Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

आंतों ischemia-reperfusion की चोट के murine मॉडल

Published: May 11, 2016 doi: 10.3791/53881
Automatic Translation
1,2, 3, 1, 3, 1,2
1Trudeau Institute, 2Engelhardt Institute of Molecular Biology, 3Departments of Medicine and Infectious Diseases and Pathology, University of Florida

Summary

यहाँ हम चूहों में आंतों ischemia-reperfusion की विस्तृत प्रक्रिया है जो मृत्यु दर के बिना प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य चोट में परिणाम क्षेत्र भर में इस तकनीक के मानकीकरण के लिए प्रोत्साहित करने का वर्णन है। आंतों ischemia-reperfusion चोट के इस मॉडल की चोट और उत्थान के सेलुलर और आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।

Abstract

आंतों ischemia एक जीवन के लिए खतरा atherosclerosis, घनास्त्रता, हाइपरटेंशन, नेक्रोटाइज़िंग आंत्रशोथ, आंत्र प्रत्यारोपण, आघात और जीर्ण सूजन सहित नैदानिक ​​स्थितियों की एक व्यापक रेंज के साथ जुड़े शर्त है। आंतों ischemia reperfusion-(आईआर) चोट तीव्र mesenteric ischemia के एक परिणाम है, mesenteric वाहिकाओं के माध्यम से अपर्याप्त रक्त प्रवाह की वजह से, आंतों की नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप है। Reperfusion निम्नलिखित ischemia आगे आंत का नुकसान बढ़ा सकते हैं। आईआर चोट के तंत्र जटिल और खराब समझ रहे हैं। इसलिए, प्रयोगात्मक छोटे पशु मॉडल आईआर चोट के pathophysiology और उपन्यास उपचारों के विकास को समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं।

यहाँ हम तीव्र आंतों आईआर चोट है कि मृत्यु दर के बिना छोटी आंत की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य चोट प्रदान करता है की एक माउस मॉडल का वर्णन है। यह अस्थायी occludin से बाहर का लघ्वान्त्र के क्षेत्र में उत्प्रेरण ischemia द्वारा हासिल की हैजी बेहतर mesenteric धमनी के परिधीय और टर्मिनल जमानत के शाखाओं 60 मिनट microvascular क्लिप का उपयोग करने के लिए। 1 घंटा, या आंत ऊतकीय विश्लेषण द्वारा जांच की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य चोट में चोट परिणाम के बाद 2 घंटे के लिए reperfusion। microvascular क्लिप की उचित स्थिति प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है। इसलिए वीडियो क्लिप इस तकनीक का विस्तृत दृश्य कदम-दर-कदम विवरण प्रदान करता है। आंतों आईआर चोट के इस मॉडल की चोट और उत्थान के सेलुलर और आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।

Introduction

आंत रक्त प्रवाह जो ischemia और उपकला नुकसान का कारण बनता की रुकावट के लिए बहुत संवेदनशील है। ischemia reperfusion के बाद ऊतकों की फिर से ऑक्सीजन प्रदान करता है, और आगे की विकृति को बढ़ावा देने के कर सकते हैं। इसलिए, आंतों ischemia और चोट विकृतियों की एक विस्तृत श्रृंखला, नेक्रोटाइज़िंग आंत्रशोथ, छोटी आंत प्रत्यारोपण में allograft अस्वीकृति, उदर महाधमनी धमनीविस्फार सर्जरी, कार्डियोपल्मोनरी बाईपास, और सूजन आंत्र रोग 1,2 की जटिलताओं सहित के साथ जुड़ा हुआ है। आंतों आईआर चोट, विशेष रूप से गंभीर mesenteric ischemia, एक जीवन हालत धमकी रुग्णता और मृत्यु दर 3 में जिसके परिणामस्वरूप है।

हालांकि खराब समझ, आंतों ischemia reperfusion-(आईआर) चोट पेट microbiota में परिवर्तन के रूप में अच्छी तरह से प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों और भड़काऊ साइटोकिन्स और chemokines 1,4-6 के उत्पादन से जुड़े होने लगा है। यह दोनों के सक्रियण की ओर जाता हैनैट और अनुकूली प्रतिरक्षा तंत्र है जो सूजन और ऊतकों को चोट 1,7,8 को बढ़ावा देने के।

पशु मॉडल, आईआर चोट के तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं, क्योंकि वे आसान gain- और नुकसान के समारोह आनुवंशिक प्रयोगों अनुमति देते हैं। आईआर के कई पशु मॉडल विकसित किया गया है जो पूरी संवहनी रोड़ा, कम प्रवाह ischemia शामिल हैं, और संवहनी रोड़ा (हाल ही में एक व्यापक समीक्षा 9 में संक्षेप) खंडों। आंतों बेहतर mesenteric धमनी (SMA) की पूरी संवहनी रोड़ा की वजह से ischemia बड़े जानवरों और मूषक 9-11 में आईआर के लिए एक आसान और आमतौर पर इस्तेमाल किया मॉडल है। हालांकि, पेट के विभिन्न क्षेत्रों में चोट के अलग-अलग संवेदनशीलता है। इसके अलावा, इस्कीमिक चोट और चोट के चर डिग्री में वसूली परिणाम की अवधि में anesthetics, दर्दनाशक दवाओं, धमनी रोड़ा तकनीक के विविध रेंज है, साथ ही विसंगति कई अध्ययन भर में आईआर के जीव विज्ञान के बारे में हमारी समझ confoundingएस। तालिका 1 murine आईआर अध्ययन में इन विसंगतियों को दर्शाता है। कम इस्कीमिक बार (30-45 मिनट) का उपयोग करने से सबसे बड़ा दोष यह वसूली की खिड़की जिस पर मामलों और नियंत्रण के बीच मतभेद प्रत्यक्ष देखा जा सकता है लक्षित है। उपकला को हल्के चोट, reperfusion के बाद एक घंटे का समाधान किया जा सकता है इसलिए रोग मेट्रिक्स उपकला बहाली में मतभेदों को खोजने के लिए आवश्यक हो सकता है विशेष। इसके विपरीत, अत्यधिक क्षति, के रूप में इस्कीमिक चोट के 100 मिनट तक देखा उपकला, जहां बहाली अब संभव नहीं है की पूरी denudement में हो सकता है, मृत्यु की दर, और वसूली समय बढ़ रही है। इसलिए, यहाँ हम चूहों में आंतों आईआर की विस्तृत प्रक्रिया है जो मृत्यु दर के बिना प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य चोट में परिणाम हमारे क्षेत्र भर में इस तकनीक के मानकीकरण के लिए प्रोत्साहित करने का वर्णन है। आंतों आईआर चोट के इस मॉडल की चोट और उत्थान के सेलुलर और आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

जानवरों के अध्ययन स्वास्थ्य के दिशा निर्देशों के राष्ट्रीय संस्थान के अनुसार में प्रदर्शन कर रहे थे और संस्थागत पशु की देखभाल द्वारा अनुमोदित किया गया और Trudeau संस्थान की समिति का उपयोग करें। 8-12 सप्ताह पुरानी C57BL / 6 चूहों के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया।

1. सर्जरी के लिए तैयारी

  1. तैयार है और शल्य चिकित्सा उपकरणों बाँझ।
  2. नाक शंकु, और गर्म पैड के साथ isoflurane आधारित संज्ञाहरण प्रणाली तैयार करें। सुनिश्चित करें कि गर्म पैड गरम नहीं है (<39 डिग्री सेल्सियस)।
  3. सुनिश्चित करें कि isoflurane गैस कनस्तर सफाई सही ढंग से तैनात है कनस्तर के तल पर निकास बंदरगाहों सुनिश्चित करने के लिए अवरुद्ध या किसी भी तरह से occluded नहीं कर रहे हैं। वजन गैस कनस्तर सफाई की प्रक्रिया और कनस्तर पर दस्तावेज़ वजन से पहले। कनस्तर त्यागें जब कनस्तर वजन संचित वजन (~ 12 घंटा) की 50 ग्राम से अधिक है।

2. संज्ञाहरण

  1. एक प्रेरण कक्ष में 3% isoflurane के साथ माउस anesthetize (1 एल / मिनटहे 2)।
    1. असमर्थता द्वारा संवेदनाहारी गहराई का आकलन ईमानदार रहने के लिए, उद्देश्यपूर्ण स्वैच्छिक आंदोलन, झपकी पलटा की हानि, मांसपेशियों की छूट, और प्रतिक्रिया की हानि की हानि उत्तेजना (पैर की अंगुली या फर्म के दबाव के साथ पूंछ चुटकी) पलटा।
    2. छाती और पेट की दीवार आंदोलनों को देख कर श्वसन दर और पैटर्न का आकलन करें। इष्टतम संज्ञाहरण के तहत, सांस की दर प्रति मिनट ~ 55-65 साँस होना चाहिए।
    3. प्रेरण कक्ष से माउस निकालें और जल्दी से माउस के पेट क्षेत्र दाढ़ी।
  2. कार्निया सुखाना रोकने के लिए, आंखों में नरम नेत्र मरहम जगह है।
  3. गर्म पैड पर माउस प्लेस और संज्ञाहरण प्रणाली के लिए नाक शंकु के माध्यम से इसे कनेक्ट। सुनिश्चित करें कि लेटेक्स नाक शंकु झिल्ली मजबूती से माउस के सिर पर फिट बैठता है और वहाँ isoflurane की कोई दरार है।
  4. 1.5% isoflurane दर को कम करने, और buprenorphine (0.1 मिलीग्राम / किग्रा) और ketamine (10 मिलीग्राम / किग्रा) इंजेक्षन subcutaneously दर्द-झरना की हवा अप रोकने के लिए।
  5. साफ कर लें वेंBetadine शल्य समाधान 70% इथेनॉल के बाद से लथपथ एक बाँझ कपास झाड़ू के साथ आपरेशन क्षेत्र के ई त्वचा।

3. सर्जरी

  1. ऑपरेटिंग कैंची के साथ एक मध्य रेखा 3-5 सेमी laparotomy बनाओ। नमक के साथ सिक्त बाँझ गैर पक्षपाती पैड के साथ कवर आपरेशन क्षेत्र। Cecum और लघ्वान्त्र अलग करने और खारा में सिक्त कपास swabs का उपयोग कर बेहतर mesenteric धमनी का पर्दाफाश।
  2. क्लिप को लागू करने की सुविधा है, ठीक आईरिस का उपयोग कर ऐसा करने scissors.To बेहतर mesenteric धमनी आसपास अन्त्रपेशी में छोटे nicks बनाने, धीरे ड्रेसिंग संदंश के साथ आंत बढ़ाने के लिए और (वांछित क्लिप स्थिति पर बेहतर mesenteric धमनी के दोनों किनारों पर अन्त्रपेशी कटौती चित्रा 1 ए)। फिर, क्लिप लागू करने से पहले इच्छित क्लिप स्थिति के क्षेत्र के लिए बाँझ खारा की कुछ बूँदें जोड़ें।
    नोट: नकली सर्जरी को करने के लिए कदम करने के लिए 3.2 शल्य प्रक्रिया का पालन करें। क्लिप लागू न करें। इसके बजाय, ऊतक जोड़ा गर्म एस द्वारा नम बनाए रखने केAline के रूप में 1 घंटे के लिए 3.6 में वर्णित है। बाद में, कदम के लिए 4.1 आगे बढ़ना है,
  3. Microvascular क्लिप्स (70 ग्राम बल) एक क्लिप एप्लायर का उपयोग कर इस्कीमिक लघ्वान्त्र अंधान्त्र (चित्रा 1 बी) के निकट एक 5-7 सेमी क्षेत्र बनाने के लिए के साथ बेहतर mesenteric धमनी के पहले के आदेश शाखाओं रोक देना। हालांकि जहाजों की स्थिति रूढ़िवादी है, वहां चूहों के बीच मामूली बदलाव (चित्रा 1 पर उदाहरण देखें) हो सकता है। इसलिए, 2 या 3 क्लिप आम तौर पर आवश्यक हैं (चित्रा 1 ए, डी, ई, काला तीर पर क्लिप के स्थान देखें)।
    नोट: उच्च गुणवत्ता पोत क्लिप का प्रयोग करें। उच्च दबाव क्लिप वाहिकाओं को नुकसान पहुंचा सकते हैं और पूरी तरह से रक्त के प्रवाह को ब्लॉक नहीं है, जबकि कम दबाव क्लिप्स (<30 ग्राम) उत्थान रोका जा सकता है।
  4. आंत के बर्तन में दो microvascular क्लिप का उपयोग (40 ग्राम बल) के माध्यम से जमानत के रक्त प्रवाह को ब्लॉक, (चित्रा 1) इस्कीमिक आंत के क्षेत्र demarking। जमानत के जहाजों का रोड़ा के लिए आवश्यक हैआसन्न रक्त वाहिकाओं से रक्त की आपूर्ति को रोकने के (चित्रा 1 ए, डी, ई, हरी तीर पर क्लिप के स्थान देखें)।
  5. वैकल्पिक: हेपरिन समाधान (6 खासियत इकाइयों / एमएल), रक्त के थक्के रोकने के लिए जोड़ें। पृथक आंत को हेपरिन समाधान के 0.5 मिलीलीटर जोड़ने dropwise।
  6. गीले बाँझ गैर पक्षपाती पैड नमक के साथ नाजुक पोंछे 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्म और शल्य चिकित्सा क्षेत्र के लिए लागू होते हैं। सुनिश्चित करें कि पोंछे पूरी प्रक्रिया के दौरान गीला रहता है।
  7. 60 मिनट भर में 1-1.5% isoflurane संज्ञाहरण प्रयोग करने के लिए ischemia बनाए रखें। ischemia प्रक्रिया सही ढंग से किया जाता है, तो इस्कीमिक क्षेत्र लगभग 30 मिनट में रंग में शराब लाल करने के लिए बदल जाएगा। ध्यान दें कि रक्त वाहिकाओं क्लिप स्थिति के लिए बाहर का ischemia (चित्रा 1, सही पैनल) सफल रोड़ा का संकेत दौरान बढ़े हैं।
  8. बारीकी से ischemia चरण के दौरान माउस की निगरानी। गैर पक्षपाती सर्जरी साइट को कवर करने के लिए पैड खारा समाधान लागू करने के लिए आगे बढ़ें।
  9. निशानऊतक पर Gill`s 3 hematoxylin के 20 μl pipetting द्वारा इस्कीमिक क्षेत्र के किनारों की तुलना के लिए एक ही माउस से इस्कीमिक ऊतक और आसन्न स्वस्थ ऊतक कटाई (चित्रा 1E, सही पैनल) की सुविधा के लिए।

4. Reperfusion स्टेज

  1. ischemia के अंत में क्लिप क्षेत्र पर नमक की कुछ बूँदें जोड़ने और धीरे क्लिप एप्लायर साथ microvascular क्लिप को हटा दें। फिर, धीरे आंत वापस उदर गुहा को खारा सिक्त कपास युक्तियों का उपयोग धक्का। गैर पक्षपाती पैड निकालें और पेट की दीवार और त्वचा 9 मिमी स्टेनलेस स्टील के घाव क्लिप का उपयोग बंद कर दें। reperfusion 3 घंटा से अधिक समय से किया जाता है, तो एक absorbable vicryl सीवन का उपयोग त्वचा पर घाव क्लिप लागू करने से पहले पेट की दीवार बंद हुआ।
  2. reperfusion चरण के लिए समय के वांछित राशि (30 मिनट, 60 मिनट, 120 मिनट, या 180 मिनट) के लिए एक गर्म साफ पिंजरे में चूहों को बनाए रखें।
  3. जानवरों के कम से कम हर 30 मिनट स्थिरता को आश्वस्त करने के लिए जाँच करें।
  1. सीओ द्वारा चूहों euthanize 2 अधिक मात्रा reperfusion निम्न वांछित समय में गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा पीछा किया।
  2. उदर गुहा खोलें और आगे के विश्लेषण के लिए इस्कीमिक आंतों के ऊतकों इकट्ठा। हार्वेस्ट सामान्य स्वस्थ ऊतकों को चोट करने के लिए किसी भी प्रणालीगत प्रतिक्रिया के लिए खाते में एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में घायल ऊतक से सटे।
    नोट: यह नियंत्रण से नकली नियंत्रण चूहों संचालित क्योंकि दिखावा संचालित चूहों आईआर प्रेरित चोट के लिए एक प्रणालीगत प्रतिक्रिया से गुजरना नहीं है और अधिक उपयुक्त है।
  3. longitudinally आंत जुड़ी gavage नमक से भरे और फिर सुई के साथ 30 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर काट आंत्र संबंधी सामग्री को धो लें। आंत का एक नमूना जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए आवश्यक है, एक 1.5 मिमी टुकड़ा longitudinally कटौती, और ऊतकीय विश्लेषण के लिए शेष टुकड़े का उपयोग करें।
  4. ऊतकीय विश्लेषण के लिए, intest रोल करने के लिए संदंश की एक जोड़ी का उपयोग कर एक स्विस रोल तैयारine।
  5. लुढ़का फार्म को बनाए रखने के लिए, ऊतक कैसेट में बायोप्सी फोम पैड (चित्रा 2) के बीच आंत के टुकड़े जगह है। 10% बफर formalin में कैसेट रखें।
  6. कम से कम 24 घंटे के लिए formalin में ऊतक को ठीक करें। एक अतिरिक्त 24 घंटे के लिए 70% इथेनॉल के साथ formalin बदलें। कमरे के तापमान पर 70% इथेनॉल अनिश्चित काल में स्टोर ऊतक।
  7. आयल में एम्बेड, 5 माइक्रोन वर्गों में कटौती और hematoxylin और eosin एक मानक प्रोटोकॉल (चित्रा 3) का उपयोग कर के साथ दाग।

6. स्कोरिंग

  1. स्कोर murine ischemia-reperfusion चोट तालिका 2 में संक्षेप के रूप में। एक उपयुक्त स्कोरिंग विधि चुनें।
  2. वैकल्पिक: चार वर्गों में देखने के क्षेत्र फूट डालो के बाद से चोट की गंभीरता अनुभाग भर में बदलता है।
  3. आँख बंद करके प्राप्त अंक से प्रत्येक अनुभाग के औसत दर्जे की गणना।
  4. मामलों और नियंत्रण के बीच घायल ऊतक के ग्रेड की तुलना के साथ ही वेंई एक Kruskal वालिस टेस्ट, एक डन एकाधिक तुलना परीक्षण के बाद का उपयोग ऊतक रिहाई।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

हम चूहों में लघ्वान्त्र की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य आईआर प्रेरित चोट प्राप्त करने के लिए आईआर सर्जरी की प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल अनुकूलित। प्रतिनिधि परिणाम इस खंड में प्रदर्शन कर रहे हैं।

चित्रा 1 microvascular क्लिप स्थिति का उदाहरण लघ्वान्त्र के ischemia के लिए प्रेरित करने से पता चलता है। काला तीर मुख्य क्लिप बेहतर mesenteric धमनी के पहले के आदेश शाखाओं occluding की स्थिति को दिखाने के लिए। ग्रीन तीर अतिरिक्त क्लिप की स्थिति जमानत के जहाजों से रक्त की आपूर्ति को ब्लॉक करने के लिए दिखा। नोट क्लिप स्थिति और intestinte की इस्कीमिक क्षेत्र का रंग बदलने के बाहर अवरोधित वाहिकाओं की वृद्धि हुई आकार। ischemia रक्त वाहिकाओं के अंत में क्लिप को हटाने के बाद रक्त के प्रवाह को वापस पाने और सामान्य आकार में वापस।

चित्रा 2 चोर से तैयार स्विस रोल युक्त एक ऊतक कैसेट का एक उदाहरण से पता चलता हैtrol और ischemia के 1 घंटे के बाद लघ्वान्त्र, reperfusion की एक 1 घंटा द्वारा पीछा इस्कीमिक क्षेत्रों के। तिल्ली का एक टुकड़ा प्रसंस्करण और धुंधला दौरान नियंत्रण और आईआर आंत की स्थिति की सुविधा के लिए शामिल किया गया था। नोट नियंत्रण और इस्कीमिक ऊतक के बीच रंग अंतर।

चित्रा 3 नियंत्रण और ischemia के 1 घंटा, या reperfusion की एक 2 घंटा के द्वारा पीछा ischemia के 1 घंटे के बाद लघ्वान्त्र के इस्कीमिक क्षेत्रों के प्रतिनिधि hematoxylin और eosin धुंधला से पता चलता। नोट रक्तस्रावी विल्ली, तहखाने की पृथक पूरा करने के लिए आंशिक साथ उपकला denudement, और प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ (तारांकन) द्वारा विशेषता ischemia के 1 घंटे के बाद उपकला की गंभीर क्षति। reperfusion विल्ली नुकसान और सूजन की एक 2 घंटे के बाद जारी रहती है (तारांकन), लेकिन कोई ऊतक नकसीर है।

चित्रा 4 भड़काऊ सीवाई के विश्लेषण का एक उदाहरण दिखाता है1 घंटा और इस्कीमिक और नियंत्रण आंत में ischemia-reperfusion के बाद 2 घंटा पर tokines अभिव्यक्ति। 1 घंटा और 2 घंटा पर TNF, आईएल -1 बी, आईएल -6 और CXCL2 की mRNA अभिव्यक्ति की upregulation नोट ischemia-reperfusion स्वस्थ ऊतकों को नियंत्रित करने के लिए तुलना करने के बाद।

आकृति 1
चित्रा 1: ischemia की प्रेरण संवहनी क्लिप का उपयोग (ए) Cecum और लघ्वान्त्र युक्त आंत के अलग क्षेत्र।। बेहतर mesenteric धमनी आसपास अन्त्रपेशी में छोटे कटौती क्लिप आवेदन की सुविधा के लिए बना रहे हैं। (बी) क्लिप एप्लायर का उपयोग कर माईक्रवैस्कुलर क्लिप आवेदन। (सी) बेहतर mesenteric धमनी पर microvascular क्लिप की स्थिति ischemia प्रेरित करने के लिए। (डी, ई)। वाहिका संरचना और विभिन्न चूहों में क्लिप स्थिति के उदाहरण हैं। तीर लघ्वान्त्र hematoxylin द्वारा चिह्नित की इस्कीमिक क्षेत्र से संकेत मिलता है। <एक href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53881/53881fig1large.jpg" लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:।। ऊतकीय विश्लेषण के ऊतक reperfusion की एक 1 घंटा से पीछा ischemia के 1 घंटे के बाद लघ्वान्त्र के इस्कीमिक और नियंत्रण क्षेत्रों से तैयार स्विस रोल युक्त कैसेट के लिए ऊतक तैयार यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: Hematoxylin और ischemia Hematoxylin के बाद Ileum की Eosin धुंधला और ischemia के 1 घंटा, या ischemia के 1 घंटे के बाद लघ्वान्त्र का नियंत्रण है और इस्कीमिक क्षेत्रों के eosin धुंधला हो जाना।reperfusion की एक 2 घंटा द्वारा पीछा किया। सलाखों = 500 माइक्रोन (शीर्ष पैनल), 200 माइक्रोन (नीचे पैनल)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। के दौरान ischemia-reperfusion CXCL2, TNF, आईएल -6 की अभिव्यक्ति, आईएल -1 बी 1 घंटा और इस्कीमिक ऊतक (आईआर) में ischemia-reperfusion के बाद 2 घंटा और सामान्य नियंत्रण के ऊतकों (सी) में मापा गया था भड़काऊ साइटोकिन्स की अभिव्यक्ति वास्तविक समय पीसीआर द्वारा इस्कीमिक क्षेत्र से सटे। n = 3 - 8 समूह प्रति चूहों, * पी <0.05; ** पी <0.01; *** पी <0.001। त्रुटि सलाखों प्रतिनिधित्व SEM कृपया यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

murine प्रजाति संज्ञाहरण / Analgesia धमनी रोड़ा विधि ischemia समय Reperfusion के बाद समय संदर्भ
Sprague-Dawley चूहों सोडियम pentobarbital एसएमए और सीलिएक धमनी का रोड़ा धमनीविस्फार क्लिप या दबाना का उपयोग 45 मिनट 2 घंटा 12
C57BL6 / 129 2% halothane mesenteric धमनियों का रोड़ा, और समीपस्थ और इस्कीमिक ऊतक के बाहर का अंश। 30 करने के लिए 130 मिनट 6 घंटा 13
C57BL / 6 अक्स, isoflurane SMA का रोड़ा धमनीविस्फार क्लिप का उपयोग कर। जमानत के circul का रोड़ासमीपस्थ और बाहर के क्षेत्रों में व्यावहारिक। 1 घंटा 1.5 घंटे 4,8,11
C3H / Hej सोडियम pentobarbital धमनीविस्फार क्लिप या दबाना का उपयोग रोड़ा 40 मिनट 6 घंटा 14
C56BL / 6 isoflurane एसएमए और ileocolic धमनी का रोड़ा धमनीविस्फार क्लिप या दबाना का उपयोग 100 मिनट 1, 2, 4, 24 घंटा 15
C57BL / 6 urethane धमनीविस्फार क्लिप या दबाना का उपयोग रोड़ा 45 मिनट 60 मिनट 16

तालिका 1: Murine आंतों आईआर प्रेरित चोट में कार्यप्रणाली में बदलाव

प्रोटोकॉल स्कोरिंग प्रणाली संदर्भ
ग्रेड 0: सामान्य म्यूकोसा 13,17,18
1 ग्रेड: विलस नोक पर Subepithelial अंतरिक्ष
ग्रेड 2: और अधिक विस्तारित subepithelial अंतरिक्ष
3 ग्रेड: विलस पक्षों के साथ उपकला उठाने
ग्रेड 4: denuded विल्ली
ग्रेड 5: विलस के ऊतकों का नुकसान
ग्रेड 6: तहखाना परत रोधगलन
ग्रेड 7: Transmucosal रोधगलन
ग्रेड 8: ट्रांसमुरल रोधगलन
ग्रेड 0: सामान्य म्यूकोसा 4,8,11,19-21
1 ग्रेड: विलस सुझावों पर कोशिकाओं के sloughing
3 ग्रेड: Villi अनुपस्थित थे, लेकिन तहखाने अभी भी आसानी से पहचाने जाने थे
ग्रेड 4: उपकला संरचनाओं और transmural नेक्रोसिस के पूर्ण अभाव
ग्रेड 0: सामान्य अंकुर 6,22-31
1 ग्रेड: Villi टिप विरूपण के साथ
ग्रेड 2: जाम कोशिकाओं और Gugenheims 'रिक्त स्थान याद कर रहे हैं
3 ग्रेड: Villi उपकला कोशिकाओं के विघटन के साथ बद
ग्रेड 4: उजागर साथ Villi, लेकिन बरकरार लामिना propria उपकला कोशिका sloughing साथ
ग्रेड 5: लामिना propria exuding है
ग्रेड 6: Villi कि प्रदर्शन रक्तस्राव या विल्ली है कि denuded रहे हैं
ग्रेड 0: सामान्य ऊतक विज्ञान 32,33
1 ग्रेड: सतह उपकला के थोड़ा सा व्यवधान
ग्रेड 2: अंकुर नोक पर उपकला सेल नुकसान चोट
3 ग्रेड: श्लैष्मिक vasocongestion, नकसीर, और विल्ली के आधे से भी कम के नुकसान के साथ फोकल नेक्रोसिस
ग्रेड 4: नुकसान विल्ली के एक से अधिक साढ़े लिए बढ़ा

तालिका 2: Murine आंतों आईआर प्रेरित चोट में प्रोटोकॉल स्कोरिंग प्रणाली

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

आंतों आईआर चोट के माउस मॉडल के विकास के बहुत ऊतक चोट के तंत्र की समझ में सुधार हुआ है और संभावित चिकित्सीय रणनीतियों के विकास में सहायता प्राप्त ऊतकों को नुकसान 7,9,11,34 को कम करने की है। इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम microvascular क्लिप की उचित स्थिति, आईआर चोट के ischemia और उचित histologic मूल्यांकन का सही समय हैं।

ischemia की अवधि के बाद उपकला क्षति के लिए महत्वपूर्ण है। ठेठ रुग्णता और मृत्यु दर प्रयोगात्मक चूहों के बिना प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य आईआर चोट प्रेरित करने के लिए आवश्यक समय 45-60 मिनट एक 2-3 मानव संसाधन reperfusion द्वारा पीछा किया। ischemia की विस्तारित अवधि मई उपकला और वृद्धि की मृत्यु का पूरा नुकसान में परिणाम है। उदाहरण के लिए, मध्यांत्रीय ischemia के एक सुअर का मॉडल में, 60 मिनट रोड़ा विला उपकला के आंशिक नुकसान में, परिणामस्वरूप 120 मिनट के लिए रोड़ा अंकुर उपकला 35 का पूरा नुकसान के लिए नेतृत्व किया है, जबकि। मैंmportantly, रोगाणु मुक्त और आनुवंशिक रूप से चालाकी से चूहों आईआर चोट, और ischemia और इसलिए इष्टतम समय के लिए एक वृद्धि की संवेदनशीलता प्रदर्शित कर सकता प्रारंभिक प्रयोगों में अनुकूलित किया जाना पड़ सकता है। हालांकि reperfusion के बाद ऊतकों को नुकसान के मूल्यांकन के लिए विशिष्ट समय 2-3 घंटा, लंबे समय (12 घंटे) है आंतों स्टेम सेल लामबंदी 36 के विश्लेषण के लिए आवश्यक है। इसके अतिरिक्त, खानेवाला माइक्रोबायोटा और TLR / इशारा मध्यस्थता संकेतन में परिवर्तन काफी आईआर चोट 4,8,37-39 के के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं।

microvascular क्लिप की उचित स्थिति भी प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य आईआर चोट के लिए महत्वपूर्ण है। यहाँ हम murine बाहर का लघ्वान्त्र के आईआर चोट के मॉडल का वर्णन है। आंत के अलग हिस्सों आईआर चोट करने के लिए अलग-अलग संवेदनशीलता प्रदर्शित करने के लिए जाना जाता है। उदाहरण के लिए, सूखेपन लघ्वान्त्र और पेट के 9,34,40 से आईआर चोट के प्रति संवेदनशील है। वास्तव में, सूखेपन की ischemia reperfusion-मॉडल के लिए एक एकल के साथ SMA occluding द्वाराक्लिप सामान्यतः आईआर चोट के तंत्र का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है (पशुओं में आईआर चोट के विभिन्न तरीकों के लिए एक व्यापक समीक्षा के लिए रेफरी देखते हैं। 9)। हालांकि, और क्लिप की सटीक स्थिति आंत के विभिन्न वर्गों के विश्लेषण, साथ ही संज्ञाहरण के विभिन्न तरीकों इन अध्ययनों के बीच होती है, यह मुश्किल पुन: पेश करने (1 टेबल देखें) कर रही है। सूखेपन की आईआर चोट का एक अतिरिक्त जटिलता उच्च मृत्यु एसएमए की जड़ को बंद संवहनी क्लिप की स्थिति आंत के व्यापक क्षेत्र को रक्त की आपूर्ति को प्रभावित करता है के बाद से है। इसलिए, वर्तमान अध्ययन में हम टर्मिनल शेषान्त्र, जो पुन: पेश करने के लिए आसान है के अनुरूप आईआर चोट प्रेरित करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित की है। लघ्वान्त्र की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य आईआर चोट प्रेरित करने के लिए, संवहनी क्लिप की उचित स्थिति गंभीर है। इस आईआर चोट के बेहतर mesenteric artery.The डिग्री के परिधीय और जमानत के शाखाओं occluding द्वारा हासिल की है मूल चिऊ ​​/ PAR का उपयोग कर hematoxylin और eosin वर्गों के मूल्यांकन के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता हैकश्मीर या संशोधित स्कोर सिस्टम 11,18,34,41,42। इसके अतिरिक्त, ऊतकों को नुकसान के मूल्यांकन myeloperoxidase गतिविधि या जीआर का उपयोग कर neutrophils के प्रतिरक्षाऊतकरसायन मूल्यांकन को मापने के द्वारा टर्मिनल deoxynucleotidyl ट्रांसफेरेज़ बायोटिन dUTP निक अंत लेबलिंग (TUNEL) खंडित डीएनए, या सक्रिय कस्पासे 3 immunohistochemical धुंधला, न्यूट्रोफिल के विश्लेषण के धुंधला का उपयोग किया जा सकता है -1, या Ly6G एंटीबॉडी 7,11 धुंधला हो जाना। ऐसे आईएल -1 बी, के रूप में भड़काऊ साइटोकिन्स और chemokines, TNF, आईएल -6, CXCL1, CXCL2, CCL2 वास्तविक समय पीसीआर 2,4,8 द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। भड़काऊ साइटोकाइन अभिव्यक्ति के विश्लेषण का एक उदाहरण चित्रा 4 पर दिखाया गया है।

यह ध्यान रखें कि उच्च reproducibility और लघ्वान्त्र के आईआर चोट की पहुंच के बावजूद, इस मॉडल मानव रोग के सभी नैदानिक ​​लक्षण, विशेष रूप से पुरानी बीमारी की स्थिति और बेहतर mesenteric धमनी 9 के आंशिक रोड़ा साथ परिस्थितियों में प्रतिबिंबित नहीं कर सकते महत्वपूर्ण है 9,43 दौरान प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन में मध्यस्थता के स्तर हैं। इसलिए, इस तरह सूअरों के रूप में बड़े जानवरों, का उपयोग कर मॉडल 9,44 विकसित किया जा रहा है। मानव की स्थिति का अध्ययन किया जा रहा है पर निर्भर करता है पशु मॉडल का चयन सावधानी से महत्वपूर्ण है। सारांश में, हम आंतों आईआर चोट जो उपकला चोट और उत्थान के सेलुलर और आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता का एक आसान और मजबूत मॉडल का वर्णन है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

यह काम रूस विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था, कोई अनुदान। 14-50-00060 और LLC RUSCHEMBIO। यह काम भी अमेरिका के Crohn`s और कोलाइटिस फाउंडेशन 294083 (एवीटी करने के लिए), और एनआईएच अनुदान RO1 DK47700 द्वारा अनुदान (मुख्य न्यायाधीश) द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Heated Pad Sunbeam E12107-819 Alternative: Braintree Scientific heated pad
Table top research anesthesia Machine Vasco UCAP 0001-0000171 Alternative: Parkland Scientific, V3000PS
Nose Cone Parkland Scientific ARES500
Scavenger canister and replacement cartridge Parkland Scientific 80000, 80120
Induction Chamber Surgivet V711802
Isoflurane Piramal Healthcare NDC 66794-013-10 Controlled substance, contact IACUC
Animal clipper  Oster  Oster Golden A5 078005-050-003
Ophthalmic ointment Webster 8804604
Buprenorphine McKesson 562766 Controlled substance,contact IACUC
Ketaset (Ketamine HCl) Pfizer NADA 45-290 Controlled substance, contact IACUC
Cotton tips Puritan medical products 806-WC Autoclave before use
Betadine Purdue Products 67618-150-17 10% Povidone-Iodine
Sterile saline solution Aspen 46066-807-60 Adjust to room temperature before use
IR rodent thermometer BIOSEB BIO-IRB153
Micro vascular clips, 70 g Roboz Surgical  RS5424, RS5435 Alternative: WPI 14121, for SMA occlusion
Micro vascular clips, 40 g Roboz Surgical  RS6472 Alternative:WPI 14120, for collateral vessels occlusion
Clip applying forceps World Precision Instruments 14189 Alternative: Roboz #RS-5410 or  #RS-5440
Gill's 3 hematoxylin Thermo Scientific 14-390-17
Surgical staples, Reflex 9 mm Cell Point Scientific 201-1000
Autoclip applier Beckton Dickinson 427630
Byopsy foam pad Simport M476-1
Tissue cassette Fisher Healthcare 15182701A Histosette II combination lid and base
10% buffered formalin Fisher Scientific 245-684
Surgical iris scissors World Precision Instruments 501263-G SC Alternative: Roboz RS6816
Operating scissors World Precision Instruments 501219-G Alternative: Roboz RS6814
Dressing forceps Roboz Surgical  RS-5228, RS-8122 Alternative: World Precision Instruments 1519-G
Heparin, endotoxin free, 300 USP units/vial, 50 mg Sigma 2106
Reflex wound clip removing forceps Roboz Surgical  RS-9263 Alternative: World Precision Instruments: 500347
Mice C57BL/6J mice  Jackson Laboratory Stock No 0664
Telfa non-adherent dressings, 3 x 4, sterile Coviden 1050
Fisherbrand transfer pipets Fischer Scientific 13-711-5AM Use pipets to dropwise add saline

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nat Med. 17, 1391-1401 (2011).
  2. Lenaerts, K., et al. New insights in intestinal ischemia-reperfusion injury: implications for intestinal transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 18, 298-303 (2013).
  3. Yasuhara, H. Acute mesenteric ischemia: the challenge of gastroenterology. Surg Today. 35, 185-195 (2005).
  4. Perez-Chanona, E., Muhlbauer, M., Jobin, C. The microbiota protects against ischemia/reperfusion-induced intestinal injury through nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 2 (NOD2) signaling. Am J Pathol. 184, 2965-2975 (2014).
  5. Lee, H., et al. Delineating the relationships among the formation of reactive oxygen species, cell membrane instability and innate autoimmunity in intestinal reperfusion injury. Mol Immunol. 58, 151-159 (2014).
  6. Yoshiya, K., et al. Depletion of gut commensal bacteria attenuates intestinal ischemia/reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 301, G1020-G1030 (2011).
  7. Wu, M. C., et al. The receptor for complement component C3a mediates protection from intestinal ischemia-reperfusion injuries by inhibiting neutrophil mobilization. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 9439-9444 (2013).
  8. Muhlbauer, M., Perez-Chanona, E., Jobin, C. Epithelial cell-specific MyD88 signaling mediates ischemia/reperfusion-induced intestinal injury independent of microbial status. Inflamm Bowel Dis. 19, 2857-2866 (2013).
  9. Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: progress and promise for translational research. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308, G63-G75 (2015).
  10. Megison, S. M., Horton, J. W., Chao, H., Walker, P. B. A new model for intestinal ischemia in the rat. J Surg Res. 49, 168-173 (1990).
  11. Goldsmith, J. R., et al. Intestinal epithelial cell-derived mu-opioid signaling protects against ischemia reperfusion injury through PI3K signaling. Am J Pathol. 182, 776-785 (2013).
  12. Cuzzocrea, S., et al. Glycogen synthase kinase-3beta inhibition attenuates the development of ischaemia/reperfusion injury of the gut. Intensive Care Med. 33, 880-893 (2007).
  13. Farber, A., et al. A specific inhibitor of apoptosis decreases tissue injury after intestinal ischemia-reperfusion in mice. J Vasc Surg. 30, 752-760 (1999).
  14. Ben, D. F., et al. TLR4 mediates lung injury and inflammation in intestinal ischemia-reperfusion. J Surg Res. 174, 326-333 (2012).
  15. Watson, M. J., et al. Intestinal ischemia/reperfusion injury triggers activation of innate toll-like receptor 4 and adaptive chemokine programs. Transplant Proc. 40, 3339-3341 (2008).
  16. Watanabe, T., et al. Activation of the MyD88 signaling pathway inhibits ischemia-reperfusion injury in the small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303, G324-G334 (2012).
  17. Murayama, T., et al. JNK (c-Jun NH2 terminal kinase) and p38 during ischemia reperfusion injury in the small intestine. Transplantation. 81, 1325-1330 (2006).
  18. Park, P. O., Haglund, U., Bulkley, G. B., Falt, K. The sequence of development of intestinal tissue injury after strangulation ischemia and reperfusion. Surgery. 107, 574-580 (1990).
  19. Jilling, T., Lu, J., Jackson, M., Caplan, M. S. Intestinal epithelial apoptosis initiates gross bowel necrosis in an experimental rat model of neonatal necrotizing enterocolitis. Pediatr Res. 55, 622-629 (2004).
  20. Aprahamian, C. J., Lorenz, R. G., Harmon, C. M., Dimmit, R. A. Toll-like receptor 2 is protective of ischemia-reperfusion-mediated small-bowel injury in a murine model. Pediatr Crit Care Med. 9, 105-109 (2008).
  21. Tatum, P. M., Harmon, C. M., Lorenz, R. G., Dimmitt, R. A. Toll-like receptor 4 is protective against neonatal murine ischemia-reperfusion intestinal injury. J Pediatr Surg. 45, 1246-1255 (2010).
  22. Fleming, S. D., et al. Anti-phospholipid antibodies restore mesenteric ischemia/reperfusion-induced injury in complement receptor 2/complement receptor 1-deficient mice. J. Immunol. 173, 7055-7061 (2004).
  23. Fleming, S. D., et al. Mice deficient in complement receptors 1 and 2 lack a tissue injury-inducing subset of the natural antibody repertoire. J. Immunol. 169, 2126-2133 (2002).
  24. Lapchak, P. H., et al. Platelets orchestrate remote tissue damage after mesenteric ischemia-reperfusion. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, G888-G897 (2012).
  25. Rehrig, S., et al. Complement inhibitor, complement receptor 1-related gene/protein y-Ig attenuates intestinal damage after the onset of mesenteric ischemia/reperfusion injury in mice. J. Immunol. 167, 5921-5927 (2001).
  26. Hoffman, S. M., Wang, H., Pope, M. R., Fleming, S. D. Helicobacter infection alters MyD88 and Trif signalling in response to intestinal ischaemia-reperfusion. Exp Physiol. 96, 104-113 (2011).
  27. Moses, T., Wagner, L., Fleming, S. D. TLR4-mediated Cox-2 expression increases intestinal ischemia/reperfusion-induced damage. J Leukoc Biol. 86, 971-980 (2009).
  28. Feinman, R., et al. HIF-1 mediates pathogenic inflammatory responses to intestinal ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 299, G833-G843 (2010).
  29. Lapchak, P. H., et al. The role of platelet factor 4 in local and remote tissue damage in a mouse model of mesenteric ischemia/reperfusion injury. PloS one. 7, e39934 (2012).
  30. Wen, S. H., et al. Ischemic postconditioning during reperfusion attenuates intestinal injury and mucosal cell apoptosis by inhibiting JAK/STAT signaling activation. Shock. 38, 411-419 (2012).
  31. Wang, F., et al. Temporal variations of the ileal microbiota in intestinal ischemia and reperfusion. Shock. 39, 96-103 (2013).
  32. Zou, L., Attuwaybi, B., Kone, B. C. Effects of NF-kappa B inhibition on mesenteric ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 284, G713-G721 (2003).
  33. Hassoun, H. T., et al. Alpha-melanocyte-stimulating hormone protects against mesenteric ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 282, G1059-G1068 (2002).
  34. Stallion, A., et al. Ischemia/reperfusion: a clinically relevant model of intestinal injury yielding systemic inflammation. J Pediatr Surg. 40, 470-477 (2005).
  35. Blikslager, A. T., Roberts, M. C., Rhoads, J. M., Argenzio, R. A. Is reperfusion injury an important cause of mucosal damage after porcine intestinal ischemia? Surgery. 121, 526-534 (1997).
  36. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
  37. Victoni, T., et al. Local and remote tissue injury upon intestinal ischemia and reperfusion depends on the TLR/MyD88 signaling pathway. Med Microbiol Immunol. 199, 35-42 (2010).
  38. Watanabe, T., et al. Toll-like receptor 2 mediates ischemia-reperfusion injury of the small intestine in adult mice. PloS one. 9, e110441 (2014).
  39. Pope, M. R., Fleming, S. D. TLR2 modulates antibodies required for intestinal ischemia/reperfusion-induced damage and inflammation. J. Immunol. 194, 1190-1198 (2015).
  40. Leung, F. W., Su, K. C., Passaro, E. Jr, Guth, P. H. Regional differences in gut blood flow and mucosal damage in response to ischemia and reperfusion. Am J Physiol. 263, G301-G305 (1992).
  41. Chiu, C. J., McArdle, A. H., Brown, R., Scott, H. J., Gurd, F. N. Intestinal mucosal lesion in low-flow states. I. A morphological, hemodynamic, and metabolic reappraisal. Arch Surg. 101, 478-483 (1970).
  42. Quaedackers, J. S., et al. An evaluation of methods for grading histologic injury following ischemia/reperfusion of the small bowel. Transplant Proc. 32, 1307-1310 (2000).
  43. Bianciardi, P., Scorza, R., Ghilardi, G., Samaja, M. Xanthine oxido-reductase activity in ischemic human and rat intestine. Free Radic Res. 38, 919-925 (2004).
  44. Yandza, T., et al. The pig as a preclinical model for intestinal ischemia-reperfusion and transplantation studies. J Surg Res. 178, 807-819 (2012).

Tags

चिकित्सा अंक 111 आंतों की चोट ischemia reperfusion उत्थान laparotomy बेहतर mesenteric धमनी माउस
आंतों ischemia-reperfusion की चोट के murine मॉडल
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gubernatorova, E. O., Perez-Chanona, … More

Gubernatorova, E. O., Perez-Chanona, E., Koroleva, E. P., Jobin, C., Tumanov, A. V. Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury. J. Vis. Exp. (111), e53881, doi:10.3791/53881 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter