Tilstedeværelsen av kreft stamceller (cscs) i bensarkomer har nylig blitt knyttet til deres patogenese. I denne artikkelen presenterer vi isoleringen av cscs fra primære cellekulturer ble oppnådd fra humane biopsier av konvensjonell osteosarkom (OS) ved hjelp av evnen til cscs til å vokse under adherente betingelser.
De nåværende forbedringer i terapi mot osteosarkom (OS) har forlenget livet til kreftpasienter, men overlevelsen av fem år er fortsatt dårlig når metastase har oppstått. Kreft Stem Cell (CSC) teori er at det er en undergruppe av tumorceller i svulsten som har stammeliknende egenskaper, herunder evnen til å opprettholde svulsten, og til å motstå multimedikament kjemoterapi. Derfor er en bedre forståelse av OS-biologi og patogenese nødvendig for å fremme utviklingen av målrettede terapier for å utrydde denne bestemte delsettet, og for å redusere sykelighet og dødelighet blant pasientene. Isolere cscs, etablere cellekulturer fra cscs, og studere deres biologi er viktige skritt for å forbedre vår forståelse av OS biologi og patogenesen. Etableringen av human-avledet OS-cscs fra biopsier av OS har blitt gjort mulig ved hjelp av flere metoder, blant annet evnen til å lage 3-dimensjonale stamcellekulturer henhold nonadherent forhold. Under disse betingelser, cscs er i stand til å skape sfæriske flytende kolonier dannet av datter stamceller; disse koloniene betegnes som "cellular kuler". Her beskriver vi en metode for å etablere CSC kulturer fra primære cellekulturer av konvensjonell OS hentet fra OS biopsier. Vi beskriver tydelig flere passasjer som kreves for å isolere og karakterisere cscs.
Sarkomer er en heterogen gruppe av sjeldne ondartede binde svulster vev stammer hovedsakelig fra embryonale mesoderm en. De ulike typene inkluderer bensarkomer og sarkomer bløtvev. Bensarkomer, en gruppe av relativt uvanlig primære tumorer, bestå av flere undertyper, inkludert osteosarkom (OS). OS, en av de mest vanlige primære tumorer i ben, er en mesenchymale malignitet som oppviser omfattende kliniske, histologiske, og molekylære heterogeniteter 2, 3. Dessverre forekommer OS hovedsakelig hos barn og hos unge voksne, 4, 5 og utgjør 60% av de vanligste histologiske subtyper av bensarkom i barndommen 6, 7. OS vanligvis påvirker skjelett områder, som er preget av raske bein vekst (f.eks metafysært av lange bein). Blant de histologisk ulike subtyper av OS, konvensjonell OS, også kalt medullær eller sentral OS, har en høy grad av malignitet og en kvote share 80% 8. Denne 80% består av 60% konvensjonell osteoblastisk OS, 10% chondroblastic OS, og 10% fibroblastisk OS 6, 8-10. Andre OS subtyper inkluderer anaplastic, telangiectatic, gigantiske celle-rik og småcellet OS. Til tross for fremskritt i kombinert kirurgi og kjemoterapi i OS ledelse, forblir utfallet dårlig, med en langsiktig overlevelse på 65-70% hos pasienter uten metastaser 11, 12. Distant tilbakefall ofte oppstå som lungemetastaser eller, sjeldnere, som metastaser å fjerne bein og lokale residiv 13. Metastaser er ofte resistente mot konvensjonelle behandlinger. Denne motstanden er grunnen til at 10-års sykdomsfri overlevelse er ca 30% hos pasienter med metastatisk sykdom ved diagnose 14, 15.
Som med normalt vev, er kreft vev består av en heterogen samling av celletyper. Celler i tumoren synes å tilsvare forskjellige stadier av utviklingen. Innen noen normal vev ligger en subpopulasjon av celler med evnen til å selfrenew, og dermed gi forløpere og modne celler for vev homeostase. Tilsvarende er kreft sammensatt av en tilsvarende heterogen populasjon av celler på ulike stadier av utvikling, med forskjellig grad av spredning og karsinogent potensial. En undergruppe av disse kreftceller, betegnet Cancer stamceller (cscs), utgjør et reservoar av selfsustaining celler med den eksklusive evne til å selfrenew og opprettholde den maligne potensial av svulster, og dermed generere de forskjellige celle-linjene som utgjør tumoren bulk 16. På 1990-tallet, studier av akutt myelogen leukemi gitt den første overbevisende bevis for eksistensen av CSC subpopulasjoner 17, 18. Cscs har siden blitt isolert fra et stort antall faste tumorer 19, og ble dermed en av de mest forsket temaer i kreftforskning. Cscs kan faktisk oppstå fra normale stamceller ved mutasjoner i gener som gjør den normalestamceller kreft 20-23. Flere transformere mutasjoner og interaksjoner med mikromiljøet vil også kunne bidra til friske stamceller og modne celler anskaffe selfrenewal kapasitet og udødelighet som kjennetegne cscs. Det finnes flere hypoteser om denne transformasjonen. Sunn stamfedre, sunne modne celler og kreftceller, kan dedifferentiate til stamceller, få en stilk-lignende fenotype ved å aktivere selfrenewal assosierte gener 24-28. Til tross for flere nyere studier, opprinnelsen til cscs har ennå å bli oppdaget.
Et særlig kjennetegn ved cscs er at deres evne til å motstå den multi-terapi tilnærming, som består av kombinert kirurgi og kjemoterapi med forskjellige medikamenter. Nyere studier har vist at cscs kan også erverve resistens mot cytostatika agenter. Mulige forklaringer på denne motstand er overekspresjon av ATP-bindende kassett (ABC) multidrug transportør (dvs.MDR1 og BCRP1), overekspresjon av kjemoterapi metaboliserende enzymer så som aldehyd dehydrogenase 1 (ALDH1), og / eller endringer i cellesykluskinetikk 30-33. Den direkte følge av alle disse konsepter som er beskrevet så langt er at en kreftterapi vil være effektiv bare hvis CSC subpopulasjonen var fullstendig eliminert, mens lokalt tilbakefall eller fjernmetastaser kan inntreffe hvis en eneste CSC overlevde.
Oppdagelsen av cscs i menneskelig sarkomer 34, spesielt OS 35, eller i andre bein og bløtvev kreft, har stor klinisk betydning fordi det gir en mulig forklaring på hvorfor mange behandlinger ser ut til å være effektive i første omgang, men pasientene senere tilbakefall. Derfor er håp for fremtiden kampen mot konvensjonell OS er å finne nye og konkrete målrettede terapier basert på utvikling av innovative legemidler rettet mot OS-cscs takket være den molekylære karakterisering av denne underbefolkning og til studiet av CSC biologi.
I 1992 Reynolds og kolleger, som var å undersøke hvorvidt en undergruppe av stamceller var til stede i den voksne hjernen hos pattedyr, utviklet en metode for å isolere celler som mistenkes for å være stilk-lignende celler 36, 37. Denne metoden er basert på den spesielle evne disse cellene til å danne kuleformede kolonier når dyrket under adherente betingelser. Lignende teknikker ble ansatt av Gibbs og kollegene i 2005 for å studere en undergruppe av stilk-lignende celler i bein sarkomer 38. For å isolere og karakterisere OS-cscs fra primære cellekulturer fra ulike typer konvensjonelle OS, bestemte vi oss for å tilpasse denne teknikken for OS cellelinjer.
Her beskriver vi at dette er tilpasset metoden av kulen dannelsesbestemmelsen, kalt "sarcosphere assay", som kan brukes til å isolere OS-cscs fra endelige primære cellelinjer avledet fra humane biopsier av konvensjonell OS. Vi beskriver også alle teknikker used å validere stammeliknende CSC fenotype av cellelinjene isolert ved denne analysen: 1) evaluering av ekspresjonen av gener som er karakteristiske pluripotente embryonale stamceller (ESCS) og av CD133-genet, som er en markør for cscs; 2) kolonidannende enhet (CFU) analyse; 3) evaluering av evnen til disse cellene til å differensiere til osteoblaster og adipocytter under passende differensierings betingelser; 4) studie av overflatemarkører av mesenchymale stamceller (MSC) (dvs. CD44, CD105 og Stro-1) ved immunfluorescens farging og ved flowcytometrisk analyse; 5) evaluering av ALDH-aktivitet av disse cellene.
Cscs har flere egenskaper som tillater identifikasjon av denne spesielle cellulære undersett i tumoren bulk. På bakgrunn av disse egenskapene, slik som ervervet resistens overfor cytotoksiske kjemoterapeutiske midler for overekspresjon av ATP-bindende kassett multilegemiddel efflux transportører 28, 32, 33, eller for oppregulering av ekspresjonen av avgiftning enzymer så som ALDH 32, for ekspresjon av en spesiell overflatemarkør, slik som CD133, CD44, CD34, CD90, og andre 30, 34, 35, 41, flere ulike metoder for å isolere cscs er blitt utviklet 42-44. En av disse teknikker er den sfære-analysen, som er basert på kapasiteten til cscs til å vokse under ikke-adherente betingelser.
Evnen av vev stamceller og cscs for dannelse av sfærer ble først beskrevet i studier på identifisering av nevrale stamceller av Reynolds et al., 37. Deretter Gibbs et al. 38 ossed disse studiene til å begynne å isolere cscs fra solide tumorer, spesielt fra bensarkomer. Vi har besluttet å bruke kula dannelsen analysemetoden illustrert av Gibbs et al. Å isolere cscs fra OSA cellelinjer hentet fra konvensjonelle OS biopsier. Vi tilpasset den opprinnelige metoden for å forbedre resultatene fra denne analysen og for å lette dens reproduserbarhet for andre cancercellelinjer. Med henvisning til etablering av kulen formasjonen assay bekreftet vi at plette 40.000 celler / brønn er en god praksis for å opprettholde celler i isolasjon ved begynnelsen av analysen. Det lure er meget viktig for å unngå muligheten for at de kuleformede kolonier stammer fra cellulær aggregering og ikke fra den spesielle og eksklusive kapasiteten til en enkelt CSC til å vokse under ikke-adherente betingelser og danner en sfærisk koloni. Denne evnen er et spesielt kritisk punkt i denne analysen.
Vi har også sertifisert at for å oppnå en god hastighet på kula formasjonEr det tilstrekkelig å oppdatere alikvoter av vekstfaktorer hver 3 d og ikke hver dag, som beskrevet i den opprinnelige metoden. I denne studien vi også etablert og omfattende beskrevet en god metode for å isolere de kuleformede kolonier som dannes når dyrket under ikke-adherente betingelser. Dette trinnet er kritisk i denne undersøkelse fordi det er meget viktig å forsøke å isolere så mange av de kuler som mulig som er dannet i hver brønn uten å skade dem. Det er også viktig å isolere bare kulene og ikke de enkelte celler, som kan forbli i suspensjon i løpet av analysen. For å overvinne disse kritiske punkter, har vi utviklet en spesiell isolasjonsmetoden, som, som vist ovenfor, ga gode resultater for CSC isolasjon. Selvfølgelig, er det mulighet for at ikke alle kulene som dannes kan utvinnes, men tapsprosenten er meget lav. Faktisk har vi også muligheten til å bruke et filter med 40 mikrometer porer å isolere kuler etter at de blir store (skjemaed ca 100-200 celler).
Denne isolasjonen stopper sfære formasjon, men gjør det mulig for enkeltceller, en del av methylcellulose residuet, og de minste kulene som skal filtreres. Denne eliminering utføres ved grundig filtrering som beskrevet i protokollen.
Dessuten er valget av de største sfæriske koloniene gjennom 40 pm sikt med derav følgende tap av de minste koloniene sfæriske gjør det mulig å velge de cscs med den høyeste evne til å danne kuleformede kolonier og med større stemness. Alle disse modifikasjoner ble utført for å forbedre analysen og for å hjelpe forskere studert cscs å forstå og reprodusere de mest kritiske trinn av den opprinnelige metoden av kulen formasjonen analysen.
Blant studier om in vitro-metoder for å isolere cscs, denne studien forsøkte å vise hvordan dette tilpasses sfære-analysen kan være en god metode for å isolere cscs fraOSA-cellelinjer. Tilpasningene til den opprinnelige metoden og den detaljerte isolasjon teknikk som er beskrevet forbedre dens effektivitet. I løpet av kort tid, kan godt antall cscs oppnås og brukes for flere forsøk. Derfor er det mulig å raskt få bekreftet stammen lignende fenotyper og, spesielt, for å studere den doble stilk-lignende fenotype som karakteriserer OS-cscs. Således kunne denne modifiserte analysen være en god teknikk for å isolere cscs og studere deres biologi. I fremtiden denne metoden, med ytterligere tilpasninger, kan også brukes til å isolere cscs fra andre begrensede kreftcellelinjer oppnådd ved biopsi av sjeldne solide tumorer.
Muligheten for å isolere cscs fra sjeldne faste tumorer, for eksempel OS, ikke bare tillater forbedring av studier om dette spesielt kreft, men også strekker seg til studier av ulike typer av kreft for å utvikle bedre fremgangsmåter for deres isolering og til fremtidige studier av biologien denne viktige cellulære undergruppe. Derfor, som vihar gjort i denne studien, er det viktig å forbedre metodene for CSC isolasjon gjennom studiet av CSC biologi, med det endelige mål å finne molekylære mål og å utvikle en meget spesifikk anticancerterapi rettet mot denne cellular undergruppe, som sannsynligvis er ansvarlig for opprettholdelse av primærtumor, utvikling av gjentagelse, og opprinnelsen av metastaser i flere organer. Studiet av CSC biologi er også viktig for å finne behandlingsformer som kan være skarpt i helbredelse av kreft, for eksempel OS, som overlevelse etter neoadjuvant behandling er fortsatt svært dårlig.
The authors have nothing to disclose.
This study was supported by ITT (Istituto Toscano Tumori) Grant Proposal 2010.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline with Ca and Mg (DPBS) | LONZA | BE17-513F | _ |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline without Ca and Mg (DPBS) | LONZA | BE17-512F | _ |
Porcine Trypsin 1:250 | BD Difco | 215310 | Solvent: DPBS. Stock concentration: Powder |
Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate(EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | Solvent: DPBS. Stock concentration: Powder |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130 | Solvent: Buffer Solution pH 7.4. Stock concentration: Powder |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | BDH Chemicals-VWR | 10323 | _ |
Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma-Aldrich | F6636 | Solvent: Ultrapure dH2O. Stock concentration: Powder |
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma-Aldrich | 49752 | Solvent: DPBS. Stock concentration: 5 mg/ml |
β-Glycerol phosphate disodium salt pentahydrate | Sigma-Aldrich | 50020 | Solvent: DPBS. Stock concentration: 1M |
Insulin. Human Recombinant | Sigma-Aldrich | 91077 | Solvent: NaOH 0.1M. Stock concentration: 10 mM |
3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | Solvent: DMSO. Stock concentration: 500 mM |
Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | Solvent: DMSO. Stock concentration: 200 mM |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | Solvent: DMSO. Stock concentration: 1 mM / 100 µM. Stock in nitrogen liquid to maintain the biological activity |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | _ |
Fetal Bovine Serum South America | EUROCLONE | ECS0180L | _ |
Penicillin-Streptomycin (PEN-STREP) 10,000 U/ml | LONZA | DE17-602E | _ |
Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | 274429 | Solvent: Ultrapure dH2O. Stock concentration: 2% |
Putresceine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P5780 | Solvent: Ultrapure dH2O. Stock concentration: Powder |
apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T-1147 | Solvent: DPBS. Stock concentration: 25 mg/ml |
Human Epidermal Growth Factor (EFGF) | Sigma-Aldrich | E5036 | Solvent: DPBS pH 7.4. Stock concentration: 10 µg/ml |
Fibroblast Growth Factor-Basic Human | Sigma-Aldrich | F0291 | Solvent: DPBS +0.2% BSA. Stock concentration: 25 µg/ml |
Selenous Acid | Sigma-Aldrich | 211176 | Solvent: DPBS. Stock concentration: 30 mM |
Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | Solvent: ETOH. Stock concentration: 10 mM |
Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | 198161 | Solvent: Ultrapure dH2O. Stock concentration: Powder |
Oil Red O | ICN Biochemicals | 155984 | Solvent: 2-Propanol. Stock concentration: Powder |
Naphtol AS-MX Phosphate Disodium Salt | Sigma-Aldrich | N5000 | Solvent: DMSO. Stock concentration: Powder |
Fast Blue BB Salt | Sigma-Aldrich | F3378 | Solvent: TrisHCL pH 9.0. Stock concentration: Powder |
Fast Red Violet LB Salt | Sigma-Aldrich | F3381 | Solvent: TrisHCL pH 9.1. Stock concentration: Powder |
Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Sigma-Aldrich | A-4503 | Solvent: DPBS. Stock concentration: 2% |
Alizarin Red S | ICN Biochemicals | 100375 | Solvent: Ultrapure dH2O. Stock concentration: Powder |
Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | 533998 | 4% |
Triton 100X | MERCK | 11869 | Solvent: DPBS. Stock concentration: 0.2%. Danger_Use only under chemical wood |
Calcein | MERCK | 2315 | Solvent: DPBS . Stock concentration: 200 µg/ml |
2-Propanol | MERCK | 109634 | Danger_Use only under chemical wood |
Ab-CD105 (Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC) | Abcam | ab11415 | Liquid. Application: Flow Cytometry (Flow Cyt) |
Ab-CD44 (Mouse monoclonal [F10-44-2] to CD44 (PE/Cy7®) ) | Abcam | ab46793 | Liquid. Application: Flow Cytometry (Flow Cyt) |
Ab-CD45 (Mouse monoclonal [MEM-28] to CD45 (PerCP)) | Abcam | ab65952 | Liquid. Application: Flow Cytometry (Flow Cyt) |
Ab-CD105 (Human CD105 Purified Antibody) | Invitrogen | MHCD10500 | Solvent: DPBS. Stock concentration: Lyophilized. Application: Immunofluorescence staining (IF) |
Ab-CD44 (Anti-CD44 Antibody) | Abcam | EPR1013Y(ab51037) | Solvent: DPBS. Stock concentration: Lyophilized. Application: Immunofluorescence staining (IF) |
Ab-Stro-1 (Mouse anti-STRO-1) | Invitrogen | 398401 | Solvent: DPBS. Stock concentration: Lyophilized. Application: Flow Cytometry (Flow Cyt) Immunofluorescence staining (IF) |
Alexa Fluor 488 (Anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)) | Invitrogen | A-21206 | Solvent: DPBS. Stock concentration: Lyophilized. Application: Immunofluorescence staining (IF) |
FITC Anti-Mouse IG (FITC-Rabbit Anti Mouse IgG (H+L)) | Invitrogen | 61-6511 | Solvent: DPBS. Stock concentration: Lyophilized. Application: Flow Cytometry (Flow Cyt) Immunofluorescence staining (IF) |
Alexa Fluor 635 Phalloidin | Invitrogen | A34054 | Solvent: DPBS. Stock concentration: Lyophilized. Application: Immunofluorescence staining (IF) |
AutoMACS™Running Buffer MACS Separation Buffer | Miltenyi | 130,091,221 | Liquid. Store at 4°C |
QIAzol®Lysis Reagent | QIAGEN | 79306 | Danger_Use only under chemical wood |
QUANTITECT® Reverse Transcription Kit | QIAGEN | 205314 | _ |
Chlorophorm | Sigma-Aldrich | C2432 | Liquid. Danger_Use only under chemical wood |
Laminar flow hood | GELAIRE | BSB6A | _ |
Chemical hood | ARREDI TECNICI Villa | Modello DYNAMICA | _ |
CO₂ incubator | Officine Meccaniche KW | CO2W91 | _ |
Centrifuge | EPPENDORF | 5415R | _ |
Laser Scanning Confocal Microscopy LSM 5109 Meta | ZEISS | _ | _ |
iCycler PCR Thermalcycler | BIORAD | _ | _ |
CyFlow®SPACE | (PARTEC) | _ | _ |
Inverted Micrposcope Axiovert 200M | ZEISS | _ | _ |
Freezing container , | Nalgene | _ | _ |
Original Pipet-Aid | pbiBrand | _ | _ |
Micropipettes | EPPENDORF | _ | _ |
Glass Pasteur Pipette | SIGMA | _ | _ |
VICTOR3™ | PERKIN ELMER | _ | _ |
Conical tubes (15 and 50 mL) | BD FALCON | 352096 (for 15 mL) 352070 (for 50 mL) | _ |
24 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate | BD FALCON | 353047 | _ |
6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well Plates | CORNING | 3471 | _ |
Serological pipettes (5 and 10 mL) | BD FALCON | 357543 (for 5 mL) 357551 (for 10mL) | _ |
Syringe (5mL) | B|BRAUN | 4617053V | _ |
Petri dish 100X20 mm | BD FALCON | 353003 | _ |
Röhren Tubes (3,5 ml, 55x12mm, PS) | SARSTEDT | 55,484 | _ |
Petri dish 60X15 mm | BD FALCON | 353004 | _ |
Cryovials 1.5 ml | NALGENE | 5000-1020 | _ |
Cell CultureFlasks 25 cm² | BD FALCON | 353014 | _ |
Nylon Net Filter, Hydrophilic | MERCK | NY4104700 | _ |
Swinnex Filter Holder | MERCK | SX0002500 | _ |
Perry tweezer | _ | _ | _ |
Lancet | _ | _ | _ |
Dounce | _ | _ | _ |