Summary
Aqui nós descrevemos o procedimento detalhado de isquemia e reperfusão em ratos que resulta em lesão reprodutível sem mortalidade para incentivar a padronização da técnica em todo o campo. Este modelo de lesão por isquemia-reperfusão intestinal pode ser utilizada para estudar os mecanismos celulares e moleculares da lesão e da regeneração.
Abstract
isquemia intestinal é uma condição de risco de vida associada com uma ampla gama de condições clínicas, incluindo a aterosclerose, trombose, hipotensão, enterocolite necrotizante, transplante do intestino, trauma e inflamação crónica. lesão isquemia-reperfusão (IR) é uma consequência da isquemia mesentérica aguda, causada por fluxo inadequado de sangue através dos vasos mesentéricos, resultando em danos intestinal. A reperfusão após isquemia pode agravar os danos do intestino. Os mecanismos de lesão IR são complexos e pouco conhecidos. Portanto, modelos animais experimentais pequenas são críticas para a compreensão da patofisiologia da lesão de IR e o desenvolvimento de novas terapias.
Aqui nós descrevemos um modelo de rato de lesão IR intestinal aguda que fornece lesão reprodutível do intestino delgado sem mortalidade. Isto é conseguido através da indução de isquemia na região do íleo distai por temporalmente ocludinag ramos colaterais periféricos e terminais da artéria mesentérica superior por 60 min usando clipes microvasculares. A reperfusão durante 1 hora, ou 2 horas após a lesão em resultados lesão reprodutível do intestino examinado por análise histológica. posição apropriada dos clipes microvasculares é crítica para o processo. Por isso, o clipe de vídeo fornece uma descrição detalhada visuais passo-a-passo desta técnica. Este modelo de lesão intestinal de IR podem ser utilizados para estudar os mecanismos celulares e moleculares da lesão e da regeneração.
Introduction
O intestino é muito sensível à interrupção do fluxo sanguíneo que provoca isquemia e epitelial danos. A reperfusão após isquemia fornece a re-oxigenação do tecido, e pode promover ainda mais a patologia. Portanto, a lesão por isquemia e reperfusão intestinal está associada com uma vasta gama de patologias, incluindo enterocolite necrotizante, a rejeição de aloenxertos em transplantes do intestino delgado, complicações de cirurgia abdominal aórtica do aneurisma, bypass cardiopulmonar, e 1,2 inflamatória doença do intestino. Lesão intestinal IR, isquemia mesentérica especialmente grave, é uma doença potencialmente fatal, resultando em morbidade e mortalidade 3.
Embora pouco compreendida, isquemia-reperfusão (IR) lesão é pensada para ser associada com mudanças na flora intestinal, bem como a produção de espécies de oxigénio reactivas e citocinas inflamatórias e quimiocinas 1,4-6. Isto leva a activação de ambos emNate e mecanismos imunes adaptativas que promovem a inflamação e lesão tecidual 1,7,8.
Os modelos animais são fundamentais para a compreensão dos mecanismos de lesão IR, uma vez que permitem fácil gain- e perda de função experimentos genéticos. Vários modelos animais de IR foram desenvolvidos que incluem a oclusão vascular completa, isquemia baixo fluxo, e segmentado oclusão vascular (resumidos num recente revisão abrangente 9). A isquemia intestinal provocada por uma oclusão vascular completa da artéria mesentérica superior (SMA) é um modelo simples e utilizada de IR em grandes animais roedores e 9-11. No entanto, diferentes áreas do intestino ter susceptibilidade diferente a uma lesão. Além disso, a diversidade de anestésicos, analgésicos, as técnicas de oclusão da artéria, bem como inconsistência na duração das lesões de isquemia e recuperação resultado em graus variáveis de lesão confundir o nosso entendimento da biologia do IR através de vários Studies. A Tabela 1 mostra estas inconsistências nos estudos IR murino. A maior desvantagem de usar o tempo de isquemia mais curtos (30-45 min) tem como alvo a janela de recuperação sobre a qual podem ser observadas diferenças discerníveis entre casos e controles. lesão leve para o epitélio pode ser resolvido de uma hora após a reperfusão, portanto especializada métricas patológicos pode ser necessário para encontrar diferenças de restituição epitelial. Em contraste, danos excessivos, como visto por 100 min de lesão isquémica pode resultar na denudement completa do epitélio, em que a restituição não é mais possível, aumentando a taxa de mortalidade, e o tempo de recuperação. Portanto, aqui nós descrevemos o procedimento detalhado de IR intestinal em camundongos que resulta em lesão reprodutível sem mortalidade para incentivar a padronização da técnica em todo o nosso campo. Este modelo de lesão intestinal de IR podem ser utilizados para estudar os mecanismos celulares e moleculares da lesão e da regeneração.
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Protocol
Os estudos em animais foram realizados de acordo com o Instituto Nacional de Saúde e orientações foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee da Trudeau Institute. 8-12 semanas de idade C57BL / 6 murganhos foram utilizados para o estudo.
1. Preparação para a cirurgia
- Preparar e esterilizar instrumentos cirúrgicos.
- Prepare sistema de anestesia com base em isoflurano com cone do nariz, e uma almofada aquecida. Certifique-se de almofada aquecida não está superaquecido (<39 ºC).
- Certifique-se de que a eliminação de gás isofluorano recipiente é posicionado correctamente para garantir as portas de escape, na parte inferior do recipiente não estão bloqueadas ou oclusa em qualquer maneira. Pesar de gás eliminação canister antes do procedimento e peso documento sobre canister. Deite fora a embalagem quando o peso recipiente for superior a 50 g de peso acumulado (~ 12 horas).
2. Anestesia
- Anestesiar rato com 3% de isoflurano numa câmara de indução (1 L / minO 2).
- Avaliar a profundidade da anestesia por uma incapacidade de permanecer em pé, perda de movimento intencional voluntário, perda de reflexo de piscar, relaxamento muscular e perda de resposta ao reflexo de estimulação (dedo do pé ou pitada cauda com uma pressão firme).
- Avaliar a frequência respiratória e padrão observando parede torácica e movimentos abdominais. Sob anestesia ideal, a taxa de respiração deve ser ~ 55-65 respirações por min.
- Retirar do rato da câmara de indução e rapidamente raspar a área do abdômen do mouse.
- Para evitar a dessecação da córnea, colocar pomada oftálmica branda nos olhos.
- Coloque o mouse sobre a almofada aquecida e conectá-lo via cone do nariz para o sistema de anestesia. Certifique-se de membrana cone do nariz do látex se encaixa firmemente sobre a cabeça do mouse e não há vazamento de isoflurano.
- Reduzir a taxa de isoflurano a 1,5%, e injectar buprenorfina (0,1 mg / kg) e cetamina (10 mg / kg) por via subcutânea a evitar wind-up da dor-cascata.
- limpe the a pele da área de operação, com uma mecha de algodão estéril embebido em solução cirúrgica Betadine seguido por 70% de etanol.
3. Cirurgia
- Faça uma linha de meados 3-5 cm laparotomia com uma tesoura de operação. área de atuação tampa com almofada anti-aderente estéril umedecido com solução salina. Isolar ceco e íleo e expor a artéria mesentérica superior utilizando zaragatoas de algodão humedecido em solução salina.
- Para facilitar o clipe de aplicar, fazer pequenos cortes no mesentério em torno da artéria mesentérica superior usando iris finas scissors.To fazer isso, levante cuidadosamente o intestino com uma pinça de vestir e cortar mesentério em ambos os lados da artéria mesentérica superior na posição clipe desejado (Figura 1A). Em seguida, adicionar algumas gotas de solução salina estéril para a área do grampo posição desejada antes de aplicação de clipes.
Nota: Para realizar a cirurgia sham, siga o procedimento cirúrgico até ao passo 3.2. Não aplicar clipes. Em vez disso, manter o tecido húmido por acrescentou s quenteAline como descrito em 3.6, durante 1 h. Depois, siga para o passo 4.1, - Ocluir as primeiras ramificações ordem da artéria mesentérica superior com clipes microvasculares (70 g) utilizando uma força de aplicador de pinças para criar uma região de 5-7 cm do íleo isquémica adjacente ao ceco (Figura 1B). Embora a posição dos vasos é conservadora, pode haver ligeiras variações entre ratos (ver exemplos na Figura 1). Portanto, 2 ou 3 clipes são geralmente necessária (ver a localização dos clipes na Figura 1A, D, E, setas pretas).
Nota: Use grampos de navios de qualidade elevada. clipes de alta pressão pode danificar os vasos e impedir a regeneração enquanto clipes de baixa pressão (<30 g) não pode bloquear completamente o fluxo sanguíneo. - Bloquear o fluxo de sangue colateral através do intestino utilizando dois clipes microvasculares através vasos (40 g vigor), demarcando a região do intestino isquêmico (Figura 1). Oclusão de vasos colaterais é necessária paraimpedir o fornecimento de sangue dos vasos sanguíneos adjacentes (ver a localização dos clipes na Figura 1A, D, E, setas verdes).
- Opcional: Adicionar solução de heparina (6 USP unidades / ml), para impedir a coagulação do sangue. Gota a gota, adicionar 0,5 ml de solução de heparina para o intestino isolado.
- Wet almofada anti-aderente delicados toalhetes estéreis com solução salina pré-aquecido a 37 ° C e aplicar à área cirúrgica. Certifique-se que toalhetes permanece molhada durante todo o procedimento.
- Manter a isquemia durante 60 minutos utilizando 1-1,5% anestesia com isoflurano todo. Se procedimento de isquemia é realizado corretamente, a região isquêmica mudará para vinho de cor vermelha em aproximadamente 30 min. Note-se que os vasos sanguíneos distais para a posição de grampo são aumentados durante a isquemia (Figura 1, painéis direitos), indicando oclusão bem sucedida.
- acompanhar de perto o mouse durante a fase de isquemia. Continuar a aplicar uma solução salina para a almofada não-aderente que cobre o local da cirurgia.
- Marcaas margens da área isquémica através de pipetagem 20 ul de Gill`s 3 hematoxilina no tecido para facilitar a colheita do tecido isquémico e tecido saudável adjacente a partir do mesmo rato para comparação (Figura 1E, painel da direita).
4. A reperfusão Stage
- No final da isquemia adicionar algumas gotas de solução salina na zona do grampo e suavemente remover clipes microvasculares com aplicador de agrafo. Em seguida, empurre cuidadosamente o intestino volta para a cavidade abdominal com solução salina umedecido dicas de algodão. Remover almofada anti-aderente e fechar a parede abdominal e a pele usando 9 mm agrafos de aço inoxidável. Se reperfusão é realizado mais do que 3 horas, usar uma sutura Vicryl absorvível para fechar a parede abdominal antes de aplicação de clipes para feridas na pele.
- Manter ratinhos em uma gaiola limpa aquecida para a quantidade desejada de tempo (30 min, 60 min, 120 min, ou 180 min) para a fase de reperfusão.
- Verifique animais, pelo menos a cada 30 min para assegurar a estabilidade.
- Eutanásia ratos por overdose de CO2, seguido por deslocamento cervical no tempo desejado após a reperfusão.
- Abra cavidade abdominal e recolher o tecido intestinal isquémica, para posterior análise. Colheita tecido normal saudável adjacente ao tecido lesionado como um controlo interno para a conta para qualquer reação sistêmica à lesão.
Nota: Este controle é mais apropriado do que o falso operado camundongos de controle porque os ratos sujeitos a operação simulada não sejam objecto de uma reação sistêmica à lesão induzida pelo IR. - Lavar o conteúdo intestinal utilizando 30 ml seringa com agulha gavage anexo preenchido com solução salina e depois cortar o intestino longitudinalmente. Se é necessária uma amostra de intestino para análise da expressão do gene, um fragmento cortado longitudinalmente 1,5 milímetros, e utilizar a parte restante para análise histológica.
- Para análise histológica, preparar um rocambole usando um par de fórceps para rolar a intestine.
- Para manter a forma enrolada, colocar as peças de intestino entre almofadas de espuma de biópsia em cassetes de tecido (Figura 2). Coloque as cassetes em formalina a 10% tamponada.
- Corrigir o tecido em formalina durante pelo menos 24 h. Substituir formalina com 70% de etanol durante mais 24 horas adicionais. tecido loja em etanol 70% indefinidamente à temperatura ambiente.
- Incorporar-se em parafina, cortadas secções de 5 | iM e mancha com hematoxilina e eosina utilizando um protocolo padrão (Figura 3).
6. Scoring
- Pontuação da lesão de isquemia-reperfusão murino como resumido na Tabela 2. Escolha um método de pontuação apropriada.
- Opcional: Dividir o campo de visão em quatro secções visto que a gravidade da lesão varia ao longo da secção.
- Calcule a média das notas de cada seção da pontuação obtida cegamente.
- Comparar o grau do tecido lesado entre casos e controle, bem como a the ilesa tecido utilizando um teste de Kruskal-Wallis, seguido do teste de comparações múltiplas de um Dunn.
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Representative Results
Nós optimizada do protocolo experimental de cirurgia de IV para se obter lesão induzida IR reprodutível do íleo em ratos. Os resultados representativos são demonstradas nesta secção.
A Figura 1 mostra exemplos de posição clips microvasculares para induzir isquemia do íleo. setas pretas mostram a posição dos principais clipes de oclusão primeiros ramos da ordem de artéria mesentérica superior. setas verdes mostram a posição dos grampos adicionais para bloquear o fornecimento de sangue a partir de vasos colaterais. Nota aumento do tamanho dos vasos obstruídos distal para a posição de clipes e mudança de cor da região isquémica de intestinte. Após a remoção dos grampos no final de vasos sanguíneos isquemia recuperar o fluxo de sangue e voltar ao tamanho normal.
A Figura 2 mostra um exemplo de uma cassete de tecido contendo rolos suíços preparado a partir de controlo e as regiões isquémicas do íleo após 1 h de isquemia, seguida de uma 1 hora de reperfusão. Um pedaço de baço foi incluída para facilitar o posicionamento de controlo e IR intestino durante o processamento e coloração. Note-se a diferença de cor entre o controle e tecido isquêmico.
A Figura 3 mostra a coloração com hematoxilina e eosina representativa das regiões isquémicas do íleo após 1 h de isquemia, ou 1 h de isquemia seguida de uma 2 horas de reperfusão e controlo. Observe o dano severo do epitélio após 1 hora de isquemia caracterizada por vilosidades hemorrágico, denudement epitélio com parcial para completar a ablação das criptas e infiltração de células imunitárias (asterisco). Depois de uma 2 horas de lesão de reperfusão e inflamação persistir vilosidades (asterisco), mas não há nenhuma hemorragia tecido.
A Figura 4 mostra um exemplo da análise de CY inflamatóriaexpressão tokines à 1 h e 2 h após isquemia-reperfusão no intestino isquémico e controlo. Nota sobre-regulação da expressão de ARNm de TNF, IL-1b, IL-6 e CXCL2 à 1 h e 2 h após a lesão de isquemia-reperfusão em comparação com controlo de tecido saudável.
Figura 1: indução de isquemia usando clipes vasculares (A) área isolada do intestino contendo ceco e íleo.. Pequenos cortes no mesentério em torno da artéria mesentérica superior são feitas para facilitar a aplicação de clipes. (B) a aplicação clipe microvascular usando clipe aplicador. (C) Posição de clipes microvasculares na artéria mesentérica superior, para induzir isquemia. (D, E). Exemplos de estrutura vasculatura e posicionamento grampo em ratinhos diferentes. As setas indicam a área isquêmica do íleo marcado por hematoxilina. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53881/53881fig1large.jpg" target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:.. Preparação do tecido para análise histológica cassete de tecido contendo rolos suíços preparados a partir de regiões isquêmicas e de controlo do íleo após 1 hora de isquemia seguido por um 1 hora de reperfusão Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Hematoxilina-eosina de Íleo pós-isquemia hematoxilina e eosina de regiões do íleo de controlo e isquémicas após 1 h de isquemia, ou 1 h de isquemia.seguido por uma 2 horas de reperfusão. Barras = 500 mm (painéis superiores), a 200 ^ m (painéis inferiores). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Expressão de citocinas inflamatórias durante a isquemia-reperfusão Expressão de CXCL2, TNF, IL-6, IL-1b foi medido a 1 h e 2 h após a lesão de isquemia-reperfusão no tecido isquémico (IR) e de tecido normal de controlo (C). adjacente à região isquémica por PCR em tempo real. N = 3-8 ratinhos por grupo, * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001. As barras de erro representam SEM Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Espécies de murino | Anestesia / analgesia | Método de oclusão da artéria | tempo de isquemia | Tempo após a reperfusão | Referência | |||
| Ratos Sprague-Dawley | pentobarbital sódico | A oclusão de SMA e da artéria celíaca utilizando clipe de aneurisma ou grampo | 45 min | 2 hr | 12 | |||
| C57BL6 / 129 | 2% de halotano | A oclusão da arteríola mesentérica, e as porções proximal e distal do tecido isquémico. | 30 a 130 min | 6 hr | 13 | |||
| C57BL / 6 | Cetamina, isoflurano | A oclusão de SMA utilizando clips de aneurisma. Oclusão da circul garantiação nas extremidades proximal e distal áreas. | 1 hr | 1,5 hr | 4,8,11 | |||
| C3H / Hej | pentobarbital sódico | Oclusão usando clipe de aneurisma ou grampo | 40 min | 6 hr | 14 | |||
| C56BL / 6 | isoflurano | A oclusão de SMA e da artéria ileocolic usando clipe de aneurisma ou grampo | 100 min | 1, 2, 4, 24 hr | 15 | |||
| C57BL / 6 | uretano | Oclusão usando clipe de aneurisma ou grampo | 45 min | 60 min | 16 | |||
Tabela 1: Variações em Metodologia em lesão induzida IR murino Intestinal
| sistema de "3" Histologia de pontuação | Referência | ||
| Grau 0: mucosa normal | 13,17,18 | ||
| Grau 1: espaço subepitelial na ponta das vilosidades | |||
| Grau 2: espaço subepitelial mais prolongado | |||
| Grau 3: elevação epitelial ao longo dos lados das vilosidades | |||
| Grau 4: Denuded vilosidades | |||
| Grau 5: Perda de tecido das vilosidades | |||
| Grau 6: Crypt infarto camada | |||
| Categoria 7: infarto transmucosa | |||
| Grade 8: infarto transmural | |||
| Grau 0: mucosa normal | 4,8,11,19-21 | ||
| Grau 1: descamação de células nas pontas das vilosidades | |||
| Grau 3: Villi estavam ausentes, mas criptas ainda eram facilmente detectável | |||
| Grau 4: Completa ausência de estruturas epiteliais e necrose transmural | |||
| Grau 0: vilosidades normal | 6,22-31 | ||
| Grau 1: Villi com a distorção da ponta | |||
| Grau 2: As células caliciformes e espaços Gugenheims 'estão em falta | |||
| Grau 3: vilosidades com perturbações irregular das células epiteliais | |||
| Grau 4: Villi com a exposta, mas lâmina intacta, com descamação de células epiteliais | |||
| Grau 5: A lâmina própria está exalando | |||
| Grau 6: Villi que a hemorragia de exibição ou para vilosidades que são desnudados | |||
| Grau 0: histologia normal 32,33 | |||
| Grau 1: perturbação ligeira do epitélio de superfície | |||
| Grau 2: lesão perda de células epiteliais na ponta das vilosidades | |||
| Grau 3: vasocongestão mucosa, hemorragia e necrose focal com perda de menos de metade das vilosidades | |||
| Grau 4: danos que se estende para mais de metade das vilosidades | |||
Tabela 2: Pontuação Sistemas de Histologia em lesão induzida IR murino Intestinal
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Discussion
O desenvolvimento de modelos de rato de lesão IR intestinal têm melhorado muito a compreensão dos mecanismos de lesão tecidual e ajudado no desenvolvimento de potenciais estratégias terapêuticas para minimizar danos nos tecidos 7,9,11,34. Os passos críticos deste protocolo é o posicionamento adequado dos clipes microvasculares, timing correto da isquemia e histológica adequada avaliação da lesão IR.
A duração da isquemia é crítico para a subsequente lesão do epitélio. O tempo típico necessária para induzir lesão IR reprodutível, sem morbidade e mortalidade de camundongos experimental é de 45-60 min seguido por uma reperfusão 2-3 hr. Períodos prolongados de isquemia pode resulta na perda completa do epitélio e aumento da mortalidade. Por exemplo, num modelo suíno de isquemia do jejuno, 60 min oclusão resultou na perda parcial da vivenda epitélio, enquanto oclusão durante 120 min conduziu à perda completa de vilosidades do epitélio 35. Eumportantly, livre de germes e de ratinhos geneticamente manipulado pode exibir uma sensibilidade aumentada à lesão de IR, e, por conseguinte, o tempo óptimo de isquemia e reperfusão pode precisar de ser optimizada em experiências preliminares. Embora o tempo típico para a avaliação de danos nos tecidos após a reperfusão é de 2-3 horas, um tempo mais longo (12 horas) é necessária para a análise de mobilização de células estaminais 36 intestinal. Além disso, alterações na microflora comensal e sinalização dos TLR / mediada por Nod pode influenciar significativamente o resultado da lesão de IR 4,8,37-39.
A posição correcta dos grampos microvasculares também é fundamental para a lesão IR reprodutível. Aqui descrevemos o modelo de lesão de IR do íleo distai murino. partes distintas do intestino são conhecidos por exibir sensibilidade diferente à lesão IR. Por exemplo, no jejuno é mais sensível aos danos de IR íleo e cólon 9,34,40. De facto, o modelo de isquemia-reperfusão do jejuno por oclusão de SMA com uma únicaclipe é comumente usado para estudar os mecanismos de lesão IR (ver ref. 9 para uma revisão abrangente dos diferentes métodos de IR-lesão em animais). No entanto, a posição exacta do grampo e a análise de diferentes secções do intestino, assim como métodos diferentes de anestesia varia entre os estudos, tornando-o difícil de reproduzir (ver Tabela 1). Uma complicação adicional de lesão IR de jejuno é elevada mortalidade já que a posição do clipe vascular perto da raiz da SMA afeta suprimento de sangue para ampla área de intestino. Portanto, no presente estudo foi desenvolvido um protocolo para induzir lesão IR consistente de íleo terminal, que é fácil de reproduzir. Para induzir o dano por IR reprodutível de íleo, a posição correcta dos grampos vasculares é crítica. Isto é conseguido por oclusão dos ramos periféricos e colaterais do grau artery.The mesentérica superior de lesão IR pode ser avaliada por avaliação de seções hematoxilina e eosina usando originais Chiu / ParK ou sistemas de pontuação modificados 11,18,34,41,42. Além disso, a avaliação dos danos do tecido pode ser realizada utilizando o terminal desoxinucleotidilo transferase de biotina-dUTP nick end-rotulagem coloração (TUNEL) de ADN fragmentado, ou caspase-3 coloração imuno-histoquímica activo, análise de neutrófilos medindo a actividade da mieloperoxidase ou imuno-histoquímica de neutrófilos usando Gr -1, ou anticorpo Ly6G coloração 7,11. Citocinas e quimiocinas inflamatórias, tais como IL-1B, TNF, IL-6, CXCL1, CXCL2, CCL2 pode ser avaliada por PCR em tempo real 2,4,8. Um exemplo da análise de expressão de citoquinas inflamatórias é mostrado na Figura 4.
É importante notar que, apesar da elevada reprodutibilidade e a acessibilidade de lesão de IR do íleo, este modelo não pode reflectir todos os sinais clínicos de doença humana, particularmente em estados de doença e condições crónicas com oclusão parcial da artéria mesentérica superior 9 9,43. Portanto, os modelos que utilizam grandes animais, como porcos estão sendo desenvolvidos 9,44. A selecção cuidadosa do modelo animal, dependendo da condição humana a ser estudado é crítica. Em resumo, descreve-se um modelo simples e robusta da lesão intestinal de IR que pode ser utilizada para estudar o mecanismo celular e molecular da lesão epitelial e regeneração.
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Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo russo Science Foundation, conceder nenhuma. 14-50-00060 e LLC RUSCHEMBIO. Este trabalho também foi apoiado pela Fundação de Crohn e Colite da América conceder 294083 (para AVT), e pelo NIH concessão RO1 DK47700 (para CJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heated Pad | Sunbeam | E12107-819 | Alternative: Braintree Scientific heated pad |
| Table top research anesthesia Machine | Vasco | UCAP 0001-0000171 | Alternative: Parkland Scientific, V3000PS |
| Nose Cone | Parkland Scientific | ARES500 | |
| Scavenger canister and replacement cartridge | Parkland Scientific | 80000, 80120 | |
| Induction Chamber | Surgivet | V711802 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-10 | Controlled substance, contact IACUC |
| Animal clipper | Oster | Oster Golden A5 078005-050-003 | |
| Ophthalmic ointment | Webster | 8804604 | |
| Buprenorphine | McKesson | 562766 | Controlled substance,contact IACUC |
| Ketaset (Ketamine HCl) | Pfizer | NADA 45-290 | Controlled substance, contact IACUC |
| Cotton tips | Puritan medical products | 806-WC | Autoclave before use |
| Betadine | Purdue Products | 67618-150-17 | 10% Povidone-Iodine |
| Sterile saline solution | Aspen | 46066-807-60 | Adjust to room temperature before use |
| IR rodent thermometer | BIOSEB | BIO-IRB153 | |
| Micro vascular clips, 70 g | Roboz Surgical | RS5424, RS5435 | Alternative: WPI 14121, for SMA occlusion |
| Micro vascular clips, 40 g | Roboz Surgical | RS6472 | Alternative:WPI 14120, for collateral vessels occlusion |
| Clip applying forceps | World Precision Instruments | 14189 | Alternative: Roboz #RS-5410 or #RS-5440 |
| Gill's 3 hematoxylin | Thermo Scientific | 14-390-17 | |
| Surgical staples, Reflex 9 mm | Cell Point Scientific | 201-1000 | |
| Autoclip applier | Beckton Dickinson | 427630 | |
| Byopsy foam pad | Simport | M476-1 | |
| Tissue cassette | Fisher Healthcare | 15182701A | Histosette II combination lid and base |
| 10% buffered formalin | Fisher Scientific | 245-684 | |
| Surgical iris scissors | World Precision Instruments | 501263-G SC | Alternative: Roboz RS6816 |
| Operating scissors | World Precision Instruments | 501219-G | Alternative: Roboz RS6814 |
| Dressing forceps | Roboz Surgical | RS-5228, RS-8122 | Alternative: World Precision Instruments 1519-G |
| Heparin, endotoxin free, 300 USP units/vial, 50 mg | Sigma | 2106 | |
| Reflex wound clip removing forceps | Roboz Surgical | RS-9263 | Alternative: World Precision Instruments: 500347 |
| Mice C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | Stock No 0664 | |
| Telfa non-adherent dressings, 3 x 4, sterile | Coviden | 1050 | |
| Fisherbrand transfer pipets | Fischer Scientific | 13-711-5AM | Use pipets to dropwise add saline |
References
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nat Med. 17, 1391-1401 (2011).
- Lenaerts, K., et al. New insights in intestinal ischemia-reperfusion injury: implications for intestinal transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 18, 298-303 (2013).
- Yasuhara, H. Acute mesenteric ischemia: the challenge of gastroenterology. Surg Today. 35, 185-195 (2005).
- Perez-Chanona, E., Muhlbauer, M., Jobin, C. The microbiota protects against ischemia/reperfusion-induced intestinal injury through nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 2 (NOD2) signaling. Am J Pathol. 184, 2965-2975 (2014).
- Lee, H., et al. Delineating the relationships among the formation of reactive oxygen species, cell membrane instability and innate autoimmunity in intestinal reperfusion injury. Mol Immunol. 58, 151-159 (2014).
- Yoshiya, K., et al. Depletion of gut commensal bacteria attenuates intestinal ischemia/reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 301, G1020-G1030 (2011).
- Wu, M. C., et al. The receptor for complement component C3a mediates protection from intestinal ischemia-reperfusion injuries by inhibiting neutrophil mobilization. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 9439-9444 (2013).
- Muhlbauer, M., Perez-Chanona, E., Jobin, C. Epithelial cell-specific MyD88 signaling mediates ischemia/reperfusion-induced intestinal injury independent of microbial status. Inflamm Bowel Dis. 19, 2857-2866 (2013).
- Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: progress and promise for translational research. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308, G63-G75 (2015).
- Megison, S. M., Horton, J. W., Chao, H., Walker, P. B. A new model for intestinal ischemia in the rat. J Surg Res. 49, 168-173 (1990).
- Goldsmith, J. R., et al. Intestinal epithelial cell-derived mu-opioid signaling protects against ischemia reperfusion injury through PI3K signaling. Am J Pathol. 182, 776-785 (2013).
- Cuzzocrea, S., et al. Glycogen synthase kinase-3beta inhibition attenuates the development of ischaemia/reperfusion injury of the gut. Intensive Care Med. 33, 880-893 (2007).
- Farber, A., et al. A specific inhibitor of apoptosis decreases tissue injury after intestinal ischemia-reperfusion in mice. J Vasc Surg. 30, 752-760 (1999).
- Ben, D. F., et al. TLR4 mediates lung injury and inflammation in intestinal ischemia-reperfusion. J Surg Res. 174, 326-333 (2012).
- Watson, M. J., et al. Intestinal ischemia/reperfusion injury triggers activation of innate toll-like receptor 4 and adaptive chemokine programs. Transplant Proc. 40, 3339-3341 (2008).
- Watanabe, T., et al. Activation of the MyD88 signaling pathway inhibits ischemia-reperfusion injury in the small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303, G324-G334 (2012).
- Murayama, T., et al. JNK (c-Jun NH2 terminal kinase) and p38 during ischemia reperfusion injury in the small intestine. Transplantation. 81, 1325-1330 (2006).
- Park, P. O., Haglund, U., Bulkley, G. B., Falt, K. The sequence of development of intestinal tissue injury after strangulation ischemia and reperfusion. Surgery. 107, 574-580 (1990).
- Jilling, T., Lu, J., Jackson, M., Caplan, M. S. Intestinal epithelial apoptosis initiates gross bowel necrosis in an experimental rat model of neonatal necrotizing enterocolitis. Pediatr Res. 55, 622-629 (2004).
- Aprahamian, C. J., Lorenz, R. G., Harmon, C. M., Dimmit, R. A. Toll-like receptor 2 is protective of ischemia-reperfusion-mediated small-bowel injury in a murine model. Pediatr Crit Care Med. 9, 105-109 (2008).
- Tatum, P. M., Harmon, C. M., Lorenz, R. G., Dimmitt, R. A. Toll-like receptor 4 is protective against neonatal murine ischemia-reperfusion intestinal injury. J Pediatr Surg. 45, 1246-1255 (2010).
- Fleming, S. D., et al. Anti-phospholipid antibodies restore mesenteric ischemia/reperfusion-induced injury in complement receptor 2/complement receptor 1-deficient mice. J. Immunol. 173, 7055-7061 (2004).
- Fleming, S. D., et al. Mice deficient in complement receptors 1 and 2 lack a tissue injury-inducing subset of the natural antibody repertoire. J. Immunol. 169, 2126-2133 (2002).
- Lapchak, P. H., et al. Platelets orchestrate remote tissue damage after mesenteric ischemia-reperfusion. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, G888-G897 (2012).
- Rehrig, S., et al. Complement inhibitor, complement receptor 1-related gene/protein y-Ig attenuates intestinal damage after the onset of mesenteric ischemia/reperfusion injury in mice. J. Immunol. 167, 5921-5927 (2001).
- Hoffman, S. M., Wang, H., Pope, M. R., Fleming, S. D. Helicobacter infection alters MyD88 and Trif signalling in response to intestinal ischaemia-reperfusion. Exp Physiol. 96, 104-113 (2011).
- Moses, T., Wagner, L., Fleming, S. D. TLR4-mediated Cox-2 expression increases intestinal ischemia/reperfusion-induced damage. J Leukoc Biol. 86, 971-980 (2009).
- Feinman, R., et al. HIF-1 mediates pathogenic inflammatory responses to intestinal ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 299, G833-G843 (2010).
- Lapchak, P. H., et al. The role of platelet factor 4 in local and remote tissue damage in a mouse model of mesenteric ischemia/reperfusion injury. PloS one. 7, e39934 (2012).
- Wen, S. H., et al. Ischemic postconditioning during reperfusion attenuates intestinal injury and mucosal cell apoptosis by inhibiting JAK/STAT signaling activation. Shock. 38, 411-419 (2012).
- Wang, F., et al. Temporal variations of the ileal microbiota in intestinal ischemia and reperfusion. Shock. 39, 96-103 (2013).
- Zou, L., Attuwaybi, B., Kone, B. C. Effects of NF-kappa B inhibition on mesenteric ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 284, G713-G721 (2003).
- Hassoun, H. T., et al. Alpha-melanocyte-stimulating hormone protects against mesenteric ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 282, G1059-G1068 (2002).
- Stallion, A., et al. Ischemia/reperfusion: a clinically relevant model of intestinal injury yielding systemic inflammation. J Pediatr Surg. 40, 470-477 (2005).
- Blikslager, A. T., Roberts, M. C., Rhoads, J. M., Argenzio, R. A. Is reperfusion injury an important cause of mucosal damage after porcine intestinal ischemia? Surgery. 121, 526-534 (1997).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
- Victoni, T., et al. Local and remote tissue injury upon intestinal ischemia and reperfusion depends on the TLR/MyD88 signaling pathway. Med Microbiol Immunol. 199, 35-42 (2010).
- Watanabe, T., et al. Toll-like receptor 2 mediates ischemia-reperfusion injury of the small intestine in adult mice. PloS one. 9, e110441 (2014).
- Pope, M. R., Fleming, S. D. TLR2 modulates antibodies required for intestinal ischemia/reperfusion-induced damage and inflammation. J. Immunol. 194, 1190-1198 (2015).
- Leung, F. W., Su, K. C., Passaro, E. Jr, Guth, P. H. Regional differences in gut blood flow and mucosal damage in response to ischemia and reperfusion. Am J Physiol. 263, G301-G305 (1992).
- Chiu, C. J., McArdle, A. H., Brown, R., Scott, H. J., Gurd, F. N. Intestinal mucosal lesion in low-flow states. I. A morphological, hemodynamic, and metabolic reappraisal. Arch Surg. 101, 478-483 (1970).
- Quaedackers, J. S., et al. An evaluation of methods for grading histologic injury following ischemia/reperfusion of the small bowel. Transplant Proc. 32, 1307-1310 (2000).
- Bianciardi, P., Scorza, R., Ghilardi, G., Samaja, M. Xanthine oxido-reductase activity in ischemic human and rat intestine. Free Radic Res. 38, 919-925 (2004).
- Yandza, T., et al. The pig as a preclinical model for intestinal ischemia-reperfusion and transplantation studies. J Surg Res. 178, 807-819 (2012).
