Summary
Her beskriver vi detaljert prosedyre for intestinal iskemi-reperfusjon hos mus som resulterer i reproduserbar skade uten dødelighet for å oppmuntre til standardisering av denne teknikken på tvers av feltet. Denne modellen av intestinal ischemi-reperfusjonsskade kan benyttes for å studere de cellulære og molekylære mekanismer for skader og regenerering.
Abstract
Intestinal iskemi er en livstruende tilstand som er forbundet med et bredt spekter av kliniske tilstander, inkludert aterosklerose, trombose, hypotensjon, nekrotiserende enterokolitt, tarm transplantasjon, traumer og kronisk betennelse. Intestinal ischemi-reperfusjon (IR) skade er en konsekvens av akutt mesenterisk ischemi, forårsaket av utilstrekkelig blodstrøm gjennom den mesenteriske fartøy, noe som resulterer i intestinal skade. Reperfusjon etter ischemi kan ytterligere forverre skaden av tarmen. Mekanismene for IR skade er komplekse og dårlig forstått. Derfor eksperimentelle små dyremodeller er avgjørende for forståelsen av patofysiologien av IR skade og utvikling av nye terapier.
Her beskriver vi en musemodell for akutt tarm IR skade som gir reproduserbare skade av tynntarmen uten dødelighet. Dette oppnås ved å fremkalle iskemi i området ved den distale ileum ved temporært occluding de perifere og terminal sikkerhet grener av den overlegne mesenteric arterien for 60 min ved hjelp av mikrovaskulære klipp. Reperfusjon i 1 time eller 2 timer etter skaden fører reproduserbare skade av tarmen undersøkt ved histologisk analyse. Riktig plassering av mikrovaskulære klipp er avgjørende for inngrepet. Derfor videoklippet gir en detaljert visuell trinn-for-trinn beskrivelse av denne teknikken. Denne modellen av intestinal IR skade kan bli anvendt for å studere de cellulære og molekylære mekanismer for skader og regenerering.
Introduction
Tarmen er svært følsom for avbrudd av blodstrømmen som fører til iskemi og epitelskade. Reperfusjon etter ischemi gir re-oksygenering av vev, og kan ytterligere å fremme patologi. Derfor er intestinal ischemi og reperfusjon skade i forbindelse med et bredt spekter av patologier, som blant annet nekrotiserende enterokolitt, allograft avvisning i tynntarm transplantasjon, komplikasjoner ved abdominal aortaaneurisme kirurgi, kardiopulmonal bypass, og inflammatorisk tarmsykdom 1,2. Tarm IR skade, spesielt akutt mesenteric iskemi, er en livstruende tilstand som resulterer i sykelighet og dødelighet tre.
Selv om dårlig forstått, er intestinal ischemi-reperfusjon (IR) skade antas å være assosiert med endringer i tarmbakterieflora, så vel som produksjon av reaktive oksygenforbindelser og inflammatoriske cytokiner og kjemokiner 1,4-6. Dette fører til aktivering av bådeNate og adaptive immunmekanismer som fremmer inflammasjon og vevsskade 1,7,8.
Dyremodeller er avgjørende for å forstå mekanismene for IR skader, som de tillater enkel gevinst-og tap-av-funksjon genetiske eksperimenter. Flere dyremodeller av IR har blitt utviklet som inkluderer komplett vaskulær okklusjon, lav vannføring iskemi, og segmentert vaskulær okklusjon (oppsummert i en fersk omfattende gjennomgang 9). Intestinal iskemi forårsaket av komplett vaskulær okklusjon av superior mesenteric arterie (SMA) er en enkel og mye brukt modell for IR i store dyr og gnagere 9-11. Men forskjellige områder av tarmen har forskjellig følsomhet overfor skade. I tillegg har variert utvalg av bedøvelsesmidler, smertestillende midler, arterie okklusjon teknikker, samt inkonsekvens i varigheten av iskemisk skade og utvinning resultat i varierende grader av skade konfunderende vår forståelse av biologi IR tvers av flere studies. Tabell 1 viser disse uoverensstemmelser i murine IR studier. Den største ulempen av å bruke kortere iskemiske ganger (30-45 min) er rettet mot vinduet for utvinning hvorpå merkbar forskjell mellom saker og kontroller kan observeres. Mild skade på epitel kan løses en time etter reperfusjon, derfor spesialisert patologiske beregninger kan være nødvendig for å finne forskjeller i epitel restitusjon. I motsetning til dette, overdreven skade, som vist ved 100 min av iskemisk skade kan resultere i fullstendig denudement av epitel, hvor gjenopprettelse er ikke lenger mulig, noe som øker dødeligheten, og utvinning tid. Derfor, her beskriver vi detaljert prosedyre for tarm IR hos mus som resulterer i reproduserbar skade uten dødelighet for å oppmuntre til standardisering av denne teknikken over vårt felt. Denne modellen av intestinal IR skade kan bli anvendt for å studere de cellulære og molekylære mekanismer for skader og regenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrestudier ble utført i henhold til National Institute of Health retningslinjer og ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité i Trudeau Institute. 8-12 uker gamle C57BL / 6 mus ble anvendt for undersøkelsen.
1. Forberedelse til kirurgi
- Forbered og sterilisere kirurgiske instrumenter.
- Forbered isofluran basert anestesi system med nesen membran, og oppvarmet pad. Pass på at oppvarmet puten ikke er overopphetet (<39 ° C).
- Kontroller at isofluran gass spylebeholderen er riktig plassert for å sikre eksosportene på bunnen av beholderen ikke er blokkert eller tilstoppet på noen måte. Vei gass spylebeholderen før prosedyren og dokumentere vekt på beholderen. Kast beholderen når beholderen vekten overstiger 50 g av akkumulert vekt (~ 12 timer).
2. Anestesi
- Bedøve mus med 3% isofluran i en induksjonskammeret (1 l / minO 2).
- Vurdere anestesidybden ved en manglende evne til å holde seg oppreist, til tap av målrettet viljestyrte bevegelser, tap av blunkerefleksen, muskelavslapning, og tap av respons reflex stimulering (tå eller hale knipe med fast trykk).
- Vurdere respirasjonsfrekvens og mønster ved å observere brystveggen og magebevegelser. Under optimale anestesi, bør pustefrekvensen være ~ 55-65 pust per min.
- Fjern musen fra induksjonskammeret og raskt barbere magen området av musen.
- For å hindre hornhinnen uttørking, plasserer blid oftalmisk salve i øynene.
- Plasser musen på den oppvarmede pad og koble den via nesen membran til anestesi system. Sørg for at latex nesen membran membran fast passer over hodet på musen og det er ingen lekkasje av isofluran.
- Reduser isofluran rente til 1,5%, og injisere buprenorfin (0,1 mg / kg) og ketamin (10 mg / kg) subkutant for å hindre avvikling av smerte-kaskade.
- Tørk the hud av operasjonsområdet med en steril bomullsdott dynket med Betadine kirurgisk løsning, etterfulgt av 70% etanol.
3. Surgery
- Lag en midtlinjen 3-5 cm laparotomi med drifts saks. Cover operasjonsområdet med sterilt ikke-klebende pad fuktet med saltvann. Isoler cecum og ileum og utsette den overlegne mesenteric arterien ved hjelp av bomullspinner fuktet i saltvann.
- For å lette påføring av klippet, gjør små hakk i mesenteriet omgir den store mesenteriske arterie hjelp av gode iris scissors.To gjøre dette, forsiktig heve tarmen med dressing pinsett og kutte mesenteriet på begge sider av den store mesenteriske arterie ved den ønskede klippet posisjon (figur 1A). Deretter legger noen dråper sterilt saltvann til området av ønsket klipp posisjon før påføring klipp.
Merk: For å utføre humbug kirurgi, følger den kirurgiske prosedyren frem til trinn 3.2. Ikke påfør klipp. I stedet opprett vevet fuktig ved lagt varm sAline som beskrevet i 3.6 i 1 time. Etterpå går du til trinn 4.1, - Tilstoppe de første ordens grener av den overlegne mesenteric arterien med mikrovaskulære klipp (70 g kraft) ved hjelp av et klipp applier å lage en 5-7 cm region av iskemisk ileum ved siden av cecum (figur 1B). Selv om posisjonen til fartøyene er konservativt, det kan være små variasjoner mellom mus (se eksempler på figur 1). Derfor er 2 eller 3 klipp vanligvis nødvendig (se beliggenheten til klippene på figur 1A, D, E, svarte piler).
Merk: Bruk høy kvalitet fartøy klipp. Høytrykks klipp kan skade fartøy og hindre regenerering mens lavtrykk klipp (<30 g) kan ikke fullstendig blokkere blodstrømmen. - Blokkere sikkerhet blodstrømmen gjennom tarmen ved hjelp av to klemmene på tvers av mikrovaskulære fartøy (40 g kraft), demarking regionen av ischemisk tarm (figur 1). Okklusjon av sivile fartøyer er pålagt åhindre blodtilførsel fra tilgrensende blodkar (se beliggenheten til klippene på figur 1A, D, E, grønne piler).
- Valgfritt: Legg heparin-løsning (6 USP enheter / ml), for å forebygge blodpropp. Dråpevis tilsett 0,5 ml av heparin-løsning til den isolerte tarmen.
- Våte sterile ikke-klebende pad delikat våtservietter med saltvann forvarmet til 37 ° C og gjelder for kirurgiske området. Kontroller at våtservietter forblir våt under hele prosedyren.
- Opprettholde ischemi i 60 min ved bruk av 1-1,5% isofluran anestesi hele. Hvis iskemi prosedyren utføres riktig, vil den iskemiske området endres til vin rød i fargen i ca 30 min. Legg merke til at blodårene distale til klippet posisjon blir forstørret under iskemi (figur 1, høyre panel) indikerer vellykket okklusjon.
- Følge nøye med musen under iskemi scenen. Fortsette å anvende saltoppløsning til det ikke-klebende pute som dekker kirurgi området.
- merkekantene av ischemiske området ved pipettering 20 pl Gill`s 3 hematoxylin på vev for å lette høsting av ischemisk vev og tilstøtende friskt vev fra den samme mus for sammenligning (figur 1E, høyre panel).
4. Reperfusjon Stage
- Ved slutten av iskemi legge til noen få dråper av saltvann på klemmen området og fjern forsiktig mikrovaskulære klemmene med klips applier. Deretter forsiktig skyve tarmen tilbake til bukhulen ved hjelp av saltvann fuktet bomulls tips. Fjern ikke-klebende pad og lukker bukveggen og huden ved hjelp av 9 mm rustfritt stål sår klipp. Hvis reperfusjon utføres lenger enn tre timer, kan du bruke en absorberbare Vicryl sutur å lukke bukveggen før du påfører sår klipp på huden.
- Opprettholde mus i en oppvarmet rent bur for ønsket tidsperiode (30 min, 60 min, 120 min, eller 180 minutter) for reperfusjon fase.
- Sjekk dyrene minst hvert 30. min for å forsikre stabilitet.
- Avlive mus ved CO 2 overdose etterfulgt av cervikal forvridning på ønsket tid etter reperfusjon.
- Åpne bukhulen og samle iskemisk tarmvevet for videre analyse. Høste sunt normalt vev ved siden av skadet vev som en intern kontroll på kontoen for noen systemisk reaksjon på skade.
Merk: Denne kontrollen er mer hensiktsmessig enn humbug operert kontroll mus fordi humbug opererte mus ikke gjennomgår en systemisk reaksjon på IR-indusert skade. - Skyll tarminnhold ved hjelp av 30 ml sprøyte med vedlagt sonde nål fylt med saltvann og deretter kutte tarmen lengderetningen. Hvis det er nødvendig en prøve av tarmen for genekspresjonsanalyse, kuttet en 1,5 mm fragment i lengderetningen, og bruke de resterende stykke for histologisk analyse.
- For histologiske analyser, utarbeide en rullekake ved hjelp av en pinsett til å rulle INTESTine.
- For å opprettholde den rullet form, legg bitene av tarmen mellom biopsi skumgummiputer i vev kassetter (figur 2). Plasser kassettene i 10% bufret formalin.
- Fiks vev i formalin i minst 24 timer. Erstatt formalin med 70% etanol i ytterligere 24 timer. Lagres vev i 70% etanol på ubestemt tid ved værelsestemperatur.
- Bygge inn i parafin, skåret 5 mikrometer seksjoner og flekken med hematoxylin og eosin ved hjelp av en standard protokoll (figur 3).
6. Scoring
- Resultat muse iskemi-reperfusjonsskade som oppsummert i tabell 2. Velg et passende scoring metode.
- Valgfritt: Del synsfeltet i fire seksjoner siden alvorlighetsgraden av skaden varierer gjennom seksjonen.
- Beregn gjennomsnittskarakter på hver del fra skårer oppnådd blindt.
- Sammenligne karakteren av den skadde vevet mellom saker og kontroll samt til the uskadd vev ved hjelp av en Kruskal-Wallis-test, etterfulgt av en Dunn multiple sammenligninger test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi optimalisert den eksperimentelle protokollen for IR kirurgi for å oppnå reproduserbare IR-indusert skade av ileum hos mus. Representative Resultatene er vist i denne delen.
Figur 1 viser eksempler på mikrovaskulære klipp posisjon for å indusere iskemi av ileum. Svarte pilene viser plasseringen av de viktigste klippene tygg første ordens grener av overlegen mesenteric arterie. Grønne pilene viser posisjonen ytterligere klipp for å blokkere blodforsyning fra sivile fartøy. Legg merke til økt størrelse av okkluderte fartøy distale til klemmene stilling og fargeendring av den ischemiske region av intestinte. Etter fjerning av klipsene på slutten av ischemia blodkar gjenvinne blodstrømmen og gå tilbake til normal størrelse.
Figur 2 viser et eksempel på en vev kassett inneholdende Sveitsisk ruller fremstilt fra control og iskemiske regioner av ileum etter en time av iskemi, etterfulgt av en 1 time av reperfusjon. Et stykke av milt ble tatt med for å lette plassering av kontroll og IR tarmen under bearbeiding og farging. Legg merke til fargeforskjellen mellom kontroll og iskemisk vev.
Figur 3 viser representative hematoxylin og eosin farging av kontroll og iskemiske regioner av ileum etter en time av iskemi, eller en time av iskemi, etterfulgt av en 2 timers av reperfusjon. Legg merke til alvorlig skade av epitel etter en time av iskemi preget av hemoragisk villi, epitel denudement med delvis å full ablasjon av krypter, og immuncelleinfiltrasjon (stjerne). Etter en 2 timers reperfusjon av villi skade og inflammasjon vedvarer (stjerne), men det er ingen vev blødning.
Figur 4 viser et eksempel på analyse av inflammatoriske cytokines uttrykk på en time og to timer etter iskemi-reperfusjon i iskemisk og kontroll tarmen. Legg merke til oppregulering av mRNA-ekspresjon av TNF, IL-1 b, IL-6 og CXCL2 på 1 time og 2 timer etter iskemi-reperfusjon sammenlignet med kontroll friskt vev.
Figur 1: Induksjon av ischemia ved bruk av vaskulær Clips (A) Isolert område av tarmen som inneholder cecum og ileum.. Små kutt i mesenteriet rundt overlegen mesenteric arterie er lagt til rette klipp søknad. (B) Mikrovaskulær klipp program som bruker klipp applier. (C) Plassering av mikrovaskulære klipp på overlegen mesenteric arterie å indusere iskemi. (D, E). Eksempler på blodkar struktur og klipp posisjonering i forskjellige mus. Piler indikerer iskemisk område av ileum preget av hematoxylin. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53881/53881fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:.. Tissue Forberedelse til histologisk analyse Tissue kassett som inneholder sveitsiske ruller fremstilt av iskemisk og kontroll regioner av ileum etter en time av iskemi etterfulgt av en 1 time av reperfusjon Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Hematoxylin og Eosin Farging av ileum etter iskemi Hematoxylin og eosin farging av kontroll- og iskemiske regioner av ileum etter en time av iskemi, eller en time av iskemi.etterfulgt av en 2 timers av reperfusjon. Barer = 500 mikrometer (øverst paneler), 200 mikrometer (bunnpaneler). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Ekspresjon av inflammatoriske cytokiner Under Iskemi-Reperfusjon Ekspresjon av CXCL2, TNF, IL-6, IL-1b ble målt ved 1 time og 2 timer etter iskemi-reperfusjon i ischemisk vev (IR) og normal kontroll vev (C). ved siden av ischemiske region av sanntids-PCR. n = 3 - 8 mus per gruppe, * p <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001. Feilfelt representerer sem Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| murine Arter | Anestesi / analgesi | Arterieokklusjon metode | iskemi tid | Tid etter reperfusjon | Henvisning | |||
| Sprague-Dawley-rotter | natriumpentobarbital | Okklusjon av SMA og cøliaki arterien ved hjelp av aneurisme klipp eller klemme | 45 min | 2 timer | 12 | |||
| C57BL6 / 129 | 2% halotan | Okklusjon av mesenteriske arterioler og den proksimale og distale partier av iskemisk vev. | 30 til 130 min | 6 hr | 1. 3 | |||
| C57BL / 6 | Ketamin, Isofluran | Okklusjon av SMA hjelp aneurisme klipp. Okklusjon av sivile Circulasjon ved den proksimale og distale områder. | 1 time | 1,5 time | 4,8,11 | |||
| C3H / Hej | natriumpentobarbital | Okklusjon bruker aneurisme klipp eller klemme | 40 min | 6 hr | 14 | |||
| C56BL / 6 | isofluran | Okklusjon av SMA og ileocolic arterien ved hjelp aneurisme klipp eller klemme | 100 min | 1, 2, 4, 24 hr | 15 | |||
| C57BL / 6 | Urethane | Okklusjon bruker aneurisme klipp eller klemme | 45 min | 60 min | 16 | |||
Tabell 1: Variasjoner i metodikk i Murine Intestinal IR-indusert skade
| Histologi scoring system | Henvisning | ||
| Klasse 0: Normal slimhinne | 13,17,18 | ||
| Grad 1: subepiteliale plass på villøse tips | |||
| Grad 2: Mer utvidet subepiteliale plass | |||
| Grad 3: Epiteliale løfte langs villous sider | |||
| Grad 4: ribbet villi | |||
| Karakter 5: Tap av villous vev | |||
| Karakter 6: Crypt lag infarkt | |||
| Grad 7: transmukosal infarkt | |||
| 8. klasse: transmuralt infarkt | |||
| Klasse 0: Normal slimhinne | 4,8,11,19-21 | ||
| Grad 1: sloughing av celler på villous tips | |||
| Grad 3: Villi var fraværende, men krypter var fortsatt lett påvisbare | |||
| Grad 4: Fullstendig fravær av epiteliale strukturer og transmuralt nekrose | |||
| Klasse 0: Normal villus | 6,22-31 | ||
| Grad 1: Villi med tips forvrengning | |||
| Grad 2: slimceller og Gugenheims 'mellomrom mangler | |||
| Grad 3: Villi med usammenhengende avbrudd av epitelceller | |||
| Grad 4: Villi med utsatt, men intakt lamina propria med epitelceller sloughing | |||
| Karakter 5: Laminerte propria er væskende | |||
| Karakter 6: Villi som viser blødning eller villi som er avdekt | |||
| Klasse 0: Normal histologi 32,33 | |||
| Grad 1: Lett forstyrrelse av overflaten epitel | |||
| Grad 2: epitelcelledifferensiering tap skade på villus tips | |||
| Grad 3: slimhinne vasokongestsjon, blødning, og fokal nekrose med tap på mindre enn halvparten av villi | |||
| Grad 4: Skade som strekker seg til mer enn halvparten av villi | |||
Tabell 2: Histologi scoring systemer i Murine Intestinal IR-indusert skade
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utviklingen av musemodeller av tarm IR skade har kraftig forbedret forståelse av mekanismene for vevskade og hjulpet i utviklingen av potensielle terapeutiske strategier for å minimere vevskader 7,9,11,34. De kritiske trinnene i denne protokollen er riktig plassering av mikrovaskulære klipp, riktig timing av iskemi og riktig histologisk evaluering av IR skade.
Varigheten av ischemi er kritisk for påfølgende epitelskade. Den typiske tiden som kreves for å indusere reproduserbar IR skade uten sykelighet og dødelighet av eksperimentelle mus er 45-60 min etterfulgt av en 2-3 timers reperfusjon. Utvidet perioder med iskemi kan resulterer i fullstendig tap av Epitel og økt dødelighet. For eksempel, i et svine-modell av jejunal ischemi, 60 min okklusjon resulterte i delvis tap av villa epitel, mens okklusjon i 120 min førte til fullstendig tap av villus epitel 35. jegmportantly, kan bakterie-frie og genetisk manipulert mus viser en øket følsomhet for IR skade, og derfor optimal tid av iskemi og reperfusjon kan trenge å bli optimalisert i preliminære eksperimenter. Selv om det typisk tid for evaluering av vevsskade etter reperfusjon er 2-3 timer, i lengre tid (12 timer) er nødvendig for analysen av intestinal stamcelle mobilisering 36. I tillegg kan endringer i commensal microbiota og TLR / Nod-mediert signale vesentlig påvirke utfallet av IR skade 4,8,37-39.
Riktig plassering av mikrovaskulære klipp er også avgjørende for reproduserbare IR skade. Her beskriver vi modellen av IR skade av murine distale ileum. Forskjellige deler av tarmen er kjent for å vise forskjellig følsomhet for IR skade. For eksempel, er jejunum mer følsom for IR skade enn ileum og colon 9,34,40. Faktisk, ischemi-reperfusjon modell av jejunum ved lukk SMA med en enkeltKlippet er vanligvis brukes til å studere mekanismer for IR skade (se ref. 9 for en omfattende gjennomgang av ulike metoder for IR-skade hos dyr). Men den nøyaktige posisjonen av kroken og analyse av forskjellige deler av tarmen, så vel som forskjellige metoder for anestesi varierer mellom disse studiene, noe som gjør det vanskelig å reprodusere (se tabell 1). En ekstra komplikasjon av IR skade jejunum er høy dødelighet fordi plasseringen av vaskulær klippet nær roten av SMA påvirker blodtilførselen til bredt område av tarmen. Derfor, i denne studien utviklet vi en protokoll for å indusere konsistent IR skade av terminal ileum, som er lett å reprodusere. For å indusere reproduserbar IR skade av ileum, er den riktige plasseringen av vaskulære klipp kritisk. Dette oppnås ved okkludering av de periferiske og parallelle grener av den store mesenteriske artery.The grad IR skade kan bli vurdert ved evaluering av hematoxylin og eosin seksjoner ved hjelp av opprinnelig Chiu / Park eller modifiserte rille systemer 11,18,34,41,42. I tillegg kan evalueringen av vevsskade utføres ved bruk av terminal deoksynukleotidyltransferase biotin-dUTP nick ende-merking (TUNEL) farging av fragmentert DNA, eller aktiv caspase-3 immunhistokjemisk farging, analyse av nøytrofiler ved å måle myeloperoksidase-aktivitet eller immunhistokjemisk vurdering av nøytrofiler ved hjelp av Gr -1, eller Ly6G antistoff flekker 7,11. Inflammatoriske cytokiner og kjemokiner, så som IL-1 b, TNF, IL-6, CXCL1, CXCL2 kan CCL2 evalueres ved sanntids-PCR-2,4,8. Et eksempel på analyse av inflammatoriske cytokin ekspresjon er vist på figur 4.
Det er viktig å merke seg at til tross for høy reproduserbarhet og tilgjengeligheten av IR skade av ileum, kan denne modellen ikke nødvendigvis alle kliniske tegn på sykdom hos mennesker, særlig i kroniske sykdomstilstander og betingelser med delvis okklusjon av mesenteriske arterie 9 9,43. Derfor modeller med store dyr, som gris blir utviklet 9,44. Nøye valg av dyremodell avhenger av den humane tilstand som studeres er kritisk. Oppsummert beskriver vi en enkel og robust modell av tarm IR skade som kan benyttes for å studere den cellulære og molekylære mekanisme av epitelial skade og regenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av russiske Science Foundation, gi no. 14-50-00060 og LLC RUSCHEMBIO. Dette arbeidet ble også støttet av stiftelsen Crohn`s og kolitt of America gir 294 083 (til AVT), og ved NIH stipend RO1 DK47700 (til CJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heated Pad | Sunbeam | E12107-819 | Alternative: Braintree Scientific heated pad |
| Table top research anesthesia Machine | Vasco | UCAP 0001-0000171 | Alternative: Parkland Scientific, V3000PS |
| Nose Cone | Parkland Scientific | ARES500 | |
| Scavenger canister and replacement cartridge | Parkland Scientific | 80000, 80120 | |
| Induction Chamber | Surgivet | V711802 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-10 | Controlled substance, contact IACUC |
| Animal clipper | Oster | Oster Golden A5 078005-050-003 | |
| Ophthalmic ointment | Webster | 8804604 | |
| Buprenorphine | McKesson | 562766 | Controlled substance,contact IACUC |
| Ketaset (Ketamine HCl) | Pfizer | NADA 45-290 | Controlled substance, contact IACUC |
| Cotton tips | Puritan medical products | 806-WC | Autoclave before use |
| Betadine | Purdue Products | 67618-150-17 | 10% Povidone-Iodine |
| Sterile saline solution | Aspen | 46066-807-60 | Adjust to room temperature before use |
| IR rodent thermometer | BIOSEB | BIO-IRB153 | |
| Micro vascular clips, 70 g | Roboz Surgical | RS5424, RS5435 | Alternative: WPI 14121, for SMA occlusion |
| Micro vascular clips, 40 g | Roboz Surgical | RS6472 | Alternative:WPI 14120, for collateral vessels occlusion |
| Clip applying forceps | World Precision Instruments | 14189 | Alternative: Roboz #RS-5410 or #RS-5440 |
| Gill's 3 hematoxylin | Thermo Scientific | 14-390-17 | |
| Surgical staples, Reflex 9 mm | Cell Point Scientific | 201-1000 | |
| Autoclip applier | Beckton Dickinson | 427630 | |
| Byopsy foam pad | Simport | M476-1 | |
| Tissue cassette | Fisher Healthcare | 15182701A | Histosette II combination lid and base |
| 10% buffered formalin | Fisher Scientific | 245-684 | |
| Surgical iris scissors | World Precision Instruments | 501263-G SC | Alternative: Roboz RS6816 |
| Operating scissors | World Precision Instruments | 501219-G | Alternative: Roboz RS6814 |
| Dressing forceps | Roboz Surgical | RS-5228, RS-8122 | Alternative: World Precision Instruments 1519-G |
| Heparin, endotoxin free, 300 USP units/vial, 50 mg | Sigma | 2106 | |
| Reflex wound clip removing forceps | Roboz Surgical | RS-9263 | Alternative: World Precision Instruments: 500347 |
| Mice C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | Stock No 0664 | |
| Telfa non-adherent dressings, 3 x 4, sterile | Coviden | 1050 | |
| Fisherbrand transfer pipets | Fischer Scientific | 13-711-5AM | Use pipets to dropwise add saline |
References
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nat Med. 17, 1391-1401 (2011).
- Lenaerts, K., et al. New insights in intestinal ischemia-reperfusion injury: implications for intestinal transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 18, 298-303 (2013).
- Yasuhara, H. Acute mesenteric ischemia: the challenge of gastroenterology. Surg Today. 35, 185-195 (2005).
- Perez-Chanona, E., Muhlbauer, M., Jobin, C. The microbiota protects against ischemia/reperfusion-induced intestinal injury through nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 2 (NOD2) signaling. Am J Pathol. 184, 2965-2975 (2014).
- Lee, H., et al. Delineating the relationships among the formation of reactive oxygen species, cell membrane instability and innate autoimmunity in intestinal reperfusion injury. Mol Immunol. 58, 151-159 (2014).
- Yoshiya, K., et al. Depletion of gut commensal bacteria attenuates intestinal ischemia/reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 301, G1020-G1030 (2011).
- Wu, M. C., et al. The receptor for complement component C3a mediates protection from intestinal ischemia-reperfusion injuries by inhibiting neutrophil mobilization. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 9439-9444 (2013).
- Muhlbauer, M., Perez-Chanona, E., Jobin, C. Epithelial cell-specific MyD88 signaling mediates ischemia/reperfusion-induced intestinal injury independent of microbial status. Inflamm Bowel Dis. 19, 2857-2866 (2013).
- Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: progress and promise for translational research. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308, G63-G75 (2015).
- Megison, S. M., Horton, J. W., Chao, H., Walker, P. B. A new model for intestinal ischemia in the rat. J Surg Res. 49, 168-173 (1990).
- Goldsmith, J. R., et al. Intestinal epithelial cell-derived mu-opioid signaling protects against ischemia reperfusion injury through PI3K signaling. Am J Pathol. 182, 776-785 (2013).
- Cuzzocrea, S., et al. Glycogen synthase kinase-3beta inhibition attenuates the development of ischaemia/reperfusion injury of the gut. Intensive Care Med. 33, 880-893 (2007).
- Farber, A., et al. A specific inhibitor of apoptosis decreases tissue injury after intestinal ischemia-reperfusion in mice. J Vasc Surg. 30, 752-760 (1999).
- Ben, D. F., et al. TLR4 mediates lung injury and inflammation in intestinal ischemia-reperfusion. J Surg Res. 174, 326-333 (2012).
- Watson, M. J., et al. Intestinal ischemia/reperfusion injury triggers activation of innate toll-like receptor 4 and adaptive chemokine programs. Transplant Proc. 40, 3339-3341 (2008).
- Watanabe, T., et al. Activation of the MyD88 signaling pathway inhibits ischemia-reperfusion injury in the small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303, G324-G334 (2012).
- Murayama, T., et al. JNK (c-Jun NH2 terminal kinase) and p38 during ischemia reperfusion injury in the small intestine. Transplantation. 81, 1325-1330 (2006).
- Park, P. O., Haglund, U., Bulkley, G. B., Falt, K. The sequence of development of intestinal tissue injury after strangulation ischemia and reperfusion. Surgery. 107, 574-580 (1990).
- Jilling, T., Lu, J., Jackson, M., Caplan, M. S. Intestinal epithelial apoptosis initiates gross bowel necrosis in an experimental rat model of neonatal necrotizing enterocolitis. Pediatr Res. 55, 622-629 (2004).
- Aprahamian, C. J., Lorenz, R. G., Harmon, C. M., Dimmit, R. A. Toll-like receptor 2 is protective of ischemia-reperfusion-mediated small-bowel injury in a murine model. Pediatr Crit Care Med. 9, 105-109 (2008).
- Tatum, P. M., Harmon, C. M., Lorenz, R. G., Dimmitt, R. A. Toll-like receptor 4 is protective against neonatal murine ischemia-reperfusion intestinal injury. J Pediatr Surg. 45, 1246-1255 (2010).
- Fleming, S. D., et al. Anti-phospholipid antibodies restore mesenteric ischemia/reperfusion-induced injury in complement receptor 2/complement receptor 1-deficient mice. J. Immunol. 173, 7055-7061 (2004).
- Fleming, S. D., et al. Mice deficient in complement receptors 1 and 2 lack a tissue injury-inducing subset of the natural antibody repertoire. J. Immunol. 169, 2126-2133 (2002).
- Lapchak, P. H., et al. Platelets orchestrate remote tissue damage after mesenteric ischemia-reperfusion. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, G888-G897 (2012).
- Rehrig, S., et al. Complement inhibitor, complement receptor 1-related gene/protein y-Ig attenuates intestinal damage after the onset of mesenteric ischemia/reperfusion injury in mice. J. Immunol. 167, 5921-5927 (2001).
- Hoffman, S. M., Wang, H., Pope, M. R., Fleming, S. D. Helicobacter infection alters MyD88 and Trif signalling in response to intestinal ischaemia-reperfusion. Exp Physiol. 96, 104-113 (2011).
- Moses, T., Wagner, L., Fleming, S. D. TLR4-mediated Cox-2 expression increases intestinal ischemia/reperfusion-induced damage. J Leukoc Biol. 86, 971-980 (2009).
- Feinman, R., et al. HIF-1 mediates pathogenic inflammatory responses to intestinal ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 299, G833-G843 (2010).
- Lapchak, P. H., et al. The role of platelet factor 4 in local and remote tissue damage in a mouse model of mesenteric ischemia/reperfusion injury. PloS one. 7, e39934 (2012).
- Wen, S. H., et al. Ischemic postconditioning during reperfusion attenuates intestinal injury and mucosal cell apoptosis by inhibiting JAK/STAT signaling activation. Shock. 38, 411-419 (2012).
- Wang, F., et al. Temporal variations of the ileal microbiota in intestinal ischemia and reperfusion. Shock. 39, 96-103 (2013).
- Zou, L., Attuwaybi, B., Kone, B. C. Effects of NF-kappa B inhibition on mesenteric ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 284, G713-G721 (2003).
- Hassoun, H. T., et al. Alpha-melanocyte-stimulating hormone protects against mesenteric ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 282, G1059-G1068 (2002).
- Stallion, A., et al. Ischemia/reperfusion: a clinically relevant model of intestinal injury yielding systemic inflammation. J Pediatr Surg. 40, 470-477 (2005).
- Blikslager, A. T., Roberts, M. C., Rhoads, J. M., Argenzio, R. A. Is reperfusion injury an important cause of mucosal damage after porcine intestinal ischemia? Surgery. 121, 526-534 (1997).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
- Victoni, T., et al. Local and remote tissue injury upon intestinal ischemia and reperfusion depends on the TLR/MyD88 signaling pathway. Med Microbiol Immunol. 199, 35-42 (2010).
- Watanabe, T., et al. Toll-like receptor 2 mediates ischemia-reperfusion injury of the small intestine in adult mice. PloS one. 9, e110441 (2014).
- Pope, M. R., Fleming, S. D. TLR2 modulates antibodies required for intestinal ischemia/reperfusion-induced damage and inflammation. J. Immunol. 194, 1190-1198 (2015).
- Leung, F. W., Su, K. C., Passaro, E. Jr, Guth, P. H. Regional differences in gut blood flow and mucosal damage in response to ischemia and reperfusion. Am J Physiol. 263, G301-G305 (1992).
- Chiu, C. J., McArdle, A. H., Brown, R., Scott, H. J., Gurd, F. N. Intestinal mucosal lesion in low-flow states. I. A morphological, hemodynamic, and metabolic reappraisal. Arch Surg. 101, 478-483 (1970).
- Quaedackers, J. S., et al. An evaluation of methods for grading histologic injury following ischemia/reperfusion of the small bowel. Transplant Proc. 32, 1307-1310 (2000).
- Bianciardi, P., Scorza, R., Ghilardi, G., Samaja, M. Xanthine oxido-reductase activity in ischemic human and rat intestine. Free Radic Res. 38, 919-925 (2004).
- Yandza, T., et al. The pig as a preclinical model for intestinal ischemia-reperfusion and transplantation studies. J Surg Res. 178, 807-819 (2012).
