Summary
A continuación se describe el procedimiento detallado de isquemia-reperfusión intestinal en ratones que produce lesiones reproducibles sin mortalidad para fomentar la estandarización de esta técnica a través del campo. Este modelo de lesión de isquemia-reperfusión intestinal puede ser utilizado para estudiar los mecanismos celulares y moleculares de la lesión y regeneración.
Abstract
La isquemia intestinal es una afección potencialmente mortal asociado con una amplia gama de condiciones clínicas que incluyen la aterosclerosis, trombosis, hipotensión, enterocolitis necrotizante, trasplante de intestino, el trauma y la inflamación crónica. lesión intestinal por isquemia-reperfusión (IR) es una consecuencia de isquemia mesentérica aguda, causada por el flujo inadecuado de sangre a través de los vasos mesentéricos, lo que resulta en el daño intestinal. Reperfusión después de la isquemia puede exacerbar aún más el daño del intestino. Los mecanismos de la lesión IR son complejos y poco conocidos. Por lo tanto, los modelos experimentales de animales pequeños son fundamentales para la comprensión de la fisiopatología de la lesión IR y el desarrollo de nuevas terapias.
Aquí se describe un modelo de ratón de lesión IR intestinal aguda que proporciona lesión reproducible del intestino delgado sin mortalidad. Esto se consigue por la isquemia inducir en la región del íleon distal por temporalmente ocludinag las ramas colaterales periféricos y terminales de la arteria mesentérica superior durante 60 minutos con clips microvasculares. Reperfusión durante 1 hora, o 2 horas después de la lesión resulta en lesión reproducible del intestino examinado por análisis histológico. La correcta posición de las pinzas microvasculares es crítica para el procedimiento. Por lo tanto el clip de vídeo proporciona una detallada descripción visual paso a paso de esta técnica. Este modelo de lesión intestinal IR se puede utilizar para estudiar los mecanismos celulares y moleculares de la lesión y regeneración.
Introduction
El intestino es muy sensible a la interrupción del flujo de sangre que provoca isquemia y daño epitelial. Reperfusión después de la isquemia proporciona re-oxigenación del tejido, y puede promover aún más la patología. Por lo tanto, la lesión por isquemia y reperfusión intestinal se asocia con una amplia gama de patologías, incluyendo enterocolitis necrotizante, rechazo de aloinjertos en el trasplante de intestino delgado, las complicaciones de la cirugía de aneurisma de aorta abdominal, derivación cardiopulmonar, y 1,2 enfermedad inflamatoria intestinal. IR lesión intestinal, isquemia mesentérica aguda sobre todo, es una condición que amenaza la vida como resultado de la morbilidad y la mortalidad 3.
Aunque poco entendido, se cree que intestinal por isquemia-reperfusión (IR) daño a estar asociado con cambios en la microflora intestinal, así como la producción de especies reactivas del oxígeno y citoquinas inflamatorias y quimiocinas 1,4-6. Esto conduce a la activación de ambos enNate y mecanismos inmunes adaptativas, que promueven la inflamación y el tejido 1,7,8 lesión.
Los modelos animales son fundamentales para la comprensión de los mecanismos de la lesión por IR, ya que permiten una fácil ganancia y la pérdida de experimentos genéticos de la función. Varios modelos animales de IR se han desarrollado, que incluyen la oclusión vascular completa, bajo la isquemia de flujo, y segmentada de oclusión vascular (que se resumen en una revisión exhaustiva reciente 9). La isquemia intestinal causado por la oclusión vascular completa de la arteria mesentérica superior (SMA) es un modelo sencillo y de uso común de IR en animales grandes y roedores 9-11. Sin embargo, las diferentes áreas del intestino tienen diferente susceptibilidad a la lesión. Además, la diversa gama de anestésicos, analgésicos, técnicas de oclusión de la arteria, así como la inconsistencia en la duración de la lesión isquémica y resultado de recuperación en grados variables de lesión de confusión nuestra comprensión de la biología de IR a través de múltiples studies. La Tabla 1 muestra estas inconsistencias en los estudios de IR murino. El mayor inconveniente del uso de los tiempos de isquemia más cortos (30-45 min) se dirige a la ventana de la recuperación sobre la cual se pueden observar diferencias discernibles entre los casos y controles. lesión leve en el epitelio puede ser resuelto de una hora después de la reperfusión, por lo tanto, se especializó métricas patológicos pueden ser necesarios para encontrar las diferencias en la restitución epitelial. Por el contrario, un daño excesivo, como se ve por 100 min de la lesión isquémica puede resultar en la denudement completa del epitelio, cuando la restitución ya no es posible, el aumento de la tasa de mortalidad y el tiempo de recuperación. Por lo tanto, aquí se describe el procedimiento detallado de la RI intestinal en ratones que produce lesiones reproducibles sin mortalidad para fomentar la estandarización de esta técnica a través de nuestro campo. Este modelo de lesión intestinal IR se puede utilizar para estudiar los mecanismos celulares y moleculares de la lesión y regeneración.
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Protocol
Se llevaron a cabo estudios con animales de acuerdo con el Instituto Nacional de Salud directrices y fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el uso comité del Instituto Trudeau. 8-12 semanas de edad C57BL / 6 ratones se utilizaron para el estudio.
1. Preparación para la Cirugía
- Preparar y esterilizar instrumentos quirúrgicos.
- Preparar sistema de anestesia basada en isoflurano con el cono de la nariz y la almohadilla caliente. Asegúrese de que la almohadilla caliente no se ha recalentado (<39 ºC).
- Asegúrese de que el isoflurano recipiente de recogida de gases está colocado correctamente para asegurar que los orificios de escape en la parte inferior de la lata no se bloquean o ocluido de ninguna manera. Pesar recipiente de recogida de gases antes del procedimiento y el peso del documento en el cartucho. Deseche el cartucho cuando el peso del recipiente es superior a 50 g de peso acumulado (~ 12 h).
2. anestesia
- Anestesiar al ratón con 3% de isoflurano en una cámara de inducción (1 L / minO 2).
- Evaluar la profundidad anestésica por una incapacidad para permanecer en posición vertical, pérdida de movimiento intencional voluntaria, pérdida del reflejo de parpadeo, la relajación muscular y la pérdida de respuesta a la estimulación reflex (dedo del pie o pellizco de la cola con una presión firme).
- Evaluar la frecuencia respiratoria y el patrón mediante la observación de los movimientos de la pared torácica y abdominal. Bajo anestesia óptima, la tasa de respiración debe ser ~ 55-65 respiraciones por minuto.
- Retire ratón desde la cámara de inducción y afeitar rápidamente el área del abdomen del ratón.
- Para evitar la desecación de la córnea, colocar pomada oftálmica sosa en los ojos.
- Coloca el ratón sobre la almohadilla caliente y conectarlo a través de cono de la nariz con el sistema de anestesia. Asegúrese de que la membrana cono de la nariz de látex se ajusta firmemente sobre la cabeza del ratón y no hay fugas de isoflurano.
- Reducir la tasa de isoflurano al 1,5%, e inyectar buprenorfina (0,1 mg / kg) y ketamina (10 mg / kg) por vía subcutánea para prevenir wind-up del dolor en cascada.
- limpie THe la piel de la zona de operación con un hisopo de algodón estéril empapada con una solución de Betadine quirúrgico seguido de etanol al 70%.
3. Cirugía
- Hacer una laparotomía cm de la línea media de 3-5 con tijeras de funcionamiento. Área de actividad de la cubierta con el cojín no adherente estéril humedecido con solución salina. Aislar ciego y el íleon y exponer la arteria mesentérica superior usando hisopos de algodón humedecidos en solución salina.
- Para facilitar la aplicación de clips, hacer pequeñas muescas en el mesenterio que rodea la arteria mesentérica superior usando iris finas scissors.To ello, levante suavemente el intestino con una pinza vestidores y cortar mesenterio a ambos lados de la arteria mesentérica superior en la posición de corte deseada (Figura 1A). A continuación, añadir algunas gotas de solución salina estéril a la zona de la posición de clip deseado antes de aplicar clips.
Nota: Para realizar la cirugía simulada, siga el procedimiento quirúrgico hasta el paso 3.2. No aplicar clips. En su lugar, mantener el tejido húmedo por el agregado s tibiaaline como se describe en 3.6 durante 1 h. Después, continúe en el paso 4.1, - Ocluir las primeras ramas de la orden de la arteria mesentérica superior con clips microvasculares (70 g de fuerza) utilizando un aplicador de clips para crear una región de 5-7 cm del íleon isquémica adyacente al ciego (Figura 1B). Aunque la posición de los vasos es conservadora, puede haber ligeras variaciones entre los ratones (ver ejemplos en la Figura 1). Por lo tanto, se requieren generalmente 2 o 3 clips (ver la situación de los clips en la Figura 1A, D, E, flechas negras).
Nota: Utilice grapas de vaso de alta calidad. clips de alta presión puede dañar los vasos y evitar la regeneración mientras que los clips de baja presión (<30 g) no puede bloquear completamente el flujo sanguíneo. - Bloquear el flujo sanguíneo colateral a través del intestino usando dos clips microvasculares través de los vasos (40 g fuerza), demarcación de la región del intestino isquémico (Figura 1). Se requiere la oclusión de vasos colaterales aimpide el suministro de sangre de los vasos sanguíneos adyacentes (ver la situación de los clips en la figura 1A, D, E, flechas verdes).
- Opcional: Añadir solución de heparina (6 USP unidades / ml), para prevenir la coagulación de la sangre. Gota a gota añadir 0,5 ml de solución de heparina al intestino aislado.
- Húmedos almohadilla no adherente delicados toallitas estériles con solución salina precalentada a 37 ° C y se aplican a la zona quirúrgica. Asegúrese de que las toallitas húmedas se mantiene durante todo el procedimiento.
- Mantener la isquemia durante 60 minutos usando 1-1,5% a lo largo de la anestesia con isoflurano. Si la isquemia procedimiento se realiza correctamente, la región isquémica cambiará a rojo vino de color en aproximadamente 30 minutos. Tenga en cuenta que los vasos sanguíneos distales a la posición del clip se agrandan durante la isquemia (Figura 1, paneles de la derecha) que indica la oclusión exitosa.
- Vigilar de cerca el ratón durante la etapa de la isquemia. Seguir aplicando una solución salina para la almohadilla no adherente que cubre el sitio de la cirugía.
- marcalos bordes de la zona isquémica mediante pipeteo 20 l de Gill`s 3 hematoxilina sobre el tejido para facilitar la cosecha el tejido isquémico y el tejido sano adyacente de la misma para la comparación de ratón (Figura 1E, panel derecho).
4. Etapa de reperfusión
- Al final de la isquemia añadir unas gotas de solución salina en el área de clip y retire suavemente clips microvasculares con aplicador de clips. A continuación, empuje suavemente el intestino de nuevo a la cavidad abdominal con solución salina humedecido puntas de algodón. Retire la almohadilla no adherente y cierre de la pared abdominal y la piel utilizando acero inoxidable grapas para heridas 9 mm. Si la reperfusión se lleva a cabo durante más de 3 horas, utilice una sutura absorbible vicryl para cerrar la pared abdominal antes de la aplicación de grapas de heridas en la piel.
- Mantener los ratones en una jaula limpia calentó durante cantidad deseada de tiempo (30 min, 60 min, 120 min, o 180 min) para la fase de reperfusión.
- Compruebe los animales al menos cada 30 minutos para asegurar la estabilidad.
- La eutanasia a los ratones por CO 2 sobredosis seguido por dislocación cervical en el momento deseado después de la reperfusión.
- Abra cavidad abdominal y recoger el tejido intestinal isquémica para su posterior análisis. Cosecha tejido normal sano adyacente al tejido lesionado como un control interno para dar cuenta de cualquier reacción sistémica a la lesión.
Nota: Este control es más apropiada que la operación simulada ratones de control porque los ratones con operación simulada no se someten a una reacción sistémica a la lesión inducida por IR. - Lave el contenido intestinal mediante jeringa de 30 ml con aguja de sonda unida llena con solución salina y luego se corta el intestino longitudinalmente. Si se requiere una muestra de intestino para el análisis de la expresión génica, cortar un fragmento de 1,5 mm en sentido longitudinal, y el uso de la pieza restante para el análisis histológico.
- Para el análisis histológico, preparar un rollo suizo usando un par de pinzas para hacer rodar la intestine.
- Para mantener la forma enrollada, colocar las piezas de intestino entre almohadillas de espuma de biopsia en cassettes de tejido (Figura 2). Coloque los cassettes en 10% de formalina tamponada.
- Fijar el tejido en formalina durante al menos 24 h. Reemplazar formol con un 70% de etanol durante 24 horas más. tejido de la tienda en 70% de etanol indefinidamente a temperatura ambiente.
- Incrustar en parafina, se cortaron secciones de 5 micras y se tiñen con hematoxilina y eosina utilizando un protocolo estándar (Figura 3).
6. Scoring
- Puntuación de la lesión por isquemia-reperfusión murino tal como se resume en la Tabla 2. Elija un método de puntuación apropiada.
- Opcional: Se divide el campo de visión en cuatro secciones ya que la gravedad de la lesión varía a lo largo de la sección.
- Calcular la nota media de cada sección de las puntuaciones obtenidas a ciegas.
- Comparar el grado del tejido lesionado entre los casos y de control, así como a the ileso tejido utilizando una prueba de Kruskal-Wallis, seguido de la prueba de comparaciones múltiples de un Dunn.
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Representative Results
Hemos optimizado el protocolo experimental de la cirugía de infrarrojos para obtener la lesión inducida reproducible IR del íleon en ratones. Los resultados representativos se manifestaron en esta sección.
La Figura 1 muestra ejemplos de posición clips microvasculares para inducir isquemia del íleon. Las flechas negras indican la posición de los principales clips que ocluyen las ramas de primer orden de la arteria mesentérica superior. Las flechas verdes indican la posición de los clips adicionales para bloquear el suministro de sangre de los vasos colaterales. Nota aumento del tamaño de los vasos ocluidos distales a la posición de clips y el cambio de color de la región isquémica de intestinte. Después de la retirada de los clips en el extremo de los vasos sanguíneos de isquemia recuperar el flujo sanguíneo y volver a su tamaño normal.
La figura 2 muestra un ejemplo de un casete de tejido que contiene brazos de gitano con preparado a partir decontrol y regiones isquémicas del íleon después de 1 h de isquemia, seguido de una 1 h de reperfusión. Un pedazo de bazo se incluyó para facilitar la colocación del control y IR intestino durante el procesamiento y tinción. Tenga en cuenta la diferencia de color entre el control y el tejido isquémico.
La Figura 3 muestra hematoxilina y eosina representante tinción de control y regiones isquémicas del íleon después de 1 h de isquemia, o 1 h de isquemia seguido por un 2 h de reperfusión. Tenga en cuenta el daño severo del epitelio después de 1 hora de isquemia caracterizado por vellosidades hemorrágica, denudement epitelio con parciales para completar la ablación de las criptas, y la infiltración de células inmunes (asterisco). Después de un 2 hr de daño de reperfusión vellosidades y la inflamación persiste (asterisco), pero no hay hemorragia del tejido.
La Figura 4 muestra un ejemplo del análisis de cy inflamatoriacitoci- expresión en 1 hora y 2 horas después de la isquemia-reperfusión en el intestino isquémico y control. Nota la regulación positiva de la expresión de ARNm de TNF, IL-1b, IL-6 y CXCL2 en 1 hr y 2 hr después de la isquemia-reperfusión en comparación con el control de tejido sano.
Figura 1: La inducción de isquemia utilizando clips vasculares (A) Aislada del intestino que contiene ciego e íleon.. Pequeños cortes en el mesenterio que rodea la arteria mesentérica superior se hacen para facilitar la colocación de clips. (B) la aplicación del clip microvascular mediante aplicador de clips. (C) Posición de grapas microvasculares de la arteria mesentérica superior para inducir isquemia. (D, E). Los ejemplos de estructura de la vasculatura y el clip de posicionamiento en diferentes ratones. Las flechas indican la zona isquémica de íleon marcado por hematoxilina. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53881/53881fig1large.jpg" target = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:.. Preparación de tejidos para el análisis histológico de casete de tejido que contiene brazos de gitano preparados a partir de las regiones isquémicas y control del íleon después de 1 hora de isquemia seguido de una 1 hora de reperfusión Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: hematoxilina y eosina de íleon después de la isquemia con hematoxilina y eosina de regiones de control e isquémicas del íleon después de 1 hora de isquemia, o 1 hora de isquemia.seguido de un 2 h de reperfusión. Bares = 500 micras (paneles superiores), 200 micras (paneles inferiores). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Expresión de citoquinas inflamatorias durante la isquemia-reperfusión Expresión de CXCL2, TNF, IL-6, IL-1b se midió en 1 hr y 2 hr después de la isquemia-reperfusión en el tejido isquémico (IR) y el tejido normal de control (C). adyacente a la región isquémica por PCR en tiempo real. n = 3-8 ratones por grupo, * p <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001. Las barras de error representan sem favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| especies murinas | Anestesia / Analgesia | Método de oclusión de la arteria | El tiempo de isquemia | Tiempo después de la reperfusión | Referencia | |||
| ratas Sprague-Dawley | pentobarbital de sodio | La oclusión de la arteria celíaca y SMA utilizando clip de aneurisma o una abrazadera | 45 min | 2 horas | 12 | |||
| C57Bl6 / 129 | 2% de halotano | La oclusión de las arteriolas mesentérica, y las porciones proximal y distal del tejido isquémico. | 30 a 130 min | 6 horas | 13 | |||
| C57BL / 6 | La ketamina, isoflurano | La oclusión de SMA utilizando grapas de aneurisma. La oclusión de circul de garantíaación en los extremos proximal y distal áreas. | 1 hora | 1,5 horas | 4,8,11 | |||
| C3H / Hej | pentobarbital de sodio | La oclusión utilizando clip de aneurisma o una abrazadera | 40 min | 6 horas | 14 | |||
| C56BL / 6 | isoflurano | La oclusión de la arteria ileocólica SMA y con el sujetador en el aneurisma o una abrazadera | 100 min | 1, 2, 4, 24 hr | 15 | |||
| C57BL / 6 | uretano | La oclusión utilizando clip de aneurisma o una abrazadera | 45 min | 60 min | dieciséis | |||
Tabla 1: variaciones en la metodología de lesiones IR inducida murino intestinal
| sistema de "3" de puntuación Histología | Referencia | ||
| Grado 0: mucosa normal | 13,17,18 | ||
| Grado 1: espacio subepitelial en la punta de las vellosidades | |||
| Grado 2: espacio subepitelial más extendida | |||
| Grado 3: elevación epitelial a lo largo de los lados de las vellosidades | |||
| Grado 4: Denudadas vellosidades | |||
| Grado 5: Pérdida de tejido de las vellosidades | |||
| Grado 6: infarto capa Cripta | |||
| Grado 7: infarto Transmucosa | |||
| Grado 8: infarto transmural | |||
| Grado 0: mucosa normal | 4,8,11,19-21 | ||
| Grado 1: Muda de las células en las puntas de las vellosidades | |||
| Grado 3: Villi estaban ausentes, pero todavía criptas eran fácilmente detectables | |||
| Grado 4: La ausencia completa de las estructuras epiteliales y necrosis transmural | |||
| Grado 0: normal vellosidades | 6,22-31 | ||
| Grado 1: Villi con una distorsión punta | |||
| Grado 2: Las células caliciformes y espacios Gugenheims 'faltan | |||
| Grado 3: Villi con una interrupción irregular de las células epiteliales | |||
| Grado 4: Villi con expuesta, pero lámina propia intacta con descamación de células epiteliales | |||
| Grado 5: Lámina propia exuda | |||
| Grado 6: Las vellosidades que la hemorragia de visualización o de vellosidades que se desnudó | |||
| Grado 0: histología normal 32,33 | |||
| Grado 1: Leve alteración del epitelio superficial | |||
| Grado 2: lesión de la pérdida de células epiteliales en la punta de las vellosidades | |||
| Grado 3: vasocongestión de la mucosa, hemorragia y necrosis focal con pérdida de menos de la mitad de las vellosidades | |||
| Grado 4: El daño se extiende a más de la mitad de las vellosidades | |||
Tabla 2: Histología Sistemas de Puntuación en la lesión inducida por IR murino intestinal
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Discussion
El desarrollo de modelos de ratón de IR lesión intestinal han mejorado en gran medida la comprensión de los mecanismos de lesión tisular y ayudado en el desarrollo de estrategias terapéuticas potenciales para minimizar los daños 7,9,11,34. Los pasos críticos de este protocolo son la colocación apropiada de las grapas microvasculares, la coordinación correcta de la evaluación histológica isquemia y adecuada de la lesión IR.
La duración de la isquemia es crítica para daño epitelial posterior. El tiempo típico requerido para inducir la lesión IR reproducible y sin la morbilidad y mortalidad de los ratones experimentales es de 45-60 minutos, seguido de una reperfusión 2-3 hr. Los períodos prolongados de isquemia puede resultar en la pérdida completa del epitelio y aumento de la mortalidad. Por ejemplo, en un modelo porcino de isquemia yeyunal, 60 min de oclusión como resultado la pérdida parcial de epitelio villa, mientras que la oclusión durante 120 minutos dio lugar a la pérdida completa de epitelio de las vellosidades 35. yomportantly, libre de gérmenes y de los ratones genéticamente manipulados pueden mostrar un aumento de la sensibilidad a la lesión IR, y por lo tanto el tiempo óptimo de isquemia y reperfusión puede necesitar ser optimizado en experimentos preliminares. Aunque el tiempo típico para la evaluación de daños en los tejidos después de la reperfusión es de 2-3 horas, el tiempo más largo (12 h) se requiere para el análisis de la movilización de células madre intestinal 36. Además, los cambios en la microbiota comensal y TLR de señalización / Nod mediada pueden influir significativamente en el resultado de la lesión de IR 4,8,37-39.
La posición correcta de los clips microvasculares también es fundamental para la lesión IR reproducible. A continuación se describe el modelo de lesión IR del íleon distal murino. distintas partes del intestino grueso son conocidos por mostrar una sensibilidad diferente a la lesión IR. Por ejemplo, el yeyuno es más sensible a la lesión por IR de íleon y el colon 9,34,40. De hecho, el modelo de isquemia-reperfusión del yeyuno mediante la oclusión de SMA con una solaclip se utiliza comúnmente para estudiar los mecanismos de la lesión IR (ver ref. 9 para una revisión exhaustiva de los diferentes métodos de IR-lesiones en los animales). Sin embargo, la posición precisa de la pinza y el análisis de las diferentes secciones del intestino, así como diferentes métodos de anestesia varía entre estos estudios, por lo que es difícil de reproducir (véase la Tabla 1). Una complicación adicional de la lesión IR del yeyuno es elevada mortalidad ya que la posición de la pinza vascular cerca de la raíz de SMA afecta el suministro de sangre a una amplia zona del intestino. Por lo tanto, en el presente estudio hemos desarrollado un protocolo para inducir la lesión IR consistente de íleon terminal, que es fácil de reproducir. Para inducir la lesión IR reproducible de íleon, la posición correcta de clips vasculares es crítica. Esto se logra mediante la oclusión de las ramas periféricas y colaterales del grado artery.The mesentérica superior de la lesión IR se puede evaluar mediante la evaluación de las secciones de hematoxilina y eosina utilizando originales Chiu / ParK o sistemas de puntuación modificados 11,18,34,41,42. Además, la evaluación de daños en los tejidos se puede realizar utilizando desoxinucleotidil transferasa terminal biotina-dUTP nick fin de etiquetado (TUNEL) tinción de ADN fragmentado, o caspasa-3 tinción inmunohistoquímica activo, el análisis de los neutrófilos mediante la medición de la actividad de mieloperoxidasa o evaluación inmunohistoquímica de neutrófilos utilizando Gr -1, o anticuerpo Ly6G tinción 7,11. Citocinas y quimiocinas inflamatorias, tales como IL-1b, TNF, IL-6, CXCL1, CXCL2, CCL2 pueden ser evaluados por PCR en tiempo real 2,4,8. Un ejemplo del análisis de la expresión de citoquinas inflamatorias se muestra en la Figura 4.
Es importante señalar que a pesar de la alta reproducibilidad y la accesibilidad de la lesión IR del íleon, este modelo puede no reflejar todos los signos clínicos de la enfermedad humana, en condiciones de la enfermedad en particular crónicas y condiciones con la oclusión parcial de la arteria mesentérica superior 9 9,43. Por lo tanto, utilizando modelos animales grandes, como los cerdos se están desarrollando 9,44. La selección cuidadosa del modelo animal en función de la condición humana en estudio es crítica. En resumen, se describe un modelo fácil y robusta de la lesión IR intestinal que puede ser utilizado para estudiar el mecanismo celular y molecular de la lesión epitelial y la regeneración.
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Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Rusa de Ciencias, subvención no. 14-50-00060 y LLC RUSCHEMBIO. Este trabajo también fue apoyado por la Fundación Crohn`s y Colitis de América conceder 294.083 (a AVT), y por el NIH subvención RO1 DK47700 (CJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heated Pad | Sunbeam | E12107-819 | Alternative: Braintree Scientific heated pad |
| Table top research anesthesia Machine | Vasco | UCAP 0001-0000171 | Alternative: Parkland Scientific, V3000PS |
| Nose Cone | Parkland Scientific | ARES500 | |
| Scavenger canister and replacement cartridge | Parkland Scientific | 80000, 80120 | |
| Induction Chamber | Surgivet | V711802 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-10 | Controlled substance, contact IACUC |
| Animal clipper | Oster | Oster Golden A5 078005-050-003 | |
| Ophthalmic ointment | Webster | 8804604 | |
| Buprenorphine | McKesson | 562766 | Controlled substance,contact IACUC |
| Ketaset (Ketamine HCl) | Pfizer | NADA 45-290 | Controlled substance, contact IACUC |
| Cotton tips | Puritan medical products | 806-WC | Autoclave before use |
| Betadine | Purdue Products | 67618-150-17 | 10% Povidone-Iodine |
| Sterile saline solution | Aspen | 46066-807-60 | Adjust to room temperature before use |
| IR rodent thermometer | BIOSEB | BIO-IRB153 | |
| Micro vascular clips, 70 g | Roboz Surgical | RS5424, RS5435 | Alternative: WPI 14121, for SMA occlusion |
| Micro vascular clips, 40 g | Roboz Surgical | RS6472 | Alternative:WPI 14120, for collateral vessels occlusion |
| Clip applying forceps | World Precision Instruments | 14189 | Alternative: Roboz #RS-5410 or #RS-5440 |
| Gill's 3 hematoxylin | Thermo Scientific | 14-390-17 | |
| Surgical staples, Reflex 9 mm | Cell Point Scientific | 201-1000 | |
| Autoclip applier | Beckton Dickinson | 427630 | |
| Byopsy foam pad | Simport | M476-1 | |
| Tissue cassette | Fisher Healthcare | 15182701A | Histosette II combination lid and base |
| 10% buffered formalin | Fisher Scientific | 245-684 | |
| Surgical iris scissors | World Precision Instruments | 501263-G SC | Alternative: Roboz RS6816 |
| Operating scissors | World Precision Instruments | 501219-G | Alternative: Roboz RS6814 |
| Dressing forceps | Roboz Surgical | RS-5228, RS-8122 | Alternative: World Precision Instruments 1519-G |
| Heparin, endotoxin free, 300 USP units/vial, 50 mg | Sigma | 2106 | |
| Reflex wound clip removing forceps | Roboz Surgical | RS-9263 | Alternative: World Precision Instruments: 500347 |
| Mice C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | Stock No 0664 | |
| Telfa non-adherent dressings, 3 x 4, sterile | Coviden | 1050 | |
| Fisherbrand transfer pipets | Fischer Scientific | 13-711-5AM | Use pipets to dropwise add saline |
References
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