Summary
Burada tarlada bu tekniğin standardizasyonu teşvik etmek mortalite olmadan tekrarlanabilir yaralanma ile sonuçlanan farelerde bağırsak iskemi-reperfüzyon ayrıntılı prosedürü açıklar. Bağırsak iskemi-reperfüzyon hasarının Bu model yaralanma ve yenilenme hücresel ve moleküler mekanizmaları incelemek için kullanılabilir.
Abstract
İntestinal iskemi ateroskleroz, tromboz, hipotansiyon, nekrotizan enterokolit, bağırsak transplantasyonu, travma ve kronik inflamasyon gibi klinik durumların geniş bir yelpazesi ile ilişkili yaşamı tehdit eden bir durumdur. Bağırsak iskemi-reperfüzyon (İR) hasarı bağırsak hasarı ile sonuçlanan mezenterik damarları aracılığıyla yetersiz kan akışının neden olduğu akut mezenterik iskemi sonucu, olduğunu. Reperfüzyon aşağıdaki iskemi daha bağırsağın zarar arttırabilir. IR yaralanma mekanizmaları karmaşık ve tam olarak anlaşılamamıştır vardır. Bu nedenle, deneysel küçük hayvan modelleri IR yaralanma patofizyolojisi ve yeni tedavilerin geliştirilmesi anlamak için kritik öneme sahiptir.
Burada ölüm olmadan ince bağırsağın tekrarlanabilir yaralanma sağlayan akut bağırsak IR yaralanma fare modeli açıklanmaktadır. Bu geçici occludin distal ileum bölgesinde uyarılması iskemi ile elde edilirg mikrovasküler klipleri kullanarak 60 dakika superior mezenterik arterin periferik ve terminal teminat dalları. 1 saat ya da histolojik analizi ile incelenmiştir bağırsağın tekrarlanabilir yaralanma yaralanma sonuçları açıklandıktan sonra 2 saat reperfüzyon. mikrovasküler klip uygun pozisyon prosedürü için kritik öneme sahiptir. Bu nedenle video klibi bu tekniğin ayrıntılı bir görsel adım adım açıklamasını sağlar. Bağırsak İR yaralanma Bu model yaralanma ve yenilenme hücresel ve moleküler mekanizmaları incelemek için kullanılabilir.
Introduction
bağırsak iskemisi ve epitel zarar kan akışının kesilmesi için çok hassastır. iskemi sonrası reperfüzyon doku yeniden oksijenlenmesini sağlar ve ayrıca patolojiyi teşvik edebilir. Bu nedenle, intestinal iskemi ve reperfüzyon yaralanması nekrotizan enterokolit, ince bağırsak nakli allograft reddi, abdominal aort anevrizması, kalp akciğer baypas ve iltihaplı bağırsak hastalığı 1,2 komplikasyonları içeren patolojilerin geniş bir yelpazesi ile ilişkilidir. Bağırsak IR hasarı, özellikle akut mezenterik iskemi, morbidite ve mortalite 3 sonuçlanan hayatı tehdit eden bir durumdur.
Az anlaşılmış olmasına rağmen, intestinal iskemi-reperfüzyon (İR) hasarı bağırsak Mikrobiyota değişiklikler gibi reaktif oksijen türleri ve enflamatuar sitokinlerin ve kemokinlerin 1,4-6 üretimi ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Bu, her iki aktivasyonuna yol açarNate ve inflamasyon ve doku hasarı 1,7,8 teşvik adaptif immün mekanizmalar.
Onlar kolay gain- ve zarar fonksiyon-genetik deneyler izin verdiği Hayvan modelleri, IR yaralanma mekanizmaları anlamak için kritik öneme sahiptir. IR çeşitli hayvan modelleri tam damar tıkanıklığına, düşük akımlı iskemi geliştirildi, ve (son kapsamlı inceleme 9 özetlenmiştir) damar tıkanıklığına segmentli edilmiştir. Superior mezenterik arter (SMA) tam damar tıkanıklığı neden olduğu bağırsak iskemi büyük hayvanların ve kemirgenler 9-11 IR kolay ve yaygın olarak kullanılan bir modeldir. Bununla birlikte, bağırsak farklı alanlarda hasar karşı farklı duyarlılığa sahiptir. Buna ek olarak, yaralanma değişken derecelerde iskemik hasar ve kurtarma sonucu süresi farklı anestezik, analjezik, arter tıkanıklığı teknikleri aralığı yanı sıra tutarsızlık birden STUDIE karşısında IR biyoloji anlayışımızı karıştırıcıs. Tablo 1 fare IR çalışmalarda bu tutarsızlıkları ortaya koymaktadır. kısa iskemik kez (30-45 dakika) kullanarak büyük dezavantajı vakalar ve kontroller arasındaki fark farklar görülebilir bunun üzerine kurtarma penceresi hedefliyor. epitele Hafif yaralanma, bu nedenle, reperfüzyon sonrası bir saat çözülmesi patolojik ölçümlerini epitel iadesinde farklılıkları bulmak gerekebilir uzman olabilir. Bunun tersine, aşırı hasar, iskemik yaralanma, 100 dakika tarafından görülen ölüm oranını ve geri kazanım süresi arttıkça, iade artık mümkün değildir epitel, tam soyulma- neden olabilir. Bu nedenle, burada bizim tarlada bu tekniğin standardizasyonu teşvik etmek mortalite olmadan tekrarlanabilir yaralanma ile sonuçlanan farelerde bağırsak IR ayrıntılı prosedürü açıklar. Bağırsak İR yaralanma Bu model yaralanma ve yenilenme hücresel ve moleküler mekanizmaları incelemek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan çalışmaları Sağlık kılavuzların Ulusal Enstitüsü ile uygun olarak yapıldı ve Kurumsal Hayvan Bakım tarafından onaylanmış ve Trudeau Enstitüsü Komitesi kullanın. 8-12 haftalık C57BL / 6 fareleri çalışma için kullanıldı.
Cerrahi 1. Hazırlık
- Hazırlayın ve cerrahi aletler sterilize edin.
- burun konisi ve ısıtmalı pad ile izofluran tabanlı anestezi sistemi hazırlayın. Emin olun ısıtmalı ped ısınmış değil (<39 ºC).
- izofluran gazı tahliye teneke kutu bloke veya herhangi bir şekilde tıkalı olmayan kutunun altındaki egzoz portları sağlamak için doğru pozisyonda olduğundan emin olun. teneke kutu üzerindeki prosedür ve belge ağırlığı öncesinde gazı tahliye bidonunu tartılır. teneke kutu ağırlığı birikmiş ağırlık (~ 12 saat) 50 g aştığında teneke kutu atın.
2. Anestezi
- indüksiyon odasında% 3 izofluran ile fare anestezisi (1 L / dkO 2).
- dik kalması için bir yetersizlik ile anestezi derinliği değerlendirmek maksatlı istemli hareket, göz kırpma refleksinin kaybı, kas gevşeme ve yanıt kaybı kaybı (firma basıncı ile ayak veya kuyruk tutam) stimülasyon refleks.
- göğüs duvarı ve karın hareketlerini gözlemleyerek solunum hızı ve desen değerlendirin. Optimal anestezi altında nefes hızı dakikada ortalama ~ 55-65 nefes olmalıdır.
- indüksiyon odasından fareyi çıkarın ve hızlı bir şekilde fare karın alan tıraş.
- kornea kuruma önlemek için, gözlerde mülayim oftalmik merhem yerleştirin.
- Isıtmalı pad üzerinde fare yerleştirin ve anestezi sistemine burun konisi yoluyla bağlayın. Emin olun lateks burun konisi membran sıkıca fare başının üzerinde oturur ve izofluran hiçbir sızıntı yoktur.
- subkutan ağrı çağlayan rüzgar engellemek için% 1.5 izofluran oranını azaltmak ve buprenorfini (0.1 mg / kg) ve ketamin (10 mg / kg) enjekte edilir.
- th Wipe% 70 etanol ve ardından Betadinede cerrahi çözeltisi ile ıslatılmış steril pamuklu çubuk ile çalışma alanının e cilt.
3. Cerrahi
- işletim makas ile orta çizgi 3-5 cm laparotomi olun. tuzlu su ile nemlendirilmiş steril yapışkan olmayan ped ile kapak operasyonu alanı. çekum ve ileum izole etmek ve tuzlu su içinde nemli bir pamukla kullanarak superior mezenterik arter maruz kalmaktadır.
- Uygulayarak klibi kolaylaştırmak bunu scissors.To ince iris kullanarak superior mezenterik arter çevreleyen mezenterinde küçük nicks yapmak için, hafifçe soyunma forseps ile bağırsak yükseltmek ve (istenilen klip pozisyonunda Şekil superior mezenterik arterin her iki tarafında mezenterin kesti 1A). Ardından, klip uygulamadan önce istenen klip konumunda alanına steril tuzlu su birkaç damla ekleyin.
Not: sham ameliyatı 3.2 adıma cerrahi prosedürü takip etmek. klipleri geçerli değildir. Bunun yerine, katma ılık s tarafından nemli dokusu korumakaline olarak 1 saat süre ile 3.6 tarif edilmiştir. Daha sonra, 4.1 adıma geçin, - Çekum (Şekil 1B) bitişik iskemik ileum 5-7 cm'lik bölge oluşturmak için bir klip uygulayıcı kullanılarak mikrovasküler klipleri (70 g kuvveti) ile superior mezenterik arterin birinci dereceden dalları tıkamak. Gemilerin konumu muhafazakar olmasına rağmen, fareler arasında küçük farklılıklar (Şekil 1 örneklere bakınız) olabilir. Bu nedenle, 2 ya da 3 klip genellikle (Şekil 1A, D, E, siyah oklar klipleri yerini görmek) gereklidir.
Not: Yüksek kaliteli gemi klipleri kullanın. Yüksek basınç klipleri damarlarının zarar ve tamamen kan akışını bloke olmayabilir alçak basınç klipleri (<30 gr) ise rejenerasyon önleyebilir. - Iskemik bağırsak bölgesini (Şekil 1) demarking, gemilerin karşısında iki mikrovasküler klipler kullanarak bağırsağın (40 g kuvveti) ile kollateral kan akışını engeller. kollateral damarların tıkanması için gereklidirBitişik kan damarlarından kan akımını engellemek (Şekil 1A, D, E, yeşil oklar klipleri yerini bakınız).
- İsteğe bağlı: kan pıhtılaşmasını önlemek için heparin çözeltisi (6 USP birim / ml) ekleyin. İzole bağırsağa heparin solüsyonu 0.5 ml ilave ilave edildi.
- tuzlu su ile ıslak steril yapışmayan pedi hassas silme bezleri, 37 ° C'ye kadar önceden ısıtılmış ve cerrahi alanı için de geçerlidir. mendil tüm prosedür sırasında ıslak kalır emin olun.
- boyunca% 1-1.5 izofluran anestezi ile 60 dakika iskemi koruyun. iskemi prosedür doğru yapılırsa, iskemik bölge yaklaşık 30 dakika içinde renk şarap kırmızı değişecektir. Başarılı tıkanıklığı gösteren iskemi (Şekil 1, sağ paneller) sırasında genişlemiş klip konumuna uzak kan damarlarını unutmayın.
- Yakından iskemi safhasında fare izleyin. Ameliyat sitesini kapsayan yapışmayan pad tuzlu su çözeltisi uygulamaya devam.
- işaretdoku üzerinde Gill`s 3 hematoksilen 20 ul pipetleme iskemik alanın kenarları (Şekil 1E, sağ panel) karşılaştırma için aynı fare iskemik doku ve komşu sağlıklı dokulara hasat kolaylaştırmak için.
4. reperfüzyon Sahne
- iskemi sonunda klip alanında serum fizyolojik birkaç damla ekleyin ve hafifçe klip uygulayıcı ile mikrovasküler klipsleri çıkarın. Sonra, yavaşça tuzlu nemlendirilmiş pamuk ipuçlarını kullanarak geri karın boşluğuna bağırsak itin. yapışmayan dolgusunu çıkarın ve 9 mm paslanmaz çelik yara klipleri kullanarak karın duvarı ve cilt kapatın. reperfüzyon, 3 saat daha uzun gerçekleştirilirse, deri üzerinde yara klipleri uygulamadan önce karın duvarı kapatmak için bir emilebilir Vicryl dikiş kullanır.
- reperfüzyon fazı için, istenen süre (30 dakika, 60 dakika, 120 dakika veya 180 dakika) için ısıtıldı temiz bir kafes fareler koruyun.
- her 30 dk istikrarı sağlamak için en az hayvanları kontrol edin.
- CO reperfüzyon sonrası istenilen zamanda servikal dislokasyon tarafından takip 2 doz aşımı fareler Euthanize.
- karın boşluğu açmak ve daha fazla analiz için iskemik bağırsak doku toplanır. yaralanmaya herhangi bir sistemik reaksiyon için hesap için bir iç kontrol olarak yaralı doku bitişik Hasat sağlıklı normal doku.
Not: Bu kontrol sahte ameliyatlı farenin İR kaynaklı yaralanmalara sistemik reaksiyonuna maruz çünkü plasebo kontrol fareleri ameliyat daha uygundur. - uzunlamasına sonra tuzlu su ile doldurulur ve ekli sonda iğne ile bağırsağın 30 ml şırınga kesmek kullanılarak bağırsak içeriği yıkayın. bağırsak örnek gen ekspresyon analizi için gerekli ise, uzunlamasına 1.5 mm'lik bir fragmanını kesilmiş ve histolojik analiz için geri kalan parça kullanımı.
- histolojik analiz için, intest rulo forseps bir çift kullanarak bir İsviçre rulo hazırlamakine.
- Haddelenmiş formunu korumak doku kasetlerde biyopsi köpük pedler (Şekil 2) arasındaki bağırsak parçaları yerleştirin. % 10 tamponlu formalin içine kasetleri yerleştirin.
- En az 24 saat süreyle formalin doku sabitleyin. Ek bir 24 saat boyunca% 70 etanol ile formalin değiştirin. Oda sıcaklığında süresiz% 70 etanol saklayın dokusu.
- Parafin gömün, 5 mikron bölümleri kesmek ve hematoksilen ve eozin standart bir protokol (Şekil 3) kullanılarak leke.
6. Puanlama
- Tablo 2'de özetlendiği gibi. Fare iskemi-reperfüzyon hasarı Puan uygun bir puanlama yöntemini seçin.
- İsteğe bağlı: Yaralanma şiddeti bölümü boyunca değişir beri dört bölüme görüş alanını bölün.
- körü körüne edilen puanlar her bölümün ortalama notu hesaplayın.
- Olguların ve kontrol arasındaki yaralı doku notu karşılaştırmak yanı sıra incie Bir Dunn çoklu karşılaştırmalar testi tarafından izlenen bir Kruskal-Wallis Testi kullanılarak doku yara almadan kurtuldu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz farelerde ileum tekrarlanabilir IR kaynaklı yaralanma elde etmek için IR cerrahi deneysel protokol optimize. Örnek sonuçlar bu bölümde gösterilmiştir.
Şekil 1 ileum iskemi ikna etmek için mikrovasküler klipler pozisyon örneklerini gösterir. Siyah oklar superior mezenterik arterin birinci dereceden dallarını kapatılmasıy ana klip konumunu gösterir. Yeşil oklar kollateral damarlardan kan akışını engellemek için ek kliplerin konumunu gösterir. klipleri pozisyon ve intestinte iskemik bölgenin renk değişikliğine uzak tıkalı damarların boyutunun artması dikkat edin. iskemi kan damarlarının sonunda klip çıkarılmasından sonra kan akışını yeniden ve normal boyutuna geri döner.
Şekil 2, con hazırlanabilir İsviçre rulo ihtiva eden, bir doku kasetinin bir örneğini göstermektedirkumanda ve reperfüzyon bir 1 saat, ardından iskemi 1 saat sonra ileum, iskemik bölgeleri. Dalak bir parça işleme ve boyama sırasında kontrol ve IR bağırsak konumlandırılmasını sağlamak için dahil edilmiştir. Kontrol ve iskemik doku arasındaki renk farkını unutmayın.
Şekil 3 kontrol ve iskemi 1 saat ya da reperfüzyon bir 2 saat ardından iskemi 1 saat sonra ileum iskemik bölgelerin temsili hematoksilen ve eozin boyama gösterir. hemorajik villuslar, kriptalarının ablasyonu tamamlamak için kısmi ile epitel soyulma- yı ve immün hücre infiltrasyonu (yıldız) ile karakterize edilen iskemi 1 saat sonra epitel ciddi hasar unutmayın. reperfüzyon villus hasarı ve inflamasyon 2 saat sonra (yıldız) devam, ama hiçbir doku kanama yoktur.
Şekil 4, enflamatuar cy analizinin bir örneği göstermektedir1 saat ve iskemik ve kontrol bağırsakta işemi-reperfüzyondan sonra 2 saat sonra tokines sentezleme. işemi-reperfüzyon sağlıklı doku kontrol grubuna göre daha sonra 1 saat ve 2 saat sonra, TNF, IL-1 b, IL-6 ve CXCL2 mRNA ekspresyonunun düzenlenişini edin.
Şekil 1: Vasküler Kliplerini kullanarak İskemi uyarılması çekum ve ileum içeren bağırsak (A) İzole bölge.. superior mezenterik arter çevreleyen mezenterinde Küçük kesikler klibi uygulamasını kolaylaştırmak için yapılır. (B) klip uygulayıcı kullanılarak mikrovasküler klip uygulaması. Superior mezenterik arter üzerinde mikrovasküler klip (C) Pozisyon iskemi ikna etmek. (D, E). Farklı farelerde damar yapısı ve küçük konumlandırma örnekler. Oklar Hematoksilen ile işaretlenmiş ileum iskemik alanı belirtir. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53881/53881fig1large.jpg" target = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:.. Histolojik Analiz reperfüzyon bir 1 saat takiben iskemi 1 saat sonra ileum iskemik ve kontrol bölgelerinden hazırlanan İsviçreli rulo içeren Doku kaset için Doku hazırlanması bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Hematoksilen ve İskemi Hematoksilen sonra ileum Eosin Boyama ve ileum kontrolü ve iskemik bölgelerin eozin boyama iskemi 1 saat ya da iskemi 1 saat sonra.reperfüzyon bir 2 saat eklenmiştir. Barlar = 500 mikron (üst paneller), 200 mikron (alt paneller). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4:. İskemi-reperfüzyon CXCL2, TNF, IL-6 salgılamasını, IL-1b, 1 saat ve iskemik doku (IR) iskemi-reperfüzyon sonrasında 2 saat ve normal kontrol dokusu (° C) ölçülmüştür sırasında enflamatuar sitokinlerin sentezlenmesi gerçek zamanlı PCR ile iskemik bölgeye bitişik. n = 3 - grup başına 8 fare, * p <0.05; ** P <0.01; *** P <0.001. Hata çubukları sem temsil bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| murin Türler | Anestezi / analjezi | Arter tıkanıklığı yöntemi | iskemi süresi | Reperfüzyon sonrası Zaman | Referans | |||
| Sprague-Davvley sıçanları | Sodyum pentobarbital | SMA ve çölyak arter Tıkanıklığı anevrizma klibi veya kelepçe kullanarak | 45 dakika | 2 saat | 12 | |||
| C57BL6 / 129 | % 2 halotan | mezenterik arteriyol Tıkanıklığı ve proksimal ve iskemik doku uzak bölümleri. | 30-130 dakika | 6 saat | 13 | |||
| C57BL / 6 | Ketamin, İsofluranın | anevrizma klipleri kullanarak SMA Tıkanıklığı. teminat Circul Tıkanıklığıproksimal ve distal alanlarda tirme. | 1 saat | 1,5 saat | 4,8,11 | |||
| C3H / Hej | Sodyum pentobarbital | anevrizma klibi veya kelepçe kullanarak Tıkanıklığı | 40 dakika | 6 saat | 14 | |||
| C56BL / 6 | izofluran | SMA ve ileokolik arter Tıkanıklığı anevrizma klibi veya kelepçe kullanarak | 100 dakika | 1, 2, 4, 24 saat | 15 | |||
| C57BL / 6 | üretan | anevrizma klibi veya kelepçe kullanarak Tıkanıklığı | 45 dakika | 60 dakika | 16 | |||
Tablo 1: Kemirgen Bağırsak IR kaynaklı Hasarı Metodolojisi Varyasyonları
| Histoloji skorlama sistemi | Referans | ||
| Sınıf 0: Normal mukoza | 13,17,18 | ||
| Sınıf 1: villus ucunda Subepitelyal boşluk | |||
| Grade 2: Daha uzun subepitelyal alan | |||
| 3. Derece: villus kenarları boyunca epitel kaldırma | |||
| 4. Sınıf: denuded villi | |||
| 5. Sınıf: villus doku kaybı | |||
| 6. Sınıf: Crypt katman infarktüsü | |||
| 7. Sınıf: Transmukozal infarktüsü | |||
| 8. Sınıf: Çeper infarktüsü | |||
| Sınıf 0: Normal mukoza | 4,8,11,19-21 | ||
| Sınıf 1: villus ipuçları hücrelerinin dökülmesi | |||
| 3. Derece: Villi yoktu, ama kriptler hala kolayca saptanabilir edildi | |||
| 4. Sınıf: epitel yapılar ve transmural nekroz komple yokluğu | |||
| Sınıf 0: Normal villus | 6,22-31 | ||
| Sınıf 1: Villi ucu bozulma ile | |||
| Grade 2: Goblet hücreleri ve Gugenheims 'boşluk eksik | |||
| 3. Derece: Villi epitel hücrelerinin areas of bozulma ile | |||
| epitel hücre dökülmesi ile ortaya ile Villi, ama sağlam lamina propria: Sınıf 4 | |||
| 5. Sınıf: Lamine propria exuding olduğunu | |||
| 6. Sınıf: Villi denuded olan villus bu ekran kanama veya | |||
| Sınıf 0: Normal histoloji 32,33 | |||
| Sınıf 1: Yüzey epitel hafif bozulma | |||
| Grade 2: villus ucunda Epitel hücre kaybı yaralanma | |||
| 3. Derece: Mukozal damarsal, kanama ve villus yarısından az kaybı ile fokal nekroz | |||
| Sınıf 4: Hasar villi fazla yarısına kadar uzanan | |||
Tablo 2: Fare Bağırsak IR kaynaklı Hasarı Histoloji Skorlama Sistemleri
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bağırsak IR yaralanma fare modellerinin geliştirilmesi büyük ölçüde doku hasarının mekanizmaları iyi anlaşılmasını sağlamıştır ve doku hasarı 7,9,11,34 en aza indirmek için potansiyel terapötik stratejilerin geliştirilmesine yardımcı oldu. Bu protokolün kritik adımlar mikrovasküler klip doğru konumlandırma, IR yaralanma iskemi ve uygun histolojik değerlendirme doğru zamanlama vardır.
iskemi süresi daha sonraki epitel hasar için kritik öneme sahiptir. morbidite ve deneysel farelerin ölüm olmadan tekrarlanabilir IR hasara yol için gerekli tipik zaman 2-3 saat reperfüzyon ardından 45-60 dk. iskemi süreleri uzatıldı olabilir epiteli ve artmış mortalite tam kaybı ile sonuçlanır. 120 dakika oklüzyon villus epitel 35 tam kaybına yol ise Örneğin, jejunum iskemi bir domuz modelinde, 60 dakika oklüzyon, Villa epitel kısmi kaybı ile sonuçlandı. benmportantly, mikropsuz ve genetik manipüle fareler ön deneylerde optimize edilmesi gerekebilir IR yaralanma ve iskemi ve reperfüzyon nedenle optimum zaman artan bir hassasiyet gösterebilir. Reperfüzyon sonrası doku hasarının değerlendirilmesi için tipik zaman 2-3 saat, daha uzun bir zaman (12 saat), ancak bağırsak kök hücre mobilizasyonu 36 analizi için gereklidir. Ayrıca, ortakçı Mikrobiyota ve TLR / Nod-aracılı sinyalizasyon değişiklikler önemli ölçüde IR yaralanma 4,8,37-39 arasında sonucunu etkileyebilir.
mikrovasküler klip uygun konumu da tekrarlanabilir IR hasarı için kritik öneme sahiptir. Burada fare uzak ileum IR yaralanma modelini açıklar. bağırsak ayrı parçalar IR yaralanma farklı duyarlılığı göstermek için bilinmektedir. Örneğin, jejunum ileum ve kolon 9,34,40 daha IR hasarında karşı daha duyarlıdır. Aslında, jejunum iskemi-reperfüzyon modeli tek bir tıklama ile SMA tıkayarakklip yaygın IR yaralanma mekanizmaları incelemek için kullanılır (ref bakın. 9 hayvanlarda IR-yaralanma farklı yöntemler kapsamlı bir inceleme için). Bununla birlikte, klibin tam konumu ve bağırsak farklı bölümlerinin analizi, hem de anestezi farklı yöntem zor (Tablo 1 e bakınız) üretmek için yapım Bu çalışmalar arasında değişir. SMA köküne yakın damar klibin pozisyon bağırsağın geniş bölgeye gelen kan akımı etkiler çünkü jejunum IR yaralanma ek bir komplikasyon yüksek mortalite olduğunu. Bu nedenle, mevcut çalışmada biz çoğaltmak kolay terminal ileum, tutarlı IR hasara yol için bir protokol geliştirmiştir. ileum tekrarlanabilir IR hasara yol için, damar klip doğru pozisyonu önemlidir. Bu IR yaralanma superior mezenterik artery.The derece periferik ve teminat dalları kapatılmasıy elde edilir özgün Chiu / Par kullanarak hematoksilen ve eozin bölümlerinin değerlendirilmesi ile tespit edilebilirk veya değiştirilmiş skor sistemleri 11,18,34,41,42. Buna ek olarak, doku hasarının değerlendirilmesi miyeloperoksidaz aktivitesini veya Gr kullanarak nötrofil immünohistokimyasal değerlendirme ölçümü ile parçalanmış DNA, ya da aktif kaspaz-3 immünohistokimyasal boyama, nötrofillerin analizi terminal deoksinükleotidil transferaz biyotin-dUTP çentik uç etiketleme (TÜNEL) lekeleme kullanılarak yapılabilir -1 veya Ly6G antikoru 7,11 boyama. IL-1B gibi enflamatuar sitokinler ve kemokinler, TNFa, IL-6, CXCL1, CXCL2, CCL2, gerçek zamanlı PCR ile 2,4,8 değerlendirilebilir. Enflamatuar sitokin ekspresyon analizinin bir örneği Şekil 4'te gösterilmektedir.
Yüksek tekrarlanabilirlik ve ileum IR yaralanma erişilebilirlik rağmen, bu model özellikle kronik hastalık durumlarında ve superior mezenterik arterin 9 kısmi tıkanıklığı ile koşullarında, insan hastalığın tüm klinik bulguları yansıtmıyor olabilir dikkat etmek önemlidir 9,43 sırasında reaktif oksijen türlerinin üretimi aracılık kilit enzimin seviyesi vardır. Bu nedenle, domuz gibi büyük hayvanlar, kullanılarak modeller 9,44 geliştirilmektedir. çalışılan insan durumuna bağlı olarak hayvan modelinin dikkatli seçimi önemlidir. Özet olarak, epitel yaralanması ve yenilenme hücresel ve moleküler mekanizma üzerinde çalışmak üzere kullanılabilir bağırsak İR yaralanma kolay ve sağlam bir modeli açıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Rus Bilim Vakfı tarafından desteklenen bu çalışma, hayır verin. 14-50-00060 ve LLC RUSCHEMBIO. Bu çalışma aynı zamanda (CJ için) 294.083 (AVT için), ve NIH hibe RO1 DK47700 tarafından hibe Amerika Crohn`s ve Kolit Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heated Pad | Sunbeam | E12107-819 | Alternative: Braintree Scientific heated pad |
| Table top research anesthesia Machine | Vasco | UCAP 0001-0000171 | Alternative: Parkland Scientific, V3000PS |
| Nose Cone | Parkland Scientific | ARES500 | |
| Scavenger canister and replacement cartridge | Parkland Scientific | 80000, 80120 | |
| Induction Chamber | Surgivet | V711802 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-10 | Controlled substance, contact IACUC |
| Animal clipper | Oster | Oster Golden A5 078005-050-003 | |
| Ophthalmic ointment | Webster | 8804604 | |
| Buprenorphine | McKesson | 562766 | Controlled substance,contact IACUC |
| Ketaset (Ketamine HCl) | Pfizer | NADA 45-290 | Controlled substance, contact IACUC |
| Cotton tips | Puritan medical products | 806-WC | Autoclave before use |
| Betadine | Purdue Products | 67618-150-17 | 10% Povidone-Iodine |
| Sterile saline solution | Aspen | 46066-807-60 | Adjust to room temperature before use |
| IR rodent thermometer | BIOSEB | BIO-IRB153 | |
| Micro vascular clips, 70 g | Roboz Surgical | RS5424, RS5435 | Alternative: WPI 14121, for SMA occlusion |
| Micro vascular clips, 40 g | Roboz Surgical | RS6472 | Alternative:WPI 14120, for collateral vessels occlusion |
| Clip applying forceps | World Precision Instruments | 14189 | Alternative: Roboz #RS-5410 or #RS-5440 |
| Gill's 3 hematoxylin | Thermo Scientific | 14-390-17 | |
| Surgical staples, Reflex 9 mm | Cell Point Scientific | 201-1000 | |
| Autoclip applier | Beckton Dickinson | 427630 | |
| Byopsy foam pad | Simport | M476-1 | |
| Tissue cassette | Fisher Healthcare | 15182701A | Histosette II combination lid and base |
| 10% buffered formalin | Fisher Scientific | 245-684 | |
| Surgical iris scissors | World Precision Instruments | 501263-G SC | Alternative: Roboz RS6816 |
| Operating scissors | World Precision Instruments | 501219-G | Alternative: Roboz RS6814 |
| Dressing forceps | Roboz Surgical | RS-5228, RS-8122 | Alternative: World Precision Instruments 1519-G |
| Heparin, endotoxin free, 300 USP units/vial, 50 mg | Sigma | 2106 | |
| Reflex wound clip removing forceps | Roboz Surgical | RS-9263 | Alternative: World Precision Instruments: 500347 |
| Mice C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | Stock No 0664 | |
| Telfa non-adherent dressings, 3 x 4, sterile | Coviden | 1050 | |
| Fisherbrand transfer pipets | Fischer Scientific | 13-711-5AM | Use pipets to dropwise add saline |
References
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nat Med. 17, 1391-1401 (2011).
- Lenaerts, K., et al. New insights in intestinal ischemia-reperfusion injury: implications for intestinal transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 18, 298-303 (2013).
- Yasuhara, H. Acute mesenteric ischemia: the challenge of gastroenterology. Surg Today. 35, 185-195 (2005).
- Perez-Chanona, E., Muhlbauer, M., Jobin, C. The microbiota protects against ischemia/reperfusion-induced intestinal injury through nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 2 (NOD2) signaling. Am J Pathol. 184, 2965-2975 (2014).
- Lee, H., et al. Delineating the relationships among the formation of reactive oxygen species, cell membrane instability and innate autoimmunity in intestinal reperfusion injury. Mol Immunol. 58, 151-159 (2014).
- Yoshiya, K., et al. Depletion of gut commensal bacteria attenuates intestinal ischemia/reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 301, G1020-G1030 (2011).
- Wu, M. C., et al. The receptor for complement component C3a mediates protection from intestinal ischemia-reperfusion injuries by inhibiting neutrophil mobilization. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 9439-9444 (2013).
- Muhlbauer, M., Perez-Chanona, E., Jobin, C. Epithelial cell-specific MyD88 signaling mediates ischemia/reperfusion-induced intestinal injury independent of microbial status. Inflamm Bowel Dis. 19, 2857-2866 (2013).
- Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: progress and promise for translational research. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308, G63-G75 (2015).
- Megison, S. M., Horton, J. W., Chao, H., Walker, P. B. A new model for intestinal ischemia in the rat. J Surg Res. 49, 168-173 (1990).
- Goldsmith, J. R., et al. Intestinal epithelial cell-derived mu-opioid signaling protects against ischemia reperfusion injury through PI3K signaling. Am J Pathol. 182, 776-785 (2013).
- Cuzzocrea, S., et al. Glycogen synthase kinase-3beta inhibition attenuates the development of ischaemia/reperfusion injury of the gut. Intensive Care Med. 33, 880-893 (2007).
- Farber, A., et al. A specific inhibitor of apoptosis decreases tissue injury after intestinal ischemia-reperfusion in mice. J Vasc Surg. 30, 752-760 (1999).
- Ben, D. F., et al. TLR4 mediates lung injury and inflammation in intestinal ischemia-reperfusion. J Surg Res. 174, 326-333 (2012).
- Watson, M. J., et al. Intestinal ischemia/reperfusion injury triggers activation of innate toll-like receptor 4 and adaptive chemokine programs. Transplant Proc. 40, 3339-3341 (2008).
- Watanabe, T., et al. Activation of the MyD88 signaling pathway inhibits ischemia-reperfusion injury in the small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303, G324-G334 (2012).
- Murayama, T., et al. JNK (c-Jun NH2 terminal kinase) and p38 during ischemia reperfusion injury in the small intestine. Transplantation. 81, 1325-1330 (2006).
- Park, P. O., Haglund, U., Bulkley, G. B., Falt, K. The sequence of development of intestinal tissue injury after strangulation ischemia and reperfusion. Surgery. 107, 574-580 (1990).
- Jilling, T., Lu, J., Jackson, M., Caplan, M. S. Intestinal epithelial apoptosis initiates gross bowel necrosis in an experimental rat model of neonatal necrotizing enterocolitis. Pediatr Res. 55, 622-629 (2004).
- Aprahamian, C. J., Lorenz, R. G., Harmon, C. M., Dimmit, R. A. Toll-like receptor 2 is protective of ischemia-reperfusion-mediated small-bowel injury in a murine model. Pediatr Crit Care Med. 9, 105-109 (2008).
- Tatum, P. M., Harmon, C. M., Lorenz, R. G., Dimmitt, R. A. Toll-like receptor 4 is protective against neonatal murine ischemia-reperfusion intestinal injury. J Pediatr Surg. 45, 1246-1255 (2010).
- Fleming, S. D., et al. Anti-phospholipid antibodies restore mesenteric ischemia/reperfusion-induced injury in complement receptor 2/complement receptor 1-deficient mice. J. Immunol. 173, 7055-7061 (2004).
- Fleming, S. D., et al. Mice deficient in complement receptors 1 and 2 lack a tissue injury-inducing subset of the natural antibody repertoire. J. Immunol. 169, 2126-2133 (2002).
- Lapchak, P. H., et al. Platelets orchestrate remote tissue damage after mesenteric ischemia-reperfusion. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, G888-G897 (2012).
- Rehrig, S., et al. Complement inhibitor, complement receptor 1-related gene/protein y-Ig attenuates intestinal damage after the onset of mesenteric ischemia/reperfusion injury in mice. J. Immunol. 167, 5921-5927 (2001).
- Hoffman, S. M., Wang, H., Pope, M. R., Fleming, S. D. Helicobacter infection alters MyD88 and Trif signalling in response to intestinal ischaemia-reperfusion. Exp Physiol. 96, 104-113 (2011).
- Moses, T., Wagner, L., Fleming, S. D. TLR4-mediated Cox-2 expression increases intestinal ischemia/reperfusion-induced damage. J Leukoc Biol. 86, 971-980 (2009).
- Feinman, R., et al. HIF-1 mediates pathogenic inflammatory responses to intestinal ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 299, G833-G843 (2010).
- Lapchak, P. H., et al. The role of platelet factor 4 in local and remote tissue damage in a mouse model of mesenteric ischemia/reperfusion injury. PloS one. 7, e39934 (2012).
- Wen, S. H., et al. Ischemic postconditioning during reperfusion attenuates intestinal injury and mucosal cell apoptosis by inhibiting JAK/STAT signaling activation. Shock. 38, 411-419 (2012).
- Wang, F., et al. Temporal variations of the ileal microbiota in intestinal ischemia and reperfusion. Shock. 39, 96-103 (2013).
- Zou, L., Attuwaybi, B., Kone, B. C. Effects of NF-kappa B inhibition on mesenteric ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 284, G713-G721 (2003).
- Hassoun, H. T., et al. Alpha-melanocyte-stimulating hormone protects against mesenteric ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 282, G1059-G1068 (2002).
- Stallion, A., et al. Ischemia/reperfusion: a clinically relevant model of intestinal injury yielding systemic inflammation. J Pediatr Surg. 40, 470-477 (2005).
- Blikslager, A. T., Roberts, M. C., Rhoads, J. M., Argenzio, R. A. Is reperfusion injury an important cause of mucosal damage after porcine intestinal ischemia? Surgery. 121, 526-534 (1997).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
- Victoni, T., et al. Local and remote tissue injury upon intestinal ischemia and reperfusion depends on the TLR/MyD88 signaling pathway. Med Microbiol Immunol. 199, 35-42 (2010).
- Watanabe, T., et al. Toll-like receptor 2 mediates ischemia-reperfusion injury of the small intestine in adult mice. PloS one. 9, e110441 (2014).
- Pope, M. R., Fleming, S. D. TLR2 modulates antibodies required for intestinal ischemia/reperfusion-induced damage and inflammation. J. Immunol. 194, 1190-1198 (2015).
- Leung, F. W., Su, K. C., Passaro, E. Jr, Guth, P. H. Regional differences in gut blood flow and mucosal damage in response to ischemia and reperfusion. Am J Physiol. 263, G301-G305 (1992).
- Chiu, C. J., McArdle, A. H., Brown, R., Scott, H. J., Gurd, F. N. Intestinal mucosal lesion in low-flow states. I. A morphological, hemodynamic, and metabolic reappraisal. Arch Surg. 101, 478-483 (1970).
- Quaedackers, J. S., et al. An evaluation of methods for grading histologic injury following ischemia/reperfusion of the small bowel. Transplant Proc. 32, 1307-1310 (2000).
- Bianciardi, P., Scorza, R., Ghilardi, G., Samaja, M. Xanthine oxido-reductase activity in ischemic human and rat intestine. Free Radic Res. 38, 919-925 (2004).
- Yandza, T., et al. The pig as a preclinical model for intestinal ischemia-reperfusion and transplantation studies. J Surg Res. 178, 807-819 (2012).
