Summary
Здесь мы опишем детальную процедуру кишечной ишемии-реперфузии у мышей, что приводит к воспроизводимым травмы без смертности для поощрения стандартизации этой техники по полю. Эта модель кишечной травмы ишемии-реперфузии может быть использован для изучения клеточных и молекулярных механизмов повреждения и регенерации.
Abstract
Кишечная ишемия является опасным для жизни состояние, связанное с широким спектром клинических состояний, включая атеросклероз, тромбоз, гипотензия, некротический энтероколит, трансплантация кишечника, травмы и хроническое воспаление. Кишечный ишемии-реперфузии (ИК) травма является следствием острого мезентериального ишемии, вызванной недостаточным кровотоком через мезентериальных сосудов, что приводит к кишечным повреждением. Реперфузии после ишемии может еще более усугубить повреждение кишечника. Механизмы травмы ИК сложны и плохо изучены. Таким образом, экспериментальные малые животные модели имеют решающее значение для понимания патофизиологии травмы ИК и развитие новых видов лечения.
Здесь мы описываем модель мыши острой кишечной травмы IR, который обеспечивает воспроизводимый повреждение тонкой кишки без смертности. Это достигается за счет индукции ишемии в области дистальной подвздошной кишки с помощью временно occludinг периферийные и терминальные коллатеральные ветви верхней брыжеечной артерии в течение 60 мин с использованием микрососудистых клипов. Реперфузии в течение 1 ч или 2 ч после травмы результаты воспроизводимым травмы кишечника, рассмотренного гистологического анализа. Правильное положение микрососудистых клипов имеет решающее значение для данной процедуры. Поэтому ролик предоставляет подробный визуальный шаг за шагом описание этой методики. Эта модель кишечной травмы ИК могут быть использованы для изучения клеточных и молекулярных механизмов повреждения и регенерации.
Introduction
Кишечник очень чувствителен к нарушению кровотока, что вызывает ишемию и повреждение эпителия. Реперфузии после ишемии обеспечивает повторное насыщение кислородом ткани, и может дополнительно способствовать патологии. Таким образом, кишечная ишемия и реперфузионное повреждение связано с широким спектром патологий, в том числе некротизирующего энтероколита, отторжение аллотрансплантата в малом трансплантации кишечника, осложнения брюшной аорты хирургии аневризм, искусственного кровообращения и воспалительных 1,2 заболевания кишечника. Кишечные ИК травмы, особенно острой брыжеечной ишемии, является опасным для жизни состояние приводит к заболеваемости и смертности 3.
Несмотря на то, плохо понимают, как полагают кишечная ишемия-реперфузия (ИК) в случае травмы, связаны с изменениями в микрофлоры кишечника, а также производство активных форм кислорода и воспалительных цитокинов и хемокинов 1,4-6. Это приводит к активации как вNate и адаптивные иммунные механизмы , которые способствуют воспаление и ткани травмы 1,7,8.
Животные модели имеют решающее значение для понимания механизмов травмы ИК, так как они позволяют легко и амплитудно с потерей функции генетических экспериментов. Несколько моделей животных ИК были разработаны , которые включают в себя полную закупорку сосудов, низкий ишемию потока, и сегментирован окклюзии сосудов (суммированы в недавнем всеобъемлющем обзоре 9). Кишечная ишемия , вызванная полным сосудистой окклюзии верхней брыжеечной артерии (SMA) представляет собой простой и широко используется модель IR у крупных животных и грызунов 9-11. Тем не менее, различные участки кишечника имеют разную восприимчивость к травмам. Кроме того, разнообразный спектр анестетиков, анальгетиков, техник окклюзии артерии, а также несоответствие продолжительности ишемического повреждения и восстановления в результате различной степени травмы оправдав наше понимание биологии ИК по нескольким Studies. Таблица 1 демонстрирует эти несоответствия в мышиных ИК - исследований. Самый большой недостаток с использованием коротких ишемических раза (30-45 мин) нацеливает окно восстановления, на котором можно наблюдать заметные различия между случаями и контролем. Мягкий повреждение эпителия может быть решена через час после реперфузии, поэтому специализированная патологические показатели могут потребоваться, чтобы найти различия в эпителиальной реституции. В противоположность этому, чрезмерный ущерб, как это видно на 100 мин ишемического повреждения могут привести к полному denudement эпителия, где реституция не больше невозможна, увеличивая уровень смертности, а также время восстановления. Таким образом, здесь мы описываем детальную процедуру кишечника IR у мышей, что приводит к воспроизводимым травмы без смертности для поощрения стандартизации этой техники по всей нашей области. Эта модель кишечной травмы ИК могут быть использованы для изучения клеточных и молекулярных механизмов повреждения и регенерации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Исследования на животных были проведены в соответствии с Национальным институтом здравоохранения и руководящих принципов были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитет Трюдо института. 8-12 недельных мышей C57BL / 6 мышей использовали для исследования.
1. Подготовка к хирургии
- Подготовить и стерилизовать хирургические инструменты.
- Подготовка изофлуран на основе системы анестезии с конусообразной и подогреваемым площадку. Убедитесь, что накладка нагревается не перегревается (<39 ° С).
- Убедитесь, что изофлуран газа продувка адсорбера расположен правильно, чтобы обеспечить выпускные отверстия в нижней части контейнера не были заблокированы или окклюзия каким-либо образом. Взвесьте газа продувкой канистру до процедуры и веса документа на канистре. Выбросьте канистру, когда вес превышает канистра 50 г накопленной массы (~ 12 ч).
2. Анестезия
- Обезболить мышь с 3% изофлуран в индукционной камере (1 л / минO 2).
- Оценка глубины анестезии неспособностью оставаться в вертикальном положении, потеря целенаправленного добровольного движения, потеря мигательного рефлекса, расслабление мышц и потеря реакции на рефлекторную стимуляцию (палец ноги или хвост щепотку с давлением фирмы).
- Оценка частоты дыхания и рисунок, наблюдая стенки грудной клетки и брюшной движения. Под оптимальной анестезии, частота дыхания должна быть ~ 55-65 вдохов в минуту.
- Удалить мышь из индукции камеры и быстро брить область живота мыши.
- Для того, чтобы предотвратить высыхание роговицы, поместите мягкий глазной мази в глаза.
- Поместите курсор на нагретом площадку и подключить его через нос конуса к системе анестезии. Убедитесь, что мембрана конус латекса нос плотно надевается на голову мыши и нет утечки изофлуран.
- Снижение изофлуран ставки до 1,5%, и вводят бупренорфин (0,1 мг / кг) и кетамина (10 мг / кг) подкожно, чтобы предотвратить скручивание болевого кадной.
- Wipe-ее кожа области работы с стерильным ватным тампоном, смоченным раствором Бетадин хирургическим последующим 70% этанола.
3. хирургия
- Сделать см лапаротомии средней линии 3-5 с операционными ножницами. Зона работы Крышка с стерильной неприлипающими площадки, смоченным физиологическим раствором. Изолировать слепую кишку и подвздошную и подвергать брыжеечной артерии с помощью ватного тампона, смоченные в физиологическом растворе.
- Чтобы облегчить зажим претендуете, сделать небольшие зарубки в брыжейки окружающих брыжеечной артерии с использованием тонких ирис scissors.To сделать это, осторожно поднимите кишечник с гардеробными пинцетом и разрезать брыжейки на обеих сторонах верхней брыжеечной артерии в месте желаемого клипа (рис 1А). Затем добавляют несколько капель стерильного физиологического раствора в области нужное положение клипа перед нанесением клипов.
Примечание: Для выполнения операции фиктивный, выполните хирургическую процедуру до шага 3.2. Не применять зажимы. Вместо этого, поддерживать ткань влажной теплой добавленнием сЭлин, как описано в 3.6 в течение 1 часа. После этого переходите к шагу 4.1, - Закупоривать первые ветви порядка верхней брыжеечной артерии с микрососудистых зажимами (70 г) с использованием силы клип для наложения для создания 5-7 см область ишемического подвздошной прилегающих к слепой кишке (рис 1В). Хотя позиция судов является консервативным, могут быть небольшие различия между мышами (см примеры на рисунке 1). Таким образом, 2 или 3 ролика, как правило , требуется (см расположение зажимов на рисунке 1А, D, E, черные стрелки).
Примечание: Используйте зажимы высокого качества судов. клипы высокого давления могут повредить сосуды и предотвратить регенерацию, тогда как низкие клипами давления (<30 г) не может полностью блокировать кровоток. - Блок коллатерального кровотока через кишечник с помощью двух микрососудистых клипов через сосуды (40 г) силы, демаркации области ишемического кишечника (рис 1). Закупорка коллатеральных сосудов требуетсяпредотвратить приток крови от соседних кровеносных сосудов (см расположение зажимов на рисунке 1А, D, E, зеленые стрелки).
- Дополнительно: Добавить раствор гепарина (6 USP единиц / мл), чтобы предотвратить свертывание крови. По каплям добавляют 0,5 мл раствора гепарина с изолированной кишки.
- Влажные стерильные без клейкий коврик деликатных вытирает физиологическим раствором, предварительно нагретый до 37 ° С и применяются к хирургической области. Убедитесь, что влажные салфетки остается влажным в течение всей процедуры.
- Поддерживать ишемия в течение 60 мин с использованием 1-1,5% изофлуран анестезии во всем. Если процедура ишемия выполнена правильно, ишемическая область изменится вина красного цвета примерно 30 мин. Обратите внимание , что кровеносные сосуды дистальных к положению зажима в увеличенном масштабе при ишемии (рис 1, правая панели) , свидетельствующего об успешном прикус.
- Внимательно следить за мышь во время стадии ишемии. Продолжать применять физиологический раствор в неприлипающими площадку, охватывающей участок хирургии.
- отметкакрая ишемизированной области пипеткой 20 мкл Gill`s 3 гематоксилином на ткани для облегчения уборки ишемизированной ткани и прилегающей здоровой ткани от той же мыши для сравнения (рис 1E, правая панель).
4. Реперфузии этап
- В конце ишемией добавить несколько капель физиологического раствора на площади клипа и аккуратно удалить микрососудистых зажимы с зажимом для наложения. Затем, осторожно надавите кишечника обратно в брюшную полость с помощью солевых смачивают советы хлопка. Удалить неприлипающими площадку и закрыть брюшной стенки и кожи, используя 9 мм зажимы навитые из нержавеющей стали. Если реперфузии выполняется дольше, чем 3 ч, используют рассасывающиеся викрил швом, чтобы закрыть брюшной стенки перед нанесением раны клипов на коже.
- Поддерживать мышей в чистую клетку, нагреваемой в течение желаемого промежутка времени (30 мин, 60 мин, 120 мин, или 180 мин) для фазы реперфузии.
- Проверьте животных по крайней мере, каждые 30 минут, чтобы обеспечивающих стабильность.
- Эвтаназии мышей СО 2 передозировку с последующим смещением шейных позвонков в заданное время после реперфузии.
- Открыть брюшной полости и собирать ишемическую кишечной ткани для дальнейшего анализа. Урожай здоровой нормальная ткань прилегающих к поврежденной ткани в качестве внутреннего контроля для учета любой системной реакции на травму.
Примечание: Этот элемент управления является более подходящим, чем ложнооперированных контрольных мышей, потому что ложнооперированных мышей не подвергаются системной реакции на ИК-индуцированного повреждения. - Промойте кишечного содержимого с помощью 30 мл шприц с прикрепленной иглой зондового заполненной физиологическим раствором, а затем разрезается кишечник в продольном направлении. Если образец кишечника необходим для анализа экспрессии генов, вырезать фрагмент 1,5 мм в продольном направлении, и использовать оставшуюся часть для гистологического анализа.
- Для гистологического анализа, подготовить рулет с помощью пары щипцов катать INTESTине.
- Для поддержания свернутую форму, поместите кусочки кишечника между биопсии пенопластовых прокладок в кассетах ткани (рисунок 2). Поместите кассеты в 10% забуференном формалине.
- Закрепить ткани в формалине в течение по крайней мере 24 часов. Заменить формалин с 70% этанола в течение еще 24 ч. Магазин ткани в 70% этаноле до бесконечности при комнатной температуре.
- Вставить в парафин, вырезать секции 5 мкм и пятна с гематоксилином и эозином с использованием стандартного протокола (рисунок 3).
6. Подсчет очков
- Оценка мышиный травмы ишемии-реперфузии , как в таблице 2. Выберите подходящий метод подсчета очков.
- Дополнительно: Разделить поле зрения на четыре секции, так как тяжесть травмы изменяется по всему разрезу.
- Вычислить средний балл каждой секции из баллов, полученных вслепую.
- Сравните степень поврежденной ткани между случаями и контролем, а также гое неповрежденной ткани с использованием теста Крускала-Уоллиса, а затем несколькими тестовыми сравнений Данна.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы оптимизировали экспериментальный протокол ИК хирургии, чтобы получить воспроизводимое ИК-индуцированного повреждения подвздошной кишки у мышей. Представитель результаты демонстрируются в этом разделе.
На рисунке 1 показаны примеры позиции микрососудистых клипы , чтобы вызвать ишемию подвздошной. Черные стрелки показывают положение главных зажимов окклюзии ветви первого порядка верхней брыжеечной артерии. Зеленые стрелки показывают положение дополнительных клипов, чтобы блокировать приток крови из коллатеральных сосудов. Обратите внимание, увеличенный размер закупоренных сосудов дистальных к положению зажимов и изменению цвета ишемического области intestinte. После того, как удаление зажимов в конце ишемией кровеносных сосудов восстановить кровоток и вернуться к нормальному размеру.
На рисунке 2 показан пример кассеты ткани , содержащей рулеты , приготовленные из ConТроль и ишемические области подвздошной кишки после 1 часа ишемии, после чего следует 1 часа реперфузии. Часть селезенки была включена для облегчения позиционирования и управления ИК кишечника во время обработки и окрашивания. Обратите внимание, цветовое различие между контролем и ишемической ткани.
На рисунке 3 показаны репрезентативные гематоксилином и эозином контроля и ишемических областей подвздошной после 1 часа ишемии, или 1 ч ишемии с последующим 2 ч реперфузии. Обратите внимание на серьезные повреждения эпителия после 1 ч ишемии характеризуется геморрагической ворсинок, эпителий denudement с частичной до полной абляции крипт и инфильтрация клеток иммунной (звездочка). После 2 ч от реперфузионного повреждения ворсинок и воспаления сохраняются (звездочка), но нет кровоизлияние ткани.
На рисунке 4 показан пример анализа воспалительного тИЦtokines выражение через 1 ч и 2 ч после ишемии при ишемическом и контроля кишечника. Обратите внимание, повышающая регуляция экспрессии мРНК TNF, IL-1b, IL-6 и CXCL2 в 1 ч и 2 ч после ишемии-реперфузии по сравнению с контролем здоровой ткани.
Рисунок 1: Индукция ишемией с использованием Сосудистые зажимы (A) изолированную область кишечника , содержащей слепую кишку и подвздошную кишку.. Небольшие разрезы в брыжейки окружающих брыжеечной артерии сделаны, чтобы облегчить применение клипа. (B) микрососудистой приложение клип с помощью зажима для наложения. (C) Положение микрососудистых зажимов на верхней брыжеечной артерии , чтобы вызвать ишемию. (D, E). Примеры структуры и расположения сосудистой сети клипа в разных мышей. Стрелки указывают на ишемическую область подвздошной отмеченного гематоксилином. <A HREF = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53881/53881fig1large.jpg" целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 2:. Подготовка ткани для гистологического анализа ткани кассеты , содержащей рулеты , приготовленные из ишемических и контрольных областей подвздошной после 1 часа ишемии с последующим 1 ч реперфузии Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: гематоксилином и эозином подвздошной после Ишемии гематоксилином и эозином контрольных и ишемических областей подвздошной после 1 часа ишемии, или 1 час ишемии.после чего 2 ч реперфузии. Bars = 500 мкм (верхние панели), 200 мкм (нижние панели). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Экспрессия воспалительными цитокинами при ишемии-реперфузии экспрессия CXCL2, TNF, IL-6, IL-1b измеряли через 1 ч и 2 ч после ишемии-реперфузии в ишемизированной ткани (IR) и нормальной контрольной ткани (С). рядом с ишемическим области по ПЦР в реальном времени. п = 3 - 8 мышей на группу, * р <0,05; ** Р <0,01; *** Р <0,001. Усы представляют СЭМ Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Мышиные Виды | Анестезия / Обезболивание | Метод закупорка Артерии | время Ишемия | Время после реперфузии | Справка | |||
| крыс Sprague-Dawley | пентобарбиталнатрием | Закупорка SMA и целиакией артерии с помощью аневризмы клип или зажим | 45 мин | 2 ч | 12 | |||
| C57BL6 / 129 | 2% галотана | Закупорка брыжеечных артериол, и проксимальный и дистальный участки ишемизированной ткани. | От 30 до 130 мин | 6 ч | 13 | |||
| C57BL / 6 | Кетамин, Isoflurane | Закупорка SMA с помощью аневризмы клипов. Закупорка залога Circulция в ближней и дальней зонах. | 1 час | 1,5 ч | 4,8,11 | |||
| С3Н / Hej | пентобарбиталнатрием | Закупорка с помощью аневризмы клип или зажим | 40 мин | 6 ч | 14 | |||
| C56BL / 6 | Isoflurane | Закупорка SMA и ileocolic артерии с помощью аневризмы клип или зажим | 100 мин | 1, 2, 4, 24 часа в сутки | 15 | |||
| C57BL / 6 | уретан | Закупорка с помощью аневризмы клип или зажим | 45 мин | 60 мин | 16 | |||
Таблица 1: Изменения в методологии в мышиных Кишечные ИК-индуцированной травмы
| Система подсчета очков гистологии | Справка | ||
| Оценка 0: Нормальная слизистая оболочка | 13,17,18 | ||
| 1 класс: субэпителиальные пространство на ворсинок наконечника | |||
| 2-й класс: Более расширенное пространство субэпителиальное | |||
| Оценка 3: Эпителиальные подъема вдоль ворсинок сторон | |||
| Оценка 4: зачистка ворсинки | |||
| Оценка 5: Потеря ворсинок ткани | |||
| 6 класс: Crypt слой миокарда | |||
| 7 класс: Трансмукозная миокарда | |||
| 8 класс: Трансмуральный миокарда | |||
| Оценка 0: Нормальная слизистая оболочка | 4,8,11,19-21 | ||
| Оценка 1: шелушение клеток на ворсинчатыми наконечников | |||
| Оценка 3: Villi отсутствовали, но крипты были все еще легко обнаружить | |||
| Оценка 4: Полное отсутствие эпителиальных структур и трансмурального некроза | |||
| Оценка 0: Нормальный ворсинок | 6,22-31 | ||
| Оценка 1: Villi с искажением наконечником | |||
| 2-й класс: бокаловидных клеток и пространства Gugenheims 'отсутствуют | |||
| Оценка 3: Villi с пятнистой нарушением эпителиальных клеток | |||
| 4 класс: Villi с открытыми, но нетронутыми с собственной пластинки эпителиальной клетки закручивание | |||
| 5 класс: Propria является Lamina источая | |||
| 6 класс: Вили, что кровоизлияние дисплей или ворсинок, которые обнажаются | |||
| Оценка 0: Нормальная гистология 32,33 | |||
| Оценка 1: Незначительное нарушение поверхностного эпителия | |||
| 2-й класс: Эпителиальные травмы потери клеток на ворсинки наконечника | |||
| Оценка 3: Мукозные сосудистую гиперемию, кровоизлияние и некроз очаговый с потерей менее половины ворсинки | |||
| Оценка 4: Повреждение распространяется на более чем на одну половину ворсинок | |||
Таблица 2: гистологии скоринговых систем в мышиных Кишечные ИК-индуцированной травмы
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Разработка моделей мышей кишечной травмы ИК значительно улучшили понимание механизмов повреждения тканей и помогли в развитии потенциальных терапевтических стратегий для сведения к минимуму повреждения тканей 7,9,11,34. Критические шаги этого протокола правильное позиционирование микрососудистых клипов, правильно сроки ишемии и надлежащей гистологической оценкой травмы ИК.
Продолжительность ишемии имеет решающее значение для последующего повреждения эпителия. Типичное время, необходимое, чтобы вызвать воспроизводимое повреждение ИК без осложнений и смертности экспериментальных мышей составляет 45-60 мин с последующим 2-3 ч реперфузии. Длительные периоды ишемии могут приводит к полной потере эпителия и повышенной смертности. Например, в свиных модели тощей ишемии, 60 мин закупорка приводит к частичной потере вилле эпителием, в то время как закупорка в течение 120 мин привело к полной потере ворсинок эпителия 35. яmportantly, стерилен и генетически модифицированных мышей, может отображать повышенную чувствительность к инфракрасному излучению, травмы, и, следовательно, оптимальное время ишемии и реперфузии, возможно, должны быть оптимизированы в предварительных экспериментах. Несмотря на то, типичное время для оценки повреждения тканей после реперфузии составляет 2-3 ч, больше времени (12 ч) требуется для анализа мобилизации кишечных стволовых клеток 36. Кроме того, изменения в синантропных микробиоты и TLR / Nod-опосредованной сигнализации может существенно повлиять на исход из ИК травмы 4,8,37-39.
Правильное положение микрососудистых зажимов также имеет важное значение для воспроизводимых травмы ИК. Здесь мы описываем модель ИК травмы мышиного дистальной подвздошной. Отдельные части кишечника, как известно, показывают разную чувствительность к травмам IR. Например, тощей более чувствительны к инфракрасному излучению , чем травма подвздошной кишки и ободочной кишки 9,34,40. На самом деле, ишемия-реперфузия модель тощей окклюзией SMA с однимклип обычно используется для изучения механизмов повреждения ИК (см. 9 для всестороннего обзора различных методов ИК-травмы у животных). Тем не менее, точное положение зажима и анализа различных участков кишечника, а также различные методы анестезии варьирует от этих исследований, что делает его трудно воспроизвести (см таблицу 1). Дополнительное осложнение ИК травмы тощей является высокая смертность, поскольку положение сосудистого зажима близко к корню SMA влияет на приток крови к широкой области кишечника. Таким образом, в настоящем исследовании мы разработали протокол, чтобы вызвать последовательное ИК повреждение подвздошной, который легко воспроизвести. Для того, чтобы побудить воспроизводимый ИК повреждение подвздошной, правильное положение сосудистых зажимов имеет решающее значение. Это достигается за счет закупоривания периферийные и сопутствующие ветви брыжеечной artery.The степени повреждения ИК можно оценить с помощью оценки гематоксилином и эозином секций с использованием оригинального Чиу / PARK или модифицированные системы балл 11,18,34,41,42. Кроме того, оценка повреждения ткани может быть выполнена с использованием терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы биотин-дУТФ ник мечение по концам (TUNEL) окрашивание фрагментированной ДНК или активный каспазы-3 иммуногистохимического окрашивания, анализ нейтрофилами путем измерения активность миелопероксидазы или иммуногистохимического оценки нейтрофилы с использованием Gr -1, или Ly6G антитела окрашивания 7,11. Воспалительные цитокины и хемокины, такие как IL-1b, TNF, IL-6, CXCL1, CXCL2, CCL2 можно оценить с помощью ПЦР в реальном времени 2,4,8. Пример анализа воспалительного экспрессии цитокинов показано на рисунке 4.
Важно отметить , что , несмотря на высокую воспроизводимость и доступности ИК повреждения подвздошной кишки, эта модель не может отражать все клинические признаки болезни человека, в частности хронических болезненных состояний и условий , с частичной закупоркой верхней брыжеечной артерии 9 9,43. Таким образом, модели , использующие крупных животных, таких как свиньи разрабатываются 9,44. Тщательный отбор животной модели в зависимости от состояния человека изучается имеет решающее значение. В целом, мы опишем простую и надежную модель кишечной ИК повреждения, которые могут быть использованы для изучения клеточного и молекулярный механизм повреждения эпителия и регенерации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана научным фондом Российской, грант №. 14-50-00060 и ООО RUSCHEMBIO. Эта работа также была поддержана Фондом Crohn`s и колитах Америки грант 294083 (для AVT) и НИЗ грант RO1 DK47700 (до CJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heated Pad | Sunbeam | E12107-819 | Alternative: Braintree Scientific heated pad |
| Table top research anesthesia Machine | Vasco | UCAP 0001-0000171 | Alternative: Parkland Scientific, V3000PS |
| Nose Cone | Parkland Scientific | ARES500 | |
| Scavenger canister and replacement cartridge | Parkland Scientific | 80000, 80120 | |
| Induction Chamber | Surgivet | V711802 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-10 | Controlled substance, contact IACUC |
| Animal clipper | Oster | Oster Golden A5 078005-050-003 | |
| Ophthalmic ointment | Webster | 8804604 | |
| Buprenorphine | McKesson | 562766 | Controlled substance,contact IACUC |
| Ketaset (Ketamine HCl) | Pfizer | NADA 45-290 | Controlled substance, contact IACUC |
| Cotton tips | Puritan medical products | 806-WC | Autoclave before use |
| Betadine | Purdue Products | 67618-150-17 | 10% Povidone-Iodine |
| Sterile saline solution | Aspen | 46066-807-60 | Adjust to room temperature before use |
| IR rodent thermometer | BIOSEB | BIO-IRB153 | |
| Micro vascular clips, 70 g | Roboz Surgical | RS5424, RS5435 | Alternative: WPI 14121, for SMA occlusion |
| Micro vascular clips, 40 g | Roboz Surgical | RS6472 | Alternative:WPI 14120, for collateral vessels occlusion |
| Clip applying forceps | World Precision Instruments | 14189 | Alternative: Roboz #RS-5410 or #RS-5440 |
| Gill's 3 hematoxylin | Thermo Scientific | 14-390-17 | |
| Surgical staples, Reflex 9 mm | Cell Point Scientific | 201-1000 | |
| Autoclip applier | Beckton Dickinson | 427630 | |
| Byopsy foam pad | Simport | M476-1 | |
| Tissue cassette | Fisher Healthcare | 15182701A | Histosette II combination lid and base |
| 10% buffered formalin | Fisher Scientific | 245-684 | |
| Surgical iris scissors | World Precision Instruments | 501263-G SC | Alternative: Roboz RS6816 |
| Operating scissors | World Precision Instruments | 501219-G | Alternative: Roboz RS6814 |
| Dressing forceps | Roboz Surgical | RS-5228, RS-8122 | Alternative: World Precision Instruments 1519-G |
| Heparin, endotoxin free, 300 USP units/vial, 50 mg | Sigma | 2106 | |
| Reflex wound clip removing forceps | Roboz Surgical | RS-9263 | Alternative: World Precision Instruments: 500347 |
| Mice C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | Stock No 0664 | |
| Telfa non-adherent dressings, 3 x 4, sterile | Coviden | 1050 | |
| Fisherbrand transfer pipets | Fischer Scientific | 13-711-5AM | Use pipets to dropwise add saline |
References
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nat Med. 17, 1391-1401 (2011).
- Lenaerts, K., et al. New insights in intestinal ischemia-reperfusion injury: implications for intestinal transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 18, 298-303 (2013).
- Yasuhara, H. Acute mesenteric ischemia: the challenge of gastroenterology. Surg Today. 35, 185-195 (2005).
- Perez-Chanona, E., Muhlbauer, M., Jobin, C. The microbiota protects against ischemia/reperfusion-induced intestinal injury through nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 2 (NOD2) signaling. Am J Pathol. 184, 2965-2975 (2014).
- Lee, H., et al. Delineating the relationships among the formation of reactive oxygen species, cell membrane instability and innate autoimmunity in intestinal reperfusion injury. Mol Immunol. 58, 151-159 (2014).
- Yoshiya, K., et al. Depletion of gut commensal bacteria attenuates intestinal ischemia/reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 301, G1020-G1030 (2011).
- Wu, M. C., et al. The receptor for complement component C3a mediates protection from intestinal ischemia-reperfusion injuries by inhibiting neutrophil mobilization. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 9439-9444 (2013).
- Muhlbauer, M., Perez-Chanona, E., Jobin, C. Epithelial cell-specific MyD88 signaling mediates ischemia/reperfusion-induced intestinal injury independent of microbial status. Inflamm Bowel Dis. 19, 2857-2866 (2013).
- Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: progress and promise for translational research. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308, G63-G75 (2015).
- Megison, S. M., Horton, J. W., Chao, H., Walker, P. B. A new model for intestinal ischemia in the rat. J Surg Res. 49, 168-173 (1990).
- Goldsmith, J. R., et al. Intestinal epithelial cell-derived mu-opioid signaling protects against ischemia reperfusion injury through PI3K signaling. Am J Pathol. 182, 776-785 (2013).
- Cuzzocrea, S., et al. Glycogen synthase kinase-3beta inhibition attenuates the development of ischaemia/reperfusion injury of the gut. Intensive Care Med. 33, 880-893 (2007).
- Farber, A., et al. A specific inhibitor of apoptosis decreases tissue injury after intestinal ischemia-reperfusion in mice. J Vasc Surg. 30, 752-760 (1999).
- Ben, D. F., et al. TLR4 mediates lung injury and inflammation in intestinal ischemia-reperfusion. J Surg Res. 174, 326-333 (2012).
- Watson, M. J., et al. Intestinal ischemia/reperfusion injury triggers activation of innate toll-like receptor 4 and adaptive chemokine programs. Transplant Proc. 40, 3339-3341 (2008).
- Watanabe, T., et al. Activation of the MyD88 signaling pathway inhibits ischemia-reperfusion injury in the small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303, G324-G334 (2012).
- Murayama, T., et al. JNK (c-Jun NH2 terminal kinase) and p38 during ischemia reperfusion injury in the small intestine. Transplantation. 81, 1325-1330 (2006).
- Park, P. O., Haglund, U., Bulkley, G. B., Falt, K. The sequence of development of intestinal tissue injury after strangulation ischemia and reperfusion. Surgery. 107, 574-580 (1990).
- Jilling, T., Lu, J., Jackson, M., Caplan, M. S. Intestinal epithelial apoptosis initiates gross bowel necrosis in an experimental rat model of neonatal necrotizing enterocolitis. Pediatr Res. 55, 622-629 (2004).
- Aprahamian, C. J., Lorenz, R. G., Harmon, C. M., Dimmit, R. A. Toll-like receptor 2 is protective of ischemia-reperfusion-mediated small-bowel injury in a murine model. Pediatr Crit Care Med. 9, 105-109 (2008).
- Tatum, P. M., Harmon, C. M., Lorenz, R. G., Dimmitt, R. A. Toll-like receptor 4 is protective against neonatal murine ischemia-reperfusion intestinal injury. J Pediatr Surg. 45, 1246-1255 (2010).
- Fleming, S. D., et al. Anti-phospholipid antibodies restore mesenteric ischemia/reperfusion-induced injury in complement receptor 2/complement receptor 1-deficient mice. J. Immunol. 173, 7055-7061 (2004).
- Fleming, S. D., et al. Mice deficient in complement receptors 1 and 2 lack a tissue injury-inducing subset of the natural antibody repertoire. J. Immunol. 169, 2126-2133 (2002).
- Lapchak, P. H., et al. Platelets orchestrate remote tissue damage after mesenteric ischemia-reperfusion. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, G888-G897 (2012).
- Rehrig, S., et al. Complement inhibitor, complement receptor 1-related gene/protein y-Ig attenuates intestinal damage after the onset of mesenteric ischemia/reperfusion injury in mice. J. Immunol. 167, 5921-5927 (2001).
- Hoffman, S. M., Wang, H., Pope, M. R., Fleming, S. D. Helicobacter infection alters MyD88 and Trif signalling in response to intestinal ischaemia-reperfusion. Exp Physiol. 96, 104-113 (2011).
- Moses, T., Wagner, L., Fleming, S. D. TLR4-mediated Cox-2 expression increases intestinal ischemia/reperfusion-induced damage. J Leukoc Biol. 86, 971-980 (2009).
- Feinman, R., et al. HIF-1 mediates pathogenic inflammatory responses to intestinal ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 299, G833-G843 (2010).
- Lapchak, P. H., et al. The role of platelet factor 4 in local and remote tissue damage in a mouse model of mesenteric ischemia/reperfusion injury. PloS one. 7, e39934 (2012).
- Wen, S. H., et al. Ischemic postconditioning during reperfusion attenuates intestinal injury and mucosal cell apoptosis by inhibiting JAK/STAT signaling activation. Shock. 38, 411-419 (2012).
- Wang, F., et al. Temporal variations of the ileal microbiota in intestinal ischemia and reperfusion. Shock. 39, 96-103 (2013).
- Zou, L., Attuwaybi, B., Kone, B. C. Effects of NF-kappa B inhibition on mesenteric ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 284, G713-G721 (2003).
- Hassoun, H. T., et al. Alpha-melanocyte-stimulating hormone protects against mesenteric ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 282, G1059-G1068 (2002).
- Stallion, A., et al. Ischemia/reperfusion: a clinically relevant model of intestinal injury yielding systemic inflammation. J Pediatr Surg. 40, 470-477 (2005).
- Blikslager, A. T., Roberts, M. C., Rhoads, J. M., Argenzio, R. A. Is reperfusion injury an important cause of mucosal damage after porcine intestinal ischemia? Surgery. 121, 526-534 (1997).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
- Victoni, T., et al. Local and remote tissue injury upon intestinal ischemia and reperfusion depends on the TLR/MyD88 signaling pathway. Med Microbiol Immunol. 199, 35-42 (2010).
- Watanabe, T., et al. Toll-like receptor 2 mediates ischemia-reperfusion injury of the small intestine in adult mice. PloS one. 9, e110441 (2014).
- Pope, M. R., Fleming, S. D. TLR2 modulates antibodies required for intestinal ischemia/reperfusion-induced damage and inflammation. J. Immunol. 194, 1190-1198 (2015).
- Leung, F. W., Su, K. C., Passaro, E. Jr, Guth, P. H. Regional differences in gut blood flow and mucosal damage in response to ischemia and reperfusion. Am J Physiol. 263, G301-G305 (1992).
- Chiu, C. J., McArdle, A. H., Brown, R., Scott, H. J., Gurd, F. N. Intestinal mucosal lesion in low-flow states. I. A morphological, hemodynamic, and metabolic reappraisal. Arch Surg. 101, 478-483 (1970).
- Quaedackers, J. S., et al. An evaluation of methods for grading histologic injury following ischemia/reperfusion of the small bowel. Transplant Proc. 32, 1307-1310 (2000).
- Bianciardi, P., Scorza, R., Ghilardi, G., Samaja, M. Xanthine oxido-reductase activity in ischemic human and rat intestine. Free Radic Res. 38, 919-925 (2004).
- Yandza, T., et al. The pig as a preclinical model for intestinal ischemia-reperfusion and transplantation studies. J Surg Res. 178, 807-819 (2012).
