרים ובקרות ניתן לצפות. פציעה קלה עד האפיתל עשויה להיפתר שעה לאחר רה-פרפוזיה, ולכן התמחתה מדדי פתולוגיים שיידרשו כדי למצוא הבדלי שבת אפיתל. לעומת זאת, נזק מוגזם, כפי שניתן לראות על ידי 100 דקות של פגיעה איסכמית עלול לגרום denudement שלם של האפיתל, שם השבת כבר אי אפשר, להגדיל את שיעור התמותה, וזמן ההתאוששות. לכן, כאן אנו מתארים את ההליך המפורט של IR מעיים בעכברים שתוצאתה הפגיעה לשחזור ללא תמותה לעודד סטנדרטיזציה של טכניקה זו על פני השדה שלנו. מודל זה של פציעת IR במעי יכול להיות מנוצל כדי לחקור את המנגנונים התאיים ומולקולריים של פציעה והתחדשות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מחקרים בבעלי חיים בוצעו בהתאם המכון הלאומי הנחיות בריאות אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש של המכון טרודו. 8-12 בן שבוע C57BL / 6 עכברים שימשו במחקר.

1. הכנה לקראת ניתוח

  1. הכן לעקר מכשירי ניתוח.
  2. כן מערכת הרדמה מבוסס isoflurane עם חרטומו, ואת משטח לוהט. ודא משטח מחומם לא יתר על המידה (<39 ºC).
  3. ודא כי מכל הדחת גז isoflurane ממוקם כראוי על מנת להבטיח את יציאות פליטה בתחתית המכל אינם חסומים או מאפיל בכל דרך. לשקול מיכל הדחה גז לפני הליך ומשקל מסמך על המכל. בטל מכל כאשר משקל מכל עולה על 50 גרם של משקל שנצבר (~ 12 שעות).

2. הרדמה

  1. להרדים עכבר עם 3% isoflurane בתא אינדוקציה (1 ליטר / דקהO 2).
    1. הערכת עומק ההרדמה על ידי חוסר יכולת להישאר זקוף, אובדן תנועה רצונית תכליתית, אובדן רפלקס מצמוץ, הרפיית שרירים, ואובדן בתגובה רפלקס גירוי (הבוהן או קמצוץ הזנב עם לחץ חזק).
    2. הערכת קצב הנשימה ואת דפוס ידי התבוננות דופן בית החזה ותנועות בטן. בהרדמה אופטימלית, קצב הנשימה צריך להיות ~ 55-65 נשימות לדקה.
    3. סר עכבר מאולם האינדוקציה ובמהירות לגלח את אזור הבטן של העכבר.
  2. כדי למנוע התייבשות קרנית, למקם משחת עיניים תפל בעיני.
  3. יש לשים את הסמן על המשטח הלוהט ולחבר אותו באמצעות חרטומו למערכת הרדמה. הפוך קרום חרטומו לטקס בטוח מתאים בחוזקה על הראש של העכבר ואין דליפה של isoflurane.
  4. מקטינים את שיעור isoflurane ל -1.5%, ולהזריק עצירות (0.1 מ"ג / ק"ג) ו קטמין (10 מ"ג / ק"ג) תת עורי כדי למנוע את הרוח של מפל-כאב.
  5. נגב העור דואר של אזור הפעולה עם מקלון צמר גפן סטרילי ספוג פתרון כירורגי בבטאדין ואחריו אתנול 70%.

3. כירורגיה

  1. הפוך פיום בטן סנטימטר באמצע קו 3-5 במספרי הפעלה. כסה את איזור פעולה עם הכרית לא חסיד סטרילי טבול מלוח. לבודד cecum ואת המעי ולחשוף את עורק mesenteric המעולה שימוש צמר גפן טבולה מלוח.
  2. כדי להקל קליפ החלים, לבצע חתכים קטנים לפדר סביב עורק mesenteric המעולה שימוש איריס בסדר scissors.To לעשות זאת, בעדינות להרים את המעי עם מלקחי הלבשה וחותך לפדר משני צידי עורק mesenteric המעולה במיקום קליפ הרצוי (איור 1A). לאחר מכן, להוסיף כמה טיפות של תמיסת מלח סטרילית לאזור על מצב קליפ רצוי לפני היישום קליפים.
    הערה: כדי לבצע את ניתוח הדמה, בצע את הליך כירורגי עד שלב 3.2. אין ליישם קליפים. במקום זאת, לשמור על רקמות לחות על ידי ים חמים הוסיףאלין כמתואר 3.6 עבור שעה 1. לאחר מכן, המשך לשלב 4.1,
  3. לחסום את סניפי ממדרגה ראשונה של העורק mesenteric מעולה עם קליפים כלי הדם (כוח 70 גרם) באמצעות applier קליפ כדי ליצור אזור ס"מ 5-7 של מעי איסכמי סמוך cecum (איור 1B). למרות המיקום של הכלי הוא שמרני, ייתכן שיש שינויים קלים בין עכברים (ראה דוגמאות על איור 1). לכן, 2 או 3 קליפים בדרך כלל נדרשים (לראות את המיקום של קליפים על איור 1 א, ד, ה, חיצים שחורים).
    הערה: השתמש קליפים כלי באיכות גבוהה. קליפים לחץ גבוה יכול לפגוע בכלי ולמנוע התחדשות ואילו קליפים בלחץ נמוך (<30 גרם) לא יכול לחסום את זרימת הדם לחלוטין.
  4. חסום זרימת דם בטחונות דרך המעי באמצעות שני קליפים כלי דם על פני כלי (40 כוח ג'י), demarking באזור מעי איסכמי (איור 1). ספיגה של כלי בטחונות נדרשהלמנוע אספקת דם מכלי דם סמוכים (לראות את המיקום של קליפים על איור 1 א, ד, ה, חצים ירוקים).
  5. אופציונלי: הוסף פתרון הפרין (6 יחידות USP / מ"ל), כדי למנוע קרישת דם. Dropwise להוסיף 0.5 מיליליטר של תמיסת הפרין אל המעי המבודד.
  6. סטרילי כרית לא חסיד לחים עדינים עם מי מלח מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס, החלימו על תחום כירורגים. ודא כי מגבונים נשארים רטובים במהלך ההליך כולו.
  7. לשמור על איסכמיה במשך 60 דקות באמצעות 1-1.5% הרדמה isoflurane לאורך כל הדרך. אם הליך איסכמיה מבוצע כהלכה, באזור איסכמי ישתנה לאדום יין בצבע ב כ 30 דקות. שים לב כלי דם דיסטלי לתפקיד קליפ מוגדל במהלך איסכמיה (איור 1, לוחות מימין) המציין חסימה מוצלחת.
  8. לעקוב מקרוב אחר העכבר בשלב איסכמיה. תמשיך לחול תמיסת מלח כדי לרפד לא חסיד המכסה את אתר הניתוח.
  9. סימן את הקצוות של האזור איסכמי ידי pipetting 20 μl של hematoxylin Gill`s 3 על הרקמה כדי להקל קצירת רקמה איסכמית רקמה בריאה סמוכים מאותו עכבר להשוואה (איור 1E, פאנל מימין).

4. שלב reperfusion

  1. בסוף של איסכמיה להוסיף כמה טיפות של תמיסת מלח על האזור קליפ בעדינות להסיר קליפים כלי הדם עם applier קליפ. ואז, בעדינות לדחוף את המעי חזרה אל חלל הבטן באמצעות עצות צמר גפן טבולה מלוחות. הסר כרית לא חסיד ולסגור את דופן הבטן ואת העור באמצעות קליפים הפצע נירוסטה 9 מ"מ. אם reperfusion מבוצע יותר מ -3 שעות, השתמש תפר vicryl נספגים לסגור את דופן הבטן לפני יישום קליפים פצע על העור.
  2. לשמור על עכברים בכלוב נקי מחומם עבור פרק הזמן הרצוי (30 דק ', 60 דק', 120 דק ', או 180 דקות) עבור השלב reperfusion.
  3. בדוק חיות לפחות כל 30 דקות כדי להבטיח יציבות.

class = "jove_title"> 5. Necropsy והקציר של המעי הדק

  1. להרדים עכברים על ידי ה- CO 2 ממנת יתר ואחריו נקע בצוואר הרחם בזמן הרצוי הבאים reperfusion.
  2. פתח חלל הבטן לאסוף את רקמת המעי איסכמי לניתוח נוסף. קציר נורמלי בריאות רקמות סמוכות הרקמות הפגועות בקרתי פנימי לחשבון לכל תגובה מערכתית בכל נוגע לפגיעה.
    הערה: בקרה זה מתאימה יותר מאשר אחיזת העיניים המופעלות עכברים שליטים כי עכברי דמה מופעל אינם עוברים תגובה מערכתית בכל הנוגע לפגיעה נגרמת IR.
  3. יש לשטוף היטב את תוכן המעי באמצעות מזרק 30 מ"ל עם מחט gavage מצורף מלא מלוחים ואז לחתוך את המעי longitudinally. אם מדגם של מעי נדרש עבור ניתוח ביטוי גנים, לחתוך שבר 1.5 מ"מ אורכים, ולהשתמש חתיכת נותרים לניתוח היסטולוגית.
  4. לניתוח היסטולוגית, להכין רולדה בעזרת זוג מלקחיים כדי לגלגל את intestine.
  5. כדי לשמור על הצורה התגלגלה, למקם את החלקים של מעי בין כריות קצף ביופסית קלטות רקמה (איור 2). מניח את הקלטות בפורמלין 10% שנאגרה.
  6. תקן רקמה בפורמלין hr 24 לפחות. חלף פורמלין עם אתנול 70% עבור 24 שעות נוספות. רקמות חנות באתנול 70% ללא הגבלת זמן בטמפרטורת החדר.
  7. להטביע פרפין, לחתוך 5 סעיפים מיקרומטר ואת הכתם עם באמצעות hematoxylin ו eosin פרוטוקול סטנדרטי (איור 3).

6. ניקוד

  1. ציון הפגיעה בעכברים איסכמיה-רה-פרפוזיה כפי שמסוכם בטבלה 2. בחר שיטת הניקוד המתאים.
  2. אופציונלי: מחלקים את שדה הראייה לארבעה חלקים מאז חומרת הפגיעה משתנה לאורך כל הקטע.
  3. חשב את ממוצע הציונים של כל קטע מתוך דפי תווים שהושגו בצורה עיוורת.
  4. השווה את הכיתה של הרקמה הפגועה בין מקרים ובקרה וכן thדואר ללא פגע רקמות באמצעות מבחן Kruskal-Wallis, ואחריו מבחן ההשוואות המרובה של דאן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אנחנו מותאמים פרוטוקול הניסוי של ניתוח IR להשיג פגיעה לשחזור IR מושרה של המעי בעכברים. נציג תוצאות מודגמות בסעיף זה.

איור 1 מציג דוגמאות של עמדת קליפים כלי דם כדי לגרום איסכמיה של המעי העקום. חיצים שחורים להראות עמדת קליפים העיקרי הגורם לחסימה סניפים ממדרגה ראשונה של העורק mesenteric מעולה. חצים ירוקים להציג את המיקום של קליפים נוספים לחסום אספקת דם מכלי בטחונות. הערת גודל מוגבר של כלי occluded דיסטלי לתפקיד קליפים ושינוי צבע של האזור איסכמי של intestinte. לאחר הסרת קליפים בסוף כלי דם איסכמיה להחזיר את זרימת הדם ולהחזיר לגודל הרגיל.

איור 2 מציג דוגמה של קלטת רקמה המכילה לחמניות שוויצרי שהוכן control ואזורים איסכמי של העקום לאחר 1 שעות של איסכמיה, ואחריו 1 hr של רה-פרפוזיה. חתיכת הטחול נכללה כדי להקל מיצוב של מעי מלא IR במהלך עיבוד מכתים. שים לב להבדל בין צבע מלאה רקמה איסכמית.

איור 3 מראה מכתים hematoxylin ו eosin נציג מלאה אזורים איסכמי של העקום לאחר 1 שעות של איסכמיה, או 1 hr של איסכמיה ואחריו 2 שעות של reperfusion. הערת הפגיעה הקשה של האפיתל לאחר 1 שעות של איסכמיה המאופיין villi המורגי, האפיתל denudement עם חלקים להשלים אבלציה של מאורות, וחדירת תא חיסון (כוכבית). אחרי שעה 2 של נזק villi reperfusion ודלקת להתמיד (כוכבית), אבל אין דימום רקמות.

איור 4 מראה דוגמא של הניתוח של CY הדלקתיתביטוי tokines ב 1 שעה ו 2 שעות לאחר-reperfusion איסכמיה במעי איסכמי ושליטה. הערת גברת ביטוי של ביטוי mRNA של TNF, IL-1b, IL-6 ו- CXCL2 ב 1 שעה ו 2 שעות לאחר רה-פרפוזיה-איסכמיה לעומת שליטת רקמה בריאה.

איור 1
איור 1: אינדוקציה של איסכמיה באמצעות קליפים דם (א) באזור מבודד של המעי המכיל cecum ואת מעי.. חתכים קטנים לפדר סביב עורק mesenteric המעולה נעשים כדי להקל יישום קליפ. (ב) יישום כלי הדם הקליפ בעזרת applier קליפ. (C) קבוצה של קליפים כלי דם על עורק mesenteric מעולה לגרום איסכמיה. (D, E). דוגמאות של מבנה כלי הדם ומיצוב קליפ בעכברים שונים. החצים מצביעים על אזור איסכמי של העקום בסימן hematoxylin. <יעד a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53881/53881fig1large.jpg" = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2:.. הכנה רקמות לניתוח היסטולוגית קלטת רקמה המכילה לחמניות שויצריות מוכנות מאזורים איסכמי ובקרו על המעי לאחר 1 שעות של איסכמיה ואחריו 1 hr של reperfusion אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: Hematoxylin ו Eosin הכתמה של מעי לאחר איסכמיה Hematoxylin ו מכתים eosin של אזורים מלאים איסכמי של העקום לאחר 1 שעות של איסכמיה, או 1 hr של איסכמיה. ואחריו 2 שעות של reperfusion. ברים = 500 מיקרומטר (פאנלים למעלה), 200 מיקרומטר (לוחות למטה). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: הביטוי של דלקתיות ציטוקינים במהלך איסכמיה reperfusion הביטוי של CXCL2, TNF, IL-6, IL-1b נמדדה ב 1 שעה ו 2 שעות לאחר-reperfusion איסכמיה ברקמת איסכמי (IR) ורקמות שליטה רגילה (C). סמוך לאזור איסכמי ידי בזמן אמת PCR. n = 3 - 8 עכברים לכל קבוצה, * p <0.05; ** P <0.01; *** P <0.001. ברי שגיאה מייצגים SEM אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

xt.within-page = "תמיד">
מיני Murine שיכוך כאבי הרדמה / שיטת חסימה בעורק זמן איסכמיה פעם אחרת reperfusion התייחסות
חולדות Sprague-Dawley pentobarbital נתרן ספיגה של SMA ו עורק הצליאק באמצעות קליפ מפרצת או מהדק 45 דק ' 2 hr 12
C57BL6 / 129 2% halothane ספיגה של עורקיק mesenteric, ואת הפרוקסימלית ומ חלקים הדיסטלי של רקמות איסכמי. 30 כדי 130 דק ' 6 שעות 13
C57BL / 6 קטמין, Isoflurane ספיגה של SMA באמצעות קטעים מפרצה. ספיגה של circul בטחונותation על הפרוקסימלי ואזורי דיסטלי. 1 hr 1.5 שעות 4,8,11
C3H / Hej pentobarbital נתרן ספיגה באמצעות קליפ מפרצה או מהדק 40 דק ' 6 שעות 14
C56BL / 6 isoflurane ספיגה של SMA ועורקים ileocolic באמצעות קליפ מפרצת או מהדק 100 דק ' 1, 2, 4, 24 שעות 15
C57BL / 6 urethane ספיגה באמצעות קליפ מפרצה או מהדק 45 דק ' 60 דק ' 16

טבלה 1: וריאציות ומתודולוגיה Murine מעיים IR-induced פגיעה

ניקוד היסטולוגיה מערכה התייחסות
כיתה 0: רירית רגילה 13,17,18
כיתה 1: שטח Subepithelial בקצה villous
כיתה 2: שטח subepithelial מורחב עוד
כיתה 3: הרמת אפיתל בצדי villous
villi ערום: כיתה 4
כיתה 5: הפסד של רקמות villous
כיתה 6: אוטם שכבת קריפטה
כיתה 7: אוטם Transmucosal
כיתה 8: אוטם transmural
כיתה 0: רירית רגילה 4,8,11,19-21
כיתה 1: השלת התאים על טיפים villous
הכיתה 3: villi נעדר, אבל מאורות עדיין היו בקלות לזיהוי
כיתה 4: העדר מוחלט של מבנים אפיתל ונמק transmural
כיתה 0: סיסי רגיל 6,22-31
כיתה 1: villi עם עיוות טיפ
כיתה 2: תאים וגביע ושטחים 'Gugenheims חסרים
כיתה 3: villi עם הפרעה בלתי סדירה של תאי אפיתל
כיתה 4: villi עם חשוף, אך שכבת רירית מיוחדת שלמה עם השלת תאי אפיתל
כיתה 5: Lamina propria הוא מדיף
כיתה 6: villi כי דימום התצוגה או villi כי הם נכרתים
כיתה 0: היסטולוגיה רגילה 32,33
כיתה 1: שיבוש קל של האפיתל השטח
כיתה 2: פציעת אובדן תאי אפיתל בקצו סיסי
כיתה 3: רירית vasocongestion, דימום, נמק מוקדי עם הפסד של פחות ממחצית villi
כיתה 4: ניזק הארכה ליותר מחצי-אחד villi

טבלה 2: מערכות ניקוד היסטולוגיה ב Murine מעיים IR-induced פגיעה

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פיתוח מודלים העכבר של פציעה IR מעיים השתפרו מאוד להבנת המנגנונים של פגיעה ברקמות וסייע בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאל למזער נזק לרקמות 7,9,11,34. השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה הם מיצוב נכון של קליפים כלי הדם, עיתוי נכון של הערכה היסטולוגית איסכמיה והתקינה של פציעת IR.

משך איסכמיה הוא קריטי עבור ניזק אפיתל שלאחר מכן. השעה טיפוסי נדרש כדי לגרום פגיעה IR לשחזור ללא תחלואה ותמותה של עכברי הניסוי הוא דק 45-60 ואחריו reperfusion hr 2-3. פרקי איסכמיה רשאים תוצאות אובדן מוחלט של האפיתל ותמותה מוגברת. לדוגמא, במודל חזירי של איסכמיה jejunal, 60 חסימת דקות הביאה לאובדן חלקי של האפיתל וילה, ואילו חסימה במשך 120 דקות הובילה לאובדן המוחלט של סיסי אפיתל 35. אניmportantly, נבט-חופשית מניפולציות גנטיות בעכברים עשוי להציג רגישות מוגברת פציעה IR, ולכן הזמן האופטימלי של איסכמיה ו reperfusion ייתכן שיהיה צורך אופטימיזציה בניסויים ראשוניים. למרות הזמן הטיפוסי להערכת נזק לרקמות לאחר רה-פרפוזיה הוא 2-3 שעות, זמן ארוך יותר (12 שעות) נדרש לניתוח גיוס תאי גזע מעיים 36. בנוסף, שינויי חיידקי commensal ו TLR / נוד בתיווך איתות יכולים להשפיע באופן מהותי על התוצאה של פגיעת IR 4,8,37-39.

העמדה נכונה של קליפים כלי הדם הינה עניין מהותי פגיעה IR לשחזור. כאן אנו מתארים את המודל של פציעת IR של המעי דיסטלי בעכברים. חלקים נפרדים של המעי ידועים להציג מרגישים שונה פציעת IR. לדוגמה, מְעִי צָם רגיש יותר לפגיעה IR מ מעי הגס 9,34,40. למעשה, איסכמיה-רה-פרפוזיה מודל של מְעִי צָם ידי הגורם לחסימה SMA עם יחידקליפ משמש בדרך כלל כדי לחקור את המנגנונים של פגיעת IR (ראה נ"צ. 9 עבור סקירה מקיפה של שיטות שונות של IR-פגיעה בבעלי חיים). עם זאת, את המיקום המדויק של הקליפ ועל ניתוח של חלקים שונים של המעי, כמו גם שיטות שונות של הרדמה משתנה בין המחקרים הללו, מה שהופך אותו קשה לשחזר (ראו טבלה 1). סיבוך נוסף של פגיעת IR של מְעִי צָם הוא תמותה גבוהה מכיוון שמיקום של קליפ וסקולרית הקרוב לשורש SMA משפיע אספקת דם לאזור רחב של מעי. לכן, במחקר הנוכחי פיתחנו פרוטוקול לגרום לפציעה IR עקבית של מעי סופני, אשר קל לשחזר. כדי לגרום פגיעת IR לשחזור של מעי, במיקום הנכון של קליפים וסקולרית הוא קריטי. זו מושגת על ידי גורם לחסימת הענפים ההיקפיים וביטחונות של תואר artery.The mesenteric המעולה של פציעת IR ניתן להעריך על ידי הערכת סעיפי hematoxylin ו eosin באמצעות מקורי צ'יו / Park או מערכות ציון שונה 11,18,34,41,42. בנוסף, הערכת נזק לרקמות יכול להתבצע באמצעות ביוטין-dUTP transferase הטרמינל deoxynucleotidyl ניק סוף-תיוג (TUNEL) מכתים של DNA מקוטעת, או caspase-3 פעיל מכתים immunohistochemical, ניתוח של נויטרופילים ידי מדידת הפעילות myeloperoxidase או הערכה immunohistochemical של נויטרופילים באמצעות Gr -1, או נוגדן Ly6G מכתים 7,11. ציטוקינים chemokines דלקתיות, כגון IL-1b, TNF, IL-6, CXCL1, CXCL2, CCL2 ניתן להעריך על ידי 2,4,8 PCR בזמן אמת. דוגמה של ניתוח של ביטוי ציטוקינים דלקתיים מוצג באיור 4.

חשוב לציין כי למרות השחזור והנגישות הגבוהים של פגיעת IR של המעי, מודל זה עשוי שלא לשקף את כל סימנים הקליניים של מחלה אנושית, במיוחד בתנאי מחלה כרוניים ותנאים עם חסימה חלקית של עורק mesenteric המעולה 9 9,43. לכן, מודלים באמצעות בעלי חיים גדולים, כגון חזירים מפותחים 9,44. בחירה קפדנית של מודל החיה תלוי המצב האנושי נלמד היא קריטית. לסיכום, אנו מתארים מודל קל ויציב של פציעה IR מעיים אשר יכול להיות מנוצל כדי ללמוד את המנגנון תאית ומולקולרית של פציעה והתחדשות אפיתל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע רוסי, להעניק אין. 14-50-00060 ו LLC RUSCHEMBIO. עבודה זו נתמכה גם על ידי Crohn`s ו קוליטיס קרן של אמריקה להעניק 294,083 (כדי AVT), ועל ידי NIH מענק RO1 DK47700 (כדי CJ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Heated Pad Sunbeam E12107-819 Alternative: Braintree Scientific heated pad
Table top research anesthesia Machine Vasco UCAP 0001-0000171 Alternative: Parkland Scientific, V3000PS
Nose Cone Parkland Scientific ARES500
Scavenger canister and replacement cartridge Parkland Scientific 80000, 80120
Induction Chamber Surgivet V711802
Isoflurane Piramal Healthcare NDC 66794-013-10 Controlled substance, contact IACUC
Animal clipper  Oster  Oster Golden A5 078005-050-003
Ophthalmic ointment Webster 8804604
Buprenorphine McKesson 562766 Controlled substance,contact IACUC
Ketaset (Ketamine HCl) Pfizer NADA 45-290 Controlled substance, contact IACUC
Cotton tips Puritan medical products 806-WC Autoclave before use
Betadine Purdue Products 67618-150-17 10% Povidone-Iodine
Sterile saline solution Aspen 46066-807-60 Adjust to room temperature before use
IR rodent thermometer BIOSEB BIO-IRB153
Micro vascular clips, 70 g Roboz Surgical  RS5424, RS5435 Alternative: WPI 14121, for SMA occlusion
Micro vascular clips, 40 g Roboz Surgical  RS6472 Alternative:WPI 14120, for collateral vessels occlusion
Clip applying forceps World Precision Instruments 14189 Alternative: Roboz #RS-5410 or  #RS-5440
Gill's 3 hematoxylin Thermo Scientific 14-390-17
Surgical staples, Reflex 9 mm Cell Point Scientific 201-1000
Autoclip applier Beckton Dickinson 427630
Byopsy foam pad Simport M476-1
Tissue cassette Fisher Healthcare 15182701A Histosette II combination lid and base
10% buffered formalin Fisher Scientific 245-684
Surgical iris scissors World Precision Instruments 501263-G SC Alternative: Roboz RS6816
Operating scissors World Precision Instruments 501219-G Alternative: Roboz RS6814
Dressing forceps Roboz Surgical  RS-5228, RS-8122 Alternative: World Precision Instruments 1519-G
Heparin, endotoxin free, 300 USP units/vial, 50 mg Sigma 2106
Reflex wound clip removing forceps Roboz Surgical  RS-9263 Alternative: World Precision Instruments: 500347
Mice C57BL/6J mice  Jackson Laboratory Stock No 0664
Telfa non-adherent dressings, 3 x 4, sterile Coviden 1050
Fisherbrand transfer pipets Fischer Scientific 13-711-5AM Use pipets to dropwise add saline

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nat Med. 17, 1391-1401 (2011).
  2. Lenaerts, K., et al. New insights in intestinal ischemia-reperfusion injury: implications for intestinal transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 18, 298-303 (2013).
  3. Yasuhara, H. Acute mesenteric ischemia: the challenge of gastroenterology. Surg Today. 35, 185-195 (2005).
  4. Perez-Chanona, E., Muhlbauer, M., Jobin, C. The microbiota protects against ischemia/reperfusion-induced intestinal injury through nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 2 (NOD2) signaling. Am J Pathol. 184, 2965-2975 (2014).
  5. Lee, H., et al. Delineating the relationships among the formation of reactive oxygen species, cell membrane instability and innate autoimmunity in intestinal reperfusion injury. Mol Immunol. 58, 151-159 (2014).
  6. Yoshiya, K., et al. Depletion of gut commensal bacteria attenuates intestinal ischemia/reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 301, G1020-G1030 (2011).
  7. Wu, M. C., et al. The receptor for complement component C3a mediates protection from intestinal ischemia-reperfusion injuries by inhibiting neutrophil mobilization. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 9439-9444 (2013).
  8. Muhlbauer, M., Perez-Chanona, E., Jobin, C. Epithelial cell-specific MyD88 signaling mediates ischemia/reperfusion-induced intestinal injury independent of microbial status. Inflamm Bowel Dis. 19, 2857-2866 (2013).
  9. Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: progress and promise for translational research. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308, G63-G75 (2015).
  10. Megison, S. M., Horton, J. W., Chao, H., Walker, P. B. A new model for intestinal ischemia in the rat. J Surg Res. 49, 168-173 (1990).
  11. Goldsmith, J. R., et al. Intestinal epithelial cell-derived mu-opioid signaling protects against ischemia reperfusion injury through PI3K signaling. Am J Pathol. 182, 776-785 (2013).
  12. Cuzzocrea, S., et al. Glycogen synthase kinase-3beta inhibition attenuates the development of ischaemia/reperfusion injury of the gut. Intensive Care Med. 33, 880-893 (2007).
  13. Farber, A., et al. A specific inhibitor of apoptosis decreases tissue injury after intestinal ischemia-reperfusion in mice. J Vasc Surg. 30, 752-760 (1999).
  14. Ben, D. F., et al. TLR4 mediates lung injury and inflammation in intestinal ischemia-reperfusion. J Surg Res. 174, 326-333 (2012).
  15. Watson, M. J., et al. Intestinal ischemia/reperfusion injury triggers activation of innate toll-like receptor 4 and adaptive chemokine programs. Transplant Proc. 40, 3339-3341 (2008).
  16. Watanabe, T., et al. Activation of the MyD88 signaling pathway inhibits ischemia-reperfusion injury in the small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303, G324-G334 (2012).
  17. Murayama, T., et al. JNK (c-Jun NH2 terminal kinase) and p38 during ischemia reperfusion injury in the small intestine. Transplantation. 81, 1325-1330 (2006).
  18. Park, P. O., Haglund, U., Bulkley, G. B., Falt, K. The sequence of development of intestinal tissue injury after strangulation ischemia and reperfusion. Surgery. 107, 574-580 (1990).
  19. Jilling, T., Lu, J., Jackson, M., Caplan, M. S. Intestinal epithelial apoptosis initiates gross bowel necrosis in an experimental rat model of neonatal necrotizing enterocolitis. Pediatr Res. 55, 622-629 (2004).
  20. Aprahamian, C. J., Lorenz, R. G., Harmon, C. M., Dimmit, R. A. Toll-like receptor 2 is protective of ischemia-reperfusion-mediated small-bowel injury in a murine model. Pediatr Crit Care Med. 9, 105-109 (2008).
  21. Tatum, P. M., Harmon, C. M., Lorenz, R. G., Dimmitt, R. A. Toll-like receptor 4 is protective against neonatal murine ischemia-reperfusion intestinal injury. J Pediatr Surg. 45, 1246-1255 (2010).
  22. Fleming, S. D., et al. Anti-phospholipid antibodies restore mesenteric ischemia/reperfusion-induced injury in complement receptor 2/complement receptor 1-deficient mice. J. Immunol. 173, 7055-7061 (2004).
  23. Fleming, S. D., et al. Mice deficient in complement receptors 1 and 2 lack a tissue injury-inducing subset of the natural antibody repertoire. J. Immunol. 169, 2126-2133 (2002).
  24. Lapchak, P. H., et al. Platelets orchestrate remote tissue damage after mesenteric ischemia-reperfusion. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, G888-G897 (2012).
  25. Rehrig, S., et al. Complement inhibitor, complement receptor 1-related gene/protein y-Ig attenuates intestinal damage after the onset of mesenteric ischemia/reperfusion injury in mice. J. Immunol. 167, 5921-5927 (2001).
  26. Hoffman, S. M., Wang, H., Pope, M. R., Fleming, S. D. Helicobacter infection alters MyD88 and Trif signalling in response to intestinal ischaemia-reperfusion. Exp Physiol. 96, 104-113 (2011).
  27. Moses, T., Wagner, L., Fleming, S. D. TLR4-mediated Cox-2 expression increases intestinal ischemia/reperfusion-induced damage. J Leukoc Biol. 86, 971-980 (2009).
  28. Feinman, R., et al. HIF-1 mediates pathogenic inflammatory responses to intestinal ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 299, G833-G843 (2010).
  29. Lapchak, P. H., et al. The role of platelet factor 4 in local and remote tissue damage in a mouse model of mesenteric ischemia/reperfusion injury. PloS one. 7, e39934 (2012).
  30. Wen, S. H., et al. Ischemic postconditioning during reperfusion attenuates intestinal injury and mucosal cell apoptosis by inhibiting JAK/STAT signaling activation. Shock. 38, 411-419 (2012).
  31. Wang, F., et al. Temporal variations of the ileal microbiota in intestinal ischemia and reperfusion. Shock. 39, 96-103 (2013).
  32. Zou, L., Attuwaybi, B., Kone, B. C. Effects of NF-kappa B inhibition on mesenteric ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 284, G713-G721 (2003).
  33. Hassoun, H. T., et al. Alpha-melanocyte-stimulating hormone protects against mesenteric ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 282, G1059-G1068 (2002).
  34. Stallion, A., et al. Ischemia/reperfusion: a clinically relevant model of intestinal injury yielding systemic inflammation. J Pediatr Surg. 40, 470-477 (2005).
  35. Blikslager, A. T., Roberts, M. C., Rhoads, J. M., Argenzio, R. A. Is reperfusion injury an important cause of mucosal damage after porcine intestinal ischemia? Surgery. 121, 526-534 (1997).
  36. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
  37. Victoni, T., et al. Local and remote tissue injury upon intestinal ischemia and reperfusion depends on the TLR/MyD88 signaling pathway. Med Microbiol Immunol. 199, 35-42 (2010).
  38. Watanabe, T., et al. Toll-like receptor 2 mediates ischemia-reperfusion injury of the small intestine in adult mice. PloS one. 9, e110441 (2014).
  39. Pope, M. R., Fleming, S. D. TLR2 modulates antibodies required for intestinal ischemia/reperfusion-induced damage and inflammation. J. Immunol. 194, 1190-1198 (2015).
  40. Leung, F. W., Su, K. C., Passaro, E. Jr, Guth, P. H. Regional differences in gut blood flow and mucosal damage in response to ischemia and reperfusion. Am J Physiol. 263, G301-G305 (1992).
  41. Chiu, C. J., McArdle, A. H., Brown, R., Scott, H. J., Gurd, F. N. Intestinal mucosal lesion in low-flow states. I. A morphological, hemodynamic, and metabolic reappraisal. Arch Surg. 101, 478-483 (1970).
  42. Quaedackers, J. S., et al. An evaluation of methods for grading histologic injury following ischemia/reperfusion of the small bowel. Transplant Proc. 32, 1307-1310 (2000).
  43. Bianciardi, P., Scorza, R., Ghilardi, G., Samaja, M. Xanthine oxido-reductase activity in ischemic human and rat intestine. Free Radic Res. 38, 919-925 (2004).
  44. Yandza, T., et al. The pig as a preclinical model for intestinal ischemia-reperfusion and transplantation studies. J Surg Res. 178, 807-819 (2012).

Tags

רפואה גיליון 111 פגיעה במערכת עיכול איסכמיה רה-פרפוזיה התחדשות פיום עורק mesenteric מעולה עכבר
דגם Murine של פגיעת המעיים איסכמיה reperfusion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gubernatorova, E. O., Perez-Chanona, … More

Gubernatorova, E. O., Perez-Chanona, E., Koroleva, E. P., Jobin, C., Tumanov, A. V. Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury. J. Vis. Exp. (111), e53881, doi:10.3791/53881 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter