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Developmental Biology

अलगाव और वसा व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव सुअर चमड़े के नीचे वसा ऊतकों से

doi: 10.3791/53886 Published: March 31, 2016

Introduction

मोटापा, संयुक्त राज्य अमेरिका में जनसंख्या, एक बॉडी मास इंडेक्स के साथ के बारे में 30% में मौजूद 30 से अधिक, एक प्रचलित दुनिया भर में घटना 1 के रूप में उभरा है। मोटापे की वजह से हृदय रोग, टाइप -2 मधुमेह, कैंसर और 2-4 सहित संबंधित जटिलताओं के लिए नेतृत्व करने के लिए जाता है। इसलिए, मोटापे के साथ निपटने के लिए एक महत्वपूर्ण प्राथमिकता है। मोटापे की वजह से वसा ऊतकों का बड़े पैमाने पर विस्तार से प्रकट होता है, और अत्यधिक भोजन की खपत और आधुनिक समाज में एक आसीन जीवन शैली के लिए जिम्मेदार ठहराया है। इसलिए, वसाजनन और lipogenesis के transcriptional विनियमन का गूढ़ रहस्य मोटापा या मधुमेह के इलाज के लिए 5 वादा पकड़ सकता है।

3T3-एल 1, 3T3-F442A और अन्य माउस adipogenic सेल लाइनों वसा ऊतकों के विकास के दौरान वसाजनन या lipogenesis अध्ययन करने के लिए लागू किया गया है। हालांकि, वहाँ 6 vivo में इन विट्रो में सेल लाइनों और पशुओं के बीच विनियामक तंत्र में कुछ फ़र्क है। प्राथमिक वसा देरीवेद स्टेम सेल (ADSC) stromal संवहनी सेल अंश में सफेद वसा ऊतकों से सीधे पृथक और अंतर करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है। Adipocytes में ADSC के भेदभाव की संभावना सबसे अधिक विवो 7 में वसाजनन और वसा ऊतकों के विकास में lipogenesis की प्रक्रिया का स्मरण दिलाता है।

सूअर वसा ऊतकों के विकास में वसाजनन और lipogenesis के अध्ययन के लिए एक उपयुक्त पशु मॉडल हैं। हमारे पिछले अध्ययनों सुअर का 8-10 कि स्टेरोल नियामक तत्व बाध्यकारी प्रतिलेखन कारक -1 सी (SREBP1c), एक महत्वपूर्ण प्रतिलेखन कारक lipogenic फैटी एसिड synthase की प्रतिलेखन मिलाना के लिए जाना जाता है की अभिव्यक्ति, सुअर का जिगर में फैटी एसिड (PUFA) से हिचकते का प्रदर्शन और वसा ऊतकों। Vivo में इन विट्रो में PUFA की कमी हुई सुअर का SREBP1c की अभिव्यक्ति ऐसे मनुष्यों और चूहों 11-13 के रूप में अन्य प्रजातियों के समान है। इन विट्रो में ये सुअर के अध्ययन के अन्तर में मुख्य रूप से कर रहे हैंerentiated सुअर का ADSC (pADSC) से व्युत्पन्न adipocytes। इसलिए, pADSC के इस प्राथमिक सेल संस्कृति वसा ऊतकों के विकास या अन्य स्टेम सेल अनुप्रयोगों के अध्ययन के लिए एक विश्वसनीय सेलुलर प्रणाली के रूप में सेवा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Protocol

नोट: इस विधि को स्थापित किया गया है और अनुसंधान के क्षेत्र में प्रयोग किया जाता है कि पहले इस प्रयोगशाला से 14-17 रिपोर्ट; समय के साथ कार्यप्रणाली संशोधित किया गया था। वर्तमान प्रक्रिया 6 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेटों पर बोने के साथ एक घेंटा (7 से 9 दिन पुरानी) से सुअर चमड़े के नीचे वसा ऊतकों के 60 ग्राम के एक औसत उपयोग किया गया था। सभी प्रक्रियाओं आरटी पर प्रदर्शन किया गया जब तक अन्यथा नामित। सभी पशु प्रयोगों संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) नेशनल ताइवान विश्वविद्यालय में द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. पाचन मध्यम तैयार

  1. गर्दन और पीठ से चमड़े के नीचे वसा ऊतकों प्राप्त; 40 से 80 घेंटा प्रति ग्राम के लिए (7 से 9 दिन पुरानी), सूअर के आकार पर निर्भर करता है। इधर, एक सुअर से प्राप्त चमड़े के नीचे वसा ऊतकों की 60 ग्राम का उपयोग करें।
  2. पाचन के माध्यम से तैयार: 54,000 इकाइयों की कुल के साथ collagenase द्वितीय पाउडर वजन और 90 मिलीलीटर Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम में भंग (DMEM,एक 100 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक बोतल में 60 ग्राम वसा) (कोलैजिनेज़ की 900 इकाइयों / 1.5 मिलीलीटर DMEM / छ वसा) के लिए।
  3. धीरे भंग करने और उसके बाद नसबंदी के लिए एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से पाचन मध्यम पारित कम से कम 15 मिनट के लिए एक प्रकार के बरतन तालिका (100 आरपीएम) पर पाचन मध्यम आंदोलन। उपयोग करने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।

2. सूअरों से काटना चमड़े के नीचे वसा ऊतकों

  1. उपयोग करने से पहले सभी उपकरणों, कांच और प्लास्टिक के बर्तन और 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म सभी मीडिया जीवाणुरहित।
  2. बिजली आश्चर्यजनक और exsanguination के साथ या स्थानीय IACUC नियमों के अनुसार एक विधि का उपयोग कर घेंटा बलिदान। विच्छेदन ध्यान से और तुरंत पूरा करने के बाद piglets बलिदान कर रहे हैं।
  3. एक साफ शल्य चिकित्सा की मेज पर घेंटा निर्धारित करना (वापस ऊपर और नीचे का सामना करना पड़ और पेट)। घेंटा वापस midline के नीचे दोनों पक्षों पूंछ के लिए और पर गर्दन से सभी बाल हटाने से बाल दाढ़ी।
  4. 7.5% povidone- साथ सुअर के पृष्ठीय त्वचा साफ़आयोडीन (तीन नए स्वतंत्र-स्क्रब के साथ) तीन बार और फिर आयोडीन के बारे में 10 मिनट के लिए त्वचा की सतह पर बैठने के लिए अनुमति देते हैं।
  5. 70% इथेनॉल के कई स्प्रे के साथ povidone आयोडीन निकालें। धुंध पैड या ऊतक 70% इथेनॉल युक्त एक ही दिशा में त्वचा सफाया करने के लिए, जब तक दोहरा povidone आयोडीन का कोई स्पष्ट रंग मनाया जाता है कागजात का प्रयोग करें।
  6. मांसपेशियों से जुड़ी त्वचा की परत जबकि वसा को पकड़े और त्वचा संदंश का उपयोग के साथ साथ चमड़े के नीचे वसा ऊतकों के सुअर का पृष्ठीय मोटी परत अलग करने के लिए एक छुरी का प्रयोग करें।
  7. इसके तत्काल बाद एक निष्फल बीकर (200 मिलीलीटर) सीरम मुक्त DMEM युक्त जुड़ी त्वचा के साथ चमड़े के नीचे वसा ऊतकों की मोटी परत को विसर्जित कर दिया।
  8. 70% इथेनॉल और एक लामिना का प्रवाह सेल संस्कृति हुड में जगह के साथ मोटी परत युक्त बीकर के बाहर स्प्रे। एक बड़े (40 सेमी x 30 सेमी) निष्फल ट्रिपल-परत कवर हुड में पन्नी रखें। [एक ट्रिपल परत नित्य अखंडता को सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग किया जाता है।]
  9. इसे रखोत्वचा को कवर पन्नी पर नीचे का सामना करना पड़ के साथ ऊतक।
  10. संदंश और कैंची का उपयोग मांसपेशियों के ऊतकों के साथ संक्रमण से बचने के लिए वसा ऊतकों के बंद शेष मांसपेशियों के ऊतकों ट्रिम।
  11. चौकोर टुकड़ों में वसा में कटौती (~ 7 सेमी x 7 सेमी) एक छुरी या कैंची के साथ। एक नया निष्फल बीकर (200 मिलीलीटर) सीरम मुक्त DMEM युक्त में मोटी परत के इन टुकड़ों को डाल दिया।
  12. कवर पन्नी एक कार्बन स्टील स्लाइसर ब्लेड (चित्रा 1) के साथ इकट्ठे पर एक स्वनिर्धारित टुकड़ा धारक सेट करें। बीकर के बाहर वसा का एक टुकड़ा ले लो और स्लाइसर (नीचे ऊपर और मोटी परत पर त्वचा की परत) पर जगह है।
  13. लगभग 1 मिमी मोटी टुकड़ों में चमड़े के नीचे वसा ऊतकों की मोटी परत स्लाइस। त्वचा संभव के रूप में बंद से मोटी परत स्लाइस लेकिन त्वचा टुकड़ा करने की क्रिया से बचें।
  14. कीमा संभव के रूप में ठीक कैंची के साथ वसा ऊतकों कटा हुआ।
  15. फ़िल्टर पाचन कोलैजिनेज़ युक्त मध्यम एक 250 मिलीलीटर Erlenmeyer कुप्पी या एक सीरम वैज्ञानिक बोतल में जोड़े कीमा के साथवसा ऊतकों (collagenase के 54,000 इकाइयों / 90 मिलीलीटर DMEM / 60 ग्राम वसा)।
  16. सेते हैं और Erlenmeyer फ्लास्क 37 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट के लिए एक कक्षीय प्रकार के बरतन में 45 rpm पर चक्कर आने कोलैजिनेज़ ऊतकों को पचाने के लिए अनुमति देने के लिए।
    नोट: हर 15 से 30 मिनट चेक-पाचन से बचने के लिए। यदि पाचन मध्यम महत्वपूर्ण ऊतक झुरमुटों के बिना एक घोल है पाचन प्रक्रिया पूरी की है।
  17. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ DMEM / F12 युक्त मध्यम संस्कृति के एक बराबर मात्रा (पाचन मध्यम के बराबर) collagenase पाचन को रोकने के लिए जोड़ें।

आकृति 1
चित्रा 1. pADSC के अलगाव के लिए इस्तेमाल किया एक अनुकूलित स्लाइसर। विच्छेदित सुअर का पृष्ठीय चमड़े के नीचे वसा ऊतकों से वसा ऊतकों जुड़ी त्वचा की परतों के साथ मोटी परत से बना रहे हैं। एक स्लाइसर मोटी परत खत्म से बचाव के साथ मोटी लगभग 1 मिमी टुकड़ा करने के लिए आवश्यक हैत्वचा की परतों में टुकड़ा करने की क्रिया। टुकड़ा धारक, स्लाइसर पैड, कार्बन स्टील स्लाइसर ब्लेड, और शिकंजा: बाएं से दाएं। स्लाइसर ब्लेड टुकड़ा धारक और slicer पैड जब इकट्ठे के बीच डाला जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

3. Stromal संवहनी अंश से pADSC का संग्रह

  1. एक साफ निष्फल 250 मिलीलीटर Erlenmeyer फ्लास्क में शिफॉन की एक परत या 250 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक बोतल के माध्यम से पाचन पचा वसा ऊतकों युक्त मध्यम गुजरती हैं। शिफॉन के बीच मार्गदर्शन और डाइजेस्ट के पारित होने की सहायता के लिए दबाना एक संदंश का प्रयोग करें।
  2. नाली और पारित होने के पूरा करने के लिए एक संदंश के साथ शिफॉन मोड़।
  3. चार 50 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब (~ ट्यूब प्रति 40 मिलीलीटर मध्यम) में पाचन मध्यम बांटो।
  4. 10 मिनट के लिए 700 XG पर अपकेंद्रित्र stromal संवहनी कोशिकाओं की गोली लेने के लिए।
  5. 6 मिनट के लिए 700 XG पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला छानना।
  6. 10 मिलीलीटर एसीके lysis बफर जोड़ें और फिर pipetting द्वारा गोली resuspend। यह आरटी पर 7 मिनट (5 से 10 मिनट के लिए) के लिए खड़े stromal संवहनी अंश में लाल रक्त कोशिकाओं lyse करने के लिए करते हैं।
  7. DMEM (10 एमएल) के बराबर मात्रा में ट्यूब के कोमल झटकों के साथ प्रतिक्रिया को रोकने के लिए और फिर 10 मिनट के लिए 700 XG पर अपकेंद्रित्र जोड़ें।
  8. सतह पर तैरनेवाला छानना, प्रत्येक ट्यूब में 10 मिलीलीटर DMEM जोड़ने के लिए, 6 मिनट के लिए 700 XG पर दोहराया pipetting के साथ गोली, और सेंट्रीफ्यूज resuspend। दो बार दोहराएँ।
  9. लीजिए और एक नया 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में एक 100 माइक्रोन झरनी के माध्यम से DMEM निलंबित कोशिकाओं के साथ (60 ग्राम वसा का प्रतिनिधित्व करने वाले 4 ट्यूब से 40 मिलीलीटर DMEM के कुल) से गुजरती हैं।
  10. धीरे पिपेट मेडीउम कई बार एक नया 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में अच्छी तरह से और विभाज्य मिश्रण करने के लिए सेल युक्त मध्यम 0.4% trypan नीले समाधान (1:10 कमजोर पड़ने) के 180 μl के साथ मिश्रित के 20 μl।
  11. 60,000 कोशिकाओं / 2 सेमी के घनत्व पर एक hemocytometer और फिर बीज pADSC के साथ कोशिकाओं की गणना DMEM / F12, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और पेनिसिलिन की 1% एंटीबायोटिक दवाओं युक्त संस्कृति के माध्यम से संस्कृति डिश या थाली के एक वांछित आकार पर -streptomycin-amphotericin बी समाधान (पी / एस / ए)। आम तौर पर, वसाकोशिका या osteocyte भेदभाव के लिए 6 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट पर pADSC बीज। स्टेम सेल या उपास्थिकोशिका भेदभाव की सतह मार्कर धुंधला के लिए 10 सेमी बर्तन पर pADSC बीज।
  12. प्लेटों या 5% सीओ 2 के साथ हवा में 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में बर्तन सेते प्लेटों के लिए सेल लगाव की अनुमति है।

4. पहचान स्टेम कोशिका की सतह से फ्लो द्वारा pADSC का मार्करों

  1. 24 घंटे के बाद, पूरी तरह से मध्यम हटाने, वें धोनेफॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस), और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 0.25% trypsin EDTA के 1 मिलीलीटर के साथ फसल की कोशिकाओं के साथ ई-10 सेमी पकवान दो बार।
  2. , संस्कृति के माध्यम से (1 मिलीलीटर) के बराबर मात्रा के साथ trypsin-EDTA बेअसर एक नया 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा, और फिर 7 मिनट के लिए 400 × छ अपकेंद्रित्र।
  3. सतह पर तैरनेवाला छानना। 7 मिनट के लिए 400 XG पर centrifugation के साथ मिलकर pipetting द्वारा गोली दो बार 3 मिलीलीटर ठंडा एफसीएस धोने बफर में (पीबीएस युक्त 10% FBS) फिर से निलंबन का उपयोग कर धो लें।
  4. Resuspend, गिनती, और ठंडा एफसीएस धोने बफर में 10 6 कोशिकाओं / एमएल pADSC समायोजित करें। प्लेस कोशिकाओं (100 μl / प्रत्येक ट्यूब) कई नए 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में और या तो phycoerythrin संयुग्मित CD4a (CD4a पीई), CD29-पे, CD31 पीई के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर pADSC युक्त ट्यूबों सेते , CD44-पे, CD45-पे, CD90-पे, एमएचसी मैं पीई या प्रत्यक्ष धुंधला के लिए MHC द्वितीय पीई। कोशिकाओं को 10 मिलीलीटर एफसीएस-धो बफर 400 × छ centrifugat के साथ मिलकर में दो बार धोने से प्रतिक्रिया बंद करो7 मिनट के लिए आयन।
  5. फिक्स और निर्धारण बफर में कोशिकाओं निर्माता के निर्देशों और हमारे पिछले प्रकाशन 18 के अनुसार प्रवाह cytometry के लिए (0.01% FBS और 1% formaldehyde के साथ पीबीएस) resuspend।

Adipocytes, osteocytes और Chondrocytes में pADSC 5. भेदभाव

  1. adipocytes में pADSC के भेदभाव
    1. वसाकोशिका प्रेरण मध्यम और वसाकोशिका रखरखाव के माध्यम से तैयार
      1. 1 मिलीलीटर इंसुलिन शेयर (10 मिलीग्राम / एमएल HEPES बफर, पीएच 8), अंतिम सान्द्र =: वसाकोशिका प्रेरण मध्यम के लिए, सीरम मुक्त DMEM / F12 के 1 एल निम्नलिखित युक्त (1% की एंटीबायोटिक दवाओं के पी / एस / ए) के साथ तैयार 10 माइक्रोग्राम / एमएल; 1 μl T3 शेयर (3,3, 5-Triiodo एल thyronine, DMSO में 1 मिमी), अंतिम सान्द्र = 1 एनएम; 200 μl transferrin शेयर (50 मिलीग्राम / एमएल डबल आसुत एच 2 ओ), अंतिम सान्द्र = 10 माइक्रोग्राम / एमएल; 100 μl dexamethasone शेयर (इथेनॉल में 10 मिमी), अंतिम सान्द्र = 1 माइक्रोन; 100 μl rosiglitazone शेयर (DMSO में 10 मिमी), अंतिम सान्द्र= 1 माइक्रोन।
      2. प्रेरण माध्यम के रूप में एक ही परिवर्धन के साथ वसाकोशिका रखरखाव के माध्यम से तैयार है, लेकिन dexamethasone की चूक के साथ।
    2. adipocytes के लिए भेदभाव प्रक्रिया
      नोट: 6 अच्छी तरह से प्लेटों पर pADSC बोने के बाद, pADSC 72 घंटे के भीतर मिला हुआ होना होगा।
      1. 3 दिनों के बाद, पूरी तरह से मध्यम हटाने और फिर अच्छी तरह से प्रत्येक में वसाकोशिका प्रेरण माध्यम के 3 मिलीलीटर जोड़ें। इनक्यूबेटर प्लेटें लौटें। इस भेदभाव के शून्य दिन है।
      2. 3 दिनों के बाद, पूरी तरह से वसाकोशिका प्रेरण मध्यम हटाने और हर तीन दिन वसाकोशिका रखरखाव मध्यम के 3 मिलीलीटर के साथ बदलें। परिपक्व adipocytes टर्मिनली के बारे में 9 दिनों से भेदभाव कर दिया जाएगा। adipocytes के 90% से अधिक अच्छी तरह से इस प्रोटोकॉल का उपयोग भेदभाव कर रहे हैं। ये adipocytes तेल लाल हे धुंधला के लिए तैयार हैं।
  2. osteocytes में pADSC के भेदभाव
    1. osteocyte प्रेरण मध्यम तैयार: पूरी संस्कृति mediuएम 1 माइक्रोन dexamethasone, 10 मिमी β-glycerophosphate और 50 माइक्रोग्राम / एमएल एस्कॉर्बेट-2-फॉस्फेट युक्त (DMEM / 10% FBS और 1% पी / एस / ए के साथ F12)।
    2. osteocytes के लिए भेदभाव प्रक्रिया
      नोट: 6 अच्छी तरह से प्लेटों पर pADSC बोने के बाद, pADSC 72 घंटे के भीतर मिला हुआ होना होगा।
      1. 3 दिनों के बाद, पूरी तरह से मध्यम हटाने और प्रत्येक कुएं में osteocyte प्रेरण माध्यम के 3 मिलीलीटर जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर प्लेटें लौटें। इस भेदभाव के शून्य दिन है।
      2. हर तीन दिन osteocyte प्रेरण माध्यम के साथ बदलें। परिपक्व osteocytes भेदभाव के 14 दिनों से बनेगी। ये osteocytes Alizarin लाल एस धुंधला के लिए तैयार हैं।
  3. chondrocytes में pADSC के भेदभाव
    1. उपास्थिकोशिका प्रेरण मध्यम तैयार: αMEM 1% FBS, 6.25 माइक्रोग्राम / एमएल इंसुलिन, 50 माइक्रोग्राम / एमएल एस्कॉर्बेट-2-फॉस्फेट युक्त, और 10 बदलने वृद्धि कारक β1 एनजी / एमएल।
    2. chondrocytes के लिए भेदभाव प्रक्रिया 24 घंटे के लिए 10 सेमी संस्कृति बर्तन पर pADSC बोने के बाद, पूरी तरह से संस्कृति के माध्यम से हटाने और पीबीएस के साथ दो बार बर्तन धोने।
    3. 5 मिनट के लिए 0.25% trypsin EDTA के 1 मिलीलीटर, और फिर साथ Trypsinize pADSC 1 मिलीलीटर संस्कृति के माध्यम से बेअसर। लीजिए, गिनती और ट्यूब प्रति 2.5 × 10 5 कोशिकाओं के घनत्व के साथ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में pADSC समायोजित करें। कोशिकाओं की गिनती करने के लिए एक hemocytometer का प्रयोग करें।
    4. 7 मिनट के लिए 400 × छ centrifugation के बाद, गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला त्यागने और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में उपास्थिकोशिका प्रेरण के माध्यम से 1 मिलीलीटर जोड़ें। ट्यूब 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में लौट रहा है। इस भेदभाव के शून्य दिन है।
    5. तल पर कोशिकाओं को हटाने के बिना उपास्थिकोशिका प्रेरण मध्यम हर तीन दिन बदलें। परिपक्व chondrocytes लगभग 14 दिनों में बनेगी। ये chondrocytes Toluidine ब्लू हे धुंधला के लिए तैयार हैं।

6. विभेदित adipocytes, Osteocy का धुंधलाटीईएस और Chondrocytes

  1. विभेदित adipocytes के लिए तेल लाल हे धुंधला
    1. 9 दिन में, अलग-अलग adipocytes के साथ 6 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों में वसाकोशिका रखरखाव मध्यम हटाने और फिर पीबीएस के साथ दो बार प्लेट धो लें। [निम्न चरणों में, 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से कवर करने के लिए पर्याप्त नामित अभिकर्मकों जोड़ें।]
    2. कम से कम 10 मिनट के लिए 10% formalin समाधान के साथ adipocytes को ठीक करें।
    3. 10% formalin समाधान निकालें और डबल आसुत जल के साथ दो बार प्लेट धो लें।
    4. दो washes के बाद, संस्कृति की थाली के लिए 100% प्रोपलीन ग्लाइकोल जोड़ें और 1 मिनट के लिए खड़े हो जाओ।
    5. 100% प्रोपलीन ग्लाइकोल निकालें और फिर तेल लाल हे संस्कृति की थाली का हल (प्रोपलीन ग्लाइकोल में 0.5%) जोड़ें। कोमल आंदोलन (100 आरपीएम) के साथ एक प्रकार के बरतन घुमाव पर कम से कम 10 मिनट के लिए खड़े हैं।
    6. तेल लाल हे समाधान निकालें और फिर 60% प्रोपलीन ग्लाइकोल के साथ बदलें। 1 मिनट के लिए खड़े हैं।
    7. 60% प्रोपलीन ग्लाइकोल निकालें और फिर से डी में दो बार प्लेट धोनेouble-आसुत जल।
    8. 10% formalin समाधान के साथ बदलें। adipocytes के अंदर दाग लिपिड बूंदों प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा अवलोकन के लिए तैयार हैं।
    9. intracellular तेल लाल हे की मात्रा (नीचे वैकल्पिक कदम): सूक्ष्म अवलोकन के बाद, 10% formalin समाधान निकालने और डबल आसुत जल के साथ दो बार प्लेट धो लें।
    10. प्लेट पूरी तरह से नाली और 6 अच्छी तरह से थाली करने के लिए isopropanol के 500 μl जोड़ें।
    11. isopropanol में कम से कम 10 मिनट के लिए एक सौम्य घुमाव प्रकार के बरतन (100 आरपीएम) पर 6 अच्छी तरह से थाली में खड़े तेल लाल ओ की डाई भंग करने के लिए करते हैं
    12. युक्त तेल लाल हे isopropanol Aspirate और एक 96 अच्छी तरह से थाली पर वितरित। 510 एनएम पर एक spectrophotometric पढ़ने का उपयोग कर निकाला तेल लाल हे यों।
  2. भेदभाव osteocytes के लिए Alizarin लाल एस धुंधला
    1. 14 दिन में अलग-अलग osteocytes के साथ 6 अच्छी तरह से प्लेटों से osteocyte प्रेरण मध्यम हटाने और पीबीएस के साथ दो बार प्लेटें धोने। [Followi मेंएनजी कदम पर्याप्त नामित अभिकर्मकों जोड़ने 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से कवर करने के लिए।]
    2. कम से कम 10 मिनट के लिए 10% formalin समाधान में osteocytes को ठीक करें।
    3. प्रत्येक अच्छी तरह से 10% formalin समाधान निकालें और डबल आसुत जल के साथ दो बार प्लेट धो लें।
    4. दो washes के बाद, 2% Alizarin लाल एस 6 अच्छी तरह से थाली करने के लिए समाधान (पीएच = 4.1-4.3) जोड़ सकते हैं और एक सज्जन घुमाव प्रकार के बरतन (100 आरपीएम) पर कम से कम 15 मिनट के लिए खड़े हो जाओ।
    5. Alizarin लाल एस समाधान निकालें और फिर डबल आसुत जल के साथ दो बार प्लेट धो लें।
    6. 10% formalin समाधान के साथ बदलें। Osteocytes प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा अवलोकन के लिए तैयार हैं।
  3. Toluidine विभेदित chondrocytes के लिए ब्लू हे धुंधला
    1. 14 दिन में, पीबीएस के साथ दो बार ट्यूब के नीचे में भेदभाव chondrocytes के अवसादों को दूर करने और ट्यूब धोने के बिना 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब से महाप्राण उपास्थिकोशिका प्रेरण मध्यम। [निम्न चरणों में, कोव के लिए पर्याप्त नामित अभिकर्मकों जोड़ेंआर ट्यूब के या अनुभाग स्लाइड पर तल में Chondrocytes।]
    2. कम से कम 10 मिनट के लिए 10% formalin समाधान में chondrocytes को ठीक करें।
    3. प्रत्येक ट्यूब से 10% formalin समाधान निकालें और डबल आसुत जल के साथ दो बार ट्यूब धो लें।
    4. दो washes के बाद, 5 माइक्रोन की मोटाई पर cryostat के साथ अक्टूबर यौगिक हैं और इस खंड में छर्रों एम्बेड।
    5. Toluidine ब्लू ओ समाधान (4.1 पीएच के साथ 0.1%) के साथ cryostat वर्गों की स्लाइड दाग।
    6. Toluidine ब्लू हे समाधान निकालें और फिर डबल आसुत जल के साथ दो बार खंड धो लें।
      नोट: स्लाइड पर Chondrocytes प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा अवलोकन के लिए तैयार हैं।

Representative Results

PADSC सुअर पृष्ठीय वसा से प्राप्त होता संस्कृति प्लेटों या बर्तन पर वरीयता प्राप्त और चित्रा 2 में दिखाया गया। PADSC stromal संवहनी अंश से प्राप्त की आकृति विज्ञान माउस या मानव ADSC के समान है। चौबीस घंटे के बोने के बाद, subconfluent pADSC पालन किया और एक विस्तारित fibroblast तरह आकारिकी (2A चित्रा) कर रहे हैं। PADSC 72 घंटे के भीतर मिला हुआ हो और वसाकोशिका या अन्य mesenchymal प्रकार भेदभाव (चित्रा 2 बी) के लिए तैयार हो जाएगा। pADSC मजबूत adipogenic संभावित प्रदर्शन के बाद रासायनिक प्रेरण और परिपक्व adipocytes adipogenic भेदभाव (चित्रा -2) दिखा pADSCs के 90% से अधिक के साथ भेदभाव के 9 दिनों के बाद देखा जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल में निकाली गई pADSC की विशेषताओं को संबोधित करने के लिए, pADSC की सतह मार्कर गुदा प्रवाह cytometry द्वारा मूल्यांकन किया गयाविश्लेषण। के रूप में 3 चित्र में दिखाया, CD29, CD44, CD90 और एमएचसी मैं (या एचएलए मैं) सहित mesenchymal स्टेम कोशिकाओं, के लिए सतह मार्कर, अत्यधिक व्यक्त किया गया। ऐसे CD4a, CD31, CD45 और MHC द्वितीय (या एचएलए द्वितीय) के रूप में नकारात्मक सतह मार्कर, प्रोटोकॉल (चित्रा 3) में निकाली गई pADSC में मुश्किल से पहचाने जाने थे। इन परिणामों दिखाना है कि इन pADSC प्रदर्शनी mesenchymal प्रकार महत्वपूर्ण endothelial या हेमतोपोइएतिक स्टेम सेल संदूषण, माइलॉयड या लसीकावत् पूर्वज शामिल किए बिना स्टेम सेल विशेषताओं।

आगे पुष्टि करते हैं कि pADSC mesenchymal स्टेम कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं, pADSC की multipotency adipocytes, osteocytes और chondrocytes में भेदभाव द्वारा जांच की गई थी। ये adipocytes, osteocytes और chondrocytes विशिष्ट रंगों, तेल लाल हे, Alizarin लाल एस, और Toluidine ब्लू हे, क्रमशः (चित्रा 4) से दाग रहे थे। इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि इस प्रोटोकॉल pADSC कि म्यू बरकरार रखा उत्पन्नपूर्ण विशेषताओं mesenchymal प्रकार पूर्वज दिखने के साथ ltipotency।

चित्र 2
चित्रा 2. सुअर वापस वसा क्षेत्र से pADSC की आकृति विज्ञान। (ए) Subconfluent pADSC पालन किया और बाद में 6 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली पर 24-एच बोने का विस्तार किया। (बी) pADSC 6 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली पर 72-एच बोने के बाद मिला हुआ हो गया। (सी) परिपक्व adipocytes pADSC से adipogenic भेदभाव के 9 दिन बाद मनाया गया। छवियाँ 100 x चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग बढ़ाई लिया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. स्टेम सेल की पहचानpADSC के लिए सतह मार्करों। 1 एक्स 10 pADSC के 5 विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की और विश्लेषण प्रवाह cytometry द्वारा स्टेम सेल मार्कर के लिए विश्लेषण किया गया। नंबर बेदाग नियंत्रण के साथ तुलना में जनसंख्या (लाल) में दाग कोशिकाओं का प्रतिशत संकेत मिलता है। एक्स अक्ष रिश्तेदार प्रतिदीप्ति तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है। Y अक्ष कोशिकाओं की आबादी का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. multipotent pADSC। PADSC की multipotency के भेदभाव (ए) adipocytes, (बी) osteocytes (सी) chondrocytes में pADSC फर्क द्वारा निर्धारित और प्रतिनिधि रंजक, तेल लाल हे, Alizarin लाल एस, और Toluidine ब्लू हे क्रमश सना हुआ था । भारतीय सैन्य अकादमीGES (ए) 100 x, (बी) 200 x, और (सी) 100 x बढ़ाई चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग पर ले जाया गया, क्रमशः। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यहाँ हम pADSC के प्राथमिक सेल संस्कृति में वसा ऊतकों के विकास का अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय सेलुलर प्रणाली प्रस्तुत करते हैं। अन्य अमर सेल लाइनों की तुलना में, इस विधि उच्च गुणवत्ता वाले वयस्क mesenchymal स्टेम कोशिकाओं कि adipocytes या विवो में पशु विकास से संबंधित अन्य mesenchymal प्रजातियों के भेदभाव प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता की बड़ी मात्रा को अलग करने के लिए एक सुविधाजनक तरीका प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम संशोधित है कि हम एक 7 से 9 दिन पुरानी घेंटा उपयोग कर, क्योंकि यह पुराने सूअरों की तुलना में छोटा घेंटा संभालना आसान और अन्य प्रजातियों 19,20, उपज और pADSC की multipotency के समान है pADSC निकाले जाते है सुअर उम्र 21 के रूप में कम हो जाती है।

संभावित स्टेम सेल के सूत्रों भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ईएससी), प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (IPSC), और प्रसव के बाद वयस्क स्टेम सेल शामिल हैं। ADSC की बाधा, वयस्क multipotent स्टेम कोशिकाओं के रूप में वर्गीकृत, वयस्क स्टेम कोशिकाओं की कि multipotency हैअलग-अलग प्रजातियों फर्क में अपेक्षाकृत ईएससी या IPSC के साथ तुलना में सीमित है। हालांकि, IPSC के ईएससी और ऑन्कोजेनिक संपत्तियों की व्युत्पत्ति के बारे में नैतिक मुद्दों ईएससी और IPSC 22,23 के आवेदन को नियंत्रित। इसलिए, कई जांचकर्ताओं pluripotency बढ़ाने के प्रयासों के साथ वयस्क स्टेम कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित किया है। वयस्क mesenchymal स्टेम सेल (एमएससी), जो लंबे समय से अध्ययन किया गया है, का सबसे आम स्रोत अस्थि मज्जा व्युत्पन्न mesenchymal स्टेम सेल 24 है। हालांकि, कटाई अस्थि मज्जा एक अपेक्षाकृत दर्दनाक प्रक्रिया माना जाता है। एक और चिंता यह है कि अस्थि मज्जा से स्टेम कोशिकाओं की उपज परिमित है। अस्थि मज्जा रेस्पायरेट्रस मिलीलीटर प्रति 6 × 10 6 केन्द्रक की कोशिकाओं के एक औसत उपज, और एमएससी केवल सभी केन्द्रक की कोशिकाओं के 0,001 0.01% प्रतिनिधित्व करते हैं। इन कमियों पर विचार करने के बाद, ADSC एक कम निकला हुआ स्रोत multipotent स्टेम कोशिकाओं 25,26 प्राप्त करने के लिए के रूप में सुझाव दिया है।

regenera में ADSC के उपयोग पर सीमाएंसक्रिय चिकित्सा, निर्भर कर रहे हैं सेल उपज और गुणवत्ता पर काफी हद तक। इसलिए, सूअरों को रोजगार के इस प्रोटोकॉल में ADSC अलग-थलग करने के महत्व को उच्च गुणवत्ता वाले वयस्क स्टेम कोशिकाओं की एक बड़ी मात्रा में उपज है। सुअर एक उपयोगी पशु मॉडल तुलनीय अंग के आकार और प्रजाति 27-30 के बीच कई शारीरिक और जैव रासायनिक समानता की वजह से मनुष्य का प्रतिनिधित्व है। वाणिज्यिक कंपनियों से hADSC हासिल करना महंगा है और कई मामलों में कोशिकाओं को चालाकी से किया गया है, passaged या cryopreserved है। मानव नैदानिक ​​नमूने हासिल करना नैतिक मुद्दों की वजह से अपेक्षाकृत मुश्किल है और ADSC के उत्पादन सीमित है। हम collagenase पाचन के बाद ग्राम वसा के अनुसार लगभग 6 x 10 5 hADSC निकाले जाते हैं। महिला स्तन वसा ऊतकों की 100 ग्राम (एक औसत नमूना) के साथ, 6 10 x 7 कोशिकाओं की कुल काटा जा सकता है। एक व्यक्ति माउस का प्रयोग, उपज भी अधिक सीमित है। 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं के कुल चमड़े के नीचे माउस मैं की 0.4 ग्राम से काटा जा सकता हैएक वयस्क FVB माउस के दोनों पैरों से nguinal वसा ऊतकों (6-8 सप्ताह पुराने)। हालांकि एक व्यक्ति सुअर (7 से 9 दिन पुरानी) में, 2 एक्स 10 8 कोशिकाओं की कुल आसानी से चमड़े के नीचे वसा पृष्ठीय वसा डिपो से प्राप्त ऊतक की 60 ग्राम से काटा जा सकता है। pADSC इस प्रोटोकॉल में निकाली गई पूर्ण mesenchymal प्रकार multipotency और उचित mesenchymal स्टेम सेल मार्कर है। इसलिए, pADSC स्टेम सेल गुणवत्ता से समझौता किए बिना वयस्क स्टेम कोशिकाओं की बड़ी मात्रा में प्राप्त करने के लिए एक अनुकूल स्रोत हैं।

pADSC के आवेदन वसाजनन और lipogenesis सहित वसाकोशिका भेदभाव का गूढ़ रहस्य के लिए ही सीमित नहीं है। हाल ही में, ADSC पुनर्योजी चिकित्सा 22,31,32 के क्षेत्र में स्टेम कोशिकाओं का एक लोकप्रिय स्रोत बन गए हैं। अन्य स्टेम सेल के सूत्रों की तुलना में, ADSC आसानी से सुलभ और प्रचुर मात्रा में होने का एक अनूठा लाभ को बनाए रखने, और उनके मजबूत multipotency स्टेम सेल थेरेपी और ऊतक ई के लिए एक आशाजनक स्रोत होने के लिए प्रदर्शन किया गया हैngineering 22,33,34। वसा ऊतकों की आसान पहुंच ADSC कम से कम दखल तरीके multipotent progenitors मिल में से एक बनाता है। हाल ही में, हम ग्लूकोज उत्तरदायी इंसुलिन स्रावित समूहों में pADSC भेदभाव, यह दर्शाता है कि pADSC mesenchymal भेदभाव (अप्रकाशित डेटा) तक सीमित नहीं हैं। दूसरों को भी प्रदर्शन किया गया है कि ADSC कई प्रकार की कोशिकाओं में इस तरह के endodermal hepatocytes या बहिर्जनस्तरीय न्यूरॉन्स (hADSC 35 या 36 pADSC से) (hADSC 37 या 38 pADSC से) के रूप में अन्य रोगाणु परतों से निकाली गई में भेदभाव किया जा सकता है। इस प्रकार, pADSC अलग-अलग भेदभाव प्रक्रियाओं के लिए कोशिकाओं निर्देशन वांछित प्रजातियों उपज के द्वारा उच्च throughput दवा या biomaterial स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसलिए, इस प्रोटोकॉल में निकाली गई pADSC पुनर्योजी चिकित्सा अनुसंधान के लिए स्टेम सेल थेरेपी और ऊतक प्रत्यारोपण में संभावित आवेदन किया है।

Acknowledgments

लेखकों व्यापक चर्चा के लिए सभी प्रयोगशाला के सदस्यों के प्रति आभार व्यक्त करना चाहूंगा और तकनीक इस प्रोटोकॉल में समर्थन करता है। प्रयोगशाला में प्रदर्शन अनुसंधान विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया (सबसे 103-2314-बी-002-126 और सबसे 102-2313-बी-002-026-MY3) और शीर्ष विश्वविद्यालय योजना के लिए उद्देश्य से अनुदान द्वारा राष्ट्रीय विश्वविद्यालय, ताइवान के (104R350144)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Collagenase, Type II Sigma-Aldrich C6885
DMEM, high glucose, pyruvate Life Technologies 11995-040
DMEM/F-12, HEPES Life Technologies 11330-032
Fetal Bovine Serum (FBS)  Biological Industries 04-001-1  
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B (P/S/A) solution Biological Industries 03-033-1 For antibiotics and antimycotic usage
αMEM, no nucleosides  Life Technologies 12561-049
ACK lysis buffer  Life Technologies A10492-01
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Life Technologies 25200072
CD4a-PE Sigma-Aldrich SAB4700063
CD29-PE Sigma-Aldrich SAB4700398
CD31-PE Sigma-Aldrich SAB4700467
CD44-PE Sigma-Aldrich SAB4700183
CD45-PE Sigma-Aldrich SAB4700483
CD90-PE Sigma-Aldrich SAB4700686
HLA Class I-PE (MHC I)  Sigma-Aldrich SAB4700640
HLA-DR-PE (MHC II)  Sigma-Aldrich SAB4700662
Insulin  Sigma-Aldrich I9278
3,3',5-Triiodo-L-thyronine (T3) Sigma-Aldrich T6397
Transferrin  Sigma-Aldrich T2036
3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) Sigma-Aldrich I7018
Dexamethasone  Sigma-Aldrich D4902
Rosiglitazone Cayman 71740
β-Glycerophosphate  Sigma-Aldrich G9422
2-Phospho-L-ascorbic acid  Sigma-Aldrich 49752
TGFB1 Recombinant Human Protein  R&D Systems  240-B-002
Oil Red O  Sigma-Aldrich O0625
Alizarin Red S Sigma-Aldrich A5533
Toluidine Blue O Sigma-Aldrich 198161
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Carbon Steel Blades Thomas Scientific 6727C18
Falcon 100 µm cell strainer Corning  352360
Falcon 6-well plate Corning  353046
Falcon 100 mm  dish Corning  353003

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References

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अलगाव और वसा व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव सुअर चमड़े के नीचे वसा ऊतकों से
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Chen, Y. J., Liu, H. Y., Chang, Y. T., Cheng, Y. H., Mersmann, H. J., Kuo, W. H., Ding, S. T. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. J. Vis. Exp. (109), e53886, doi:10.3791/53886 (2016).More

Chen, Y. J., Liu, H. Y., Chang, Y. T., Cheng, Y. H., Mersmann, H. J., Kuo, W. H., Ding, S. T. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. J. Vis. Exp. (109), e53886, doi:10.3791/53886 (2016).

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