Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

دراسة إشارات Wnt خلال الزخرفة من إجراء الخطوط الجوية

Published: October 16, 2016 doi: 10.3791/53910
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Neonatology and Pulmonary Biology-Perinatal Institute, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 2University of Cincinnati, College of Medicine

Summary

استخدام الفئران مراسل بالإضافة إلى جبل بأكمله وقسم التلوين، والفحص المجهري وفي المقايسات فيفو يسهل تحليل الآليات الكامنة والزخرفة طبيعية من الجهاز التنفسي. نحن هنا تصف كيف ساهمت هذه التقنيات لتحليل إشارات Wnt خلال تطوير القصبة الهوائية.

Introduction

يبدأ تطوير الجهاز التنفسي بعد يوم الجنينية 9 (E9) مع ظهور خلايا إيجابية Nkx2.1 في الأديم الباطن بطني المعى الأمامي 1،2. وفصل أنبوب المريء القصبة الهوائية حل من قبل E11.5 عندما الأنابيب يمكن تمييزها باعتبارها كيانات متميزة، كل تحيط بها الأنسجة الوسيطة 3. يشير WNT تلعب دورا رئيسيا في مواصفات الجهاز التنفسي كما حذف Wnt2 وWnt2b، التي أعرب عنها اللحمة المتوسطة حشوي وحذف β-كاتينين من ظهارة تنفسية الأديم الباطن سوف يؤدي إلى عدم تخلق الرئة 4،5. قررت دراساتنا السابقة أن حذف ولس، مستقبلات البضائع التوسط إفراز كل بروابط WNT، من الأديم الباطن النتائج الجهاز التنفسي في نقص تنسج الرئة، وعيوب في تطوير الأوعية الدموية الرئوية وسوء الزخرفة من اللحمة المتوسطة القصبة الهوائية 6،7. وتدعم هذه البيانات أهمية كرو-الظهارية الوسيطةSS الحديث في تمايز الخلايا والمواصفات، وكما ثبت في دراسات أخرى 8،9.

تعتمد دراسة المراحل الأولى من نمو الرئة لدى الوراثية، في المختبر، وبحكم التقنيات الحية التي سمحت لنا أن نفهم آليات القيادة هوية الجهاز التنفسي 10-16 أفضل. وقد استخدمت على نطاق واسع كلها الثقافات يزدرع الرئة في الطور البيني سائل الهواء لدراسة تأثيرات عوامل النمو في المراحل المبكرة من الرئة المتفرعة التشكل 10،17،18. في حين يتم استخدام هذا الأسلوب كما قراءات من تغيرات شكلية، مثل المتفرعة التشكل، وتعديل التعبير الجيني، فإنه يقتصر على دراسة المراحل الأولى من العملية التنموية، حيث أن الثقافة نفسها لا يدعم تطوير الأوعية الدموية 17. تطوير غضروف القصبة الهوائية تتطلب مرات حضانة أطول قد تكون غير متوافقة مع هذه التقنية الثقافة.

ليحلله دور إشارات Wnt خلال تشكيل الجهاز التنفسي، وتكيفنا التقنيات القياسية لتلبية احتياجات الدراسات الجنينية لدينا. لقد قمنا بتعديل مجلدات، وأحيانا تلطيخ، وتجهيز الدراجات لتضمين البارافين وتوقيت لتطهير للنسيج القصبة الهوائية والرئة. وكان الهدف الرئيسي من تحقيق الاستفادة المثلى من التقنيات الموضحة في هذه الدراسة إلى تحليل المراحل الأولى من تطوير القصبة الهوائية في الفئران التي تجري من E11 إلى E14.5. باستخدام الفئران مراسل خط Axin2LacZ نحن المواقع المحددة بدقة من WNT النشاط / β-كاتينين في اللحمة المتوسطة القصبة الهوائية النامية. تكيفنا أيضا إجراء تلطيخ كتين لكامل جبل أنسجة القصبة الهوائية. وهكذا، كنا قادرين على تصور تكثفات الوسيطة والتنبؤ المواقع التي تكون الغضروف سوف تأخذ مكان. تلطيخ جبل كله وأجزاء من الأنسجة الجنينية تم الحصول عليها من الفئران WlsShhCre، إلى جانب تقنيات المجهر المتقدمة، سمح لنا لكشف النقاب عن دور بروابط WNT التي تنتجها هيئة تنظيم الاتصالاتظهارة cheal في الزخرفة القصبة الهوائية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وتم إيواء الحيوانات في ظروف خالية من مسببات الأمراض. تم التعامل مع الفئران وفقا لبروتوكولات التي وافق عليها CCHMC المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (سينسيناتي، OH الولايات المتحدة الأمريكية). واستمرت الفئران المستخدمة في جميع أنحاء هذه الدراسات في خلفية مختلطة.

1. كامل جبل X-غالاكتوزيداز تلطيخ

  1. الموت ببطء الأنثى الحامل في E11.5 إلى E14.5، من خلال CO 2 الاستنشاق. وضع الحيوانات في CO 2 غرفة، تهمة الغرفة مع CO 2. الحفاظ على الحيوانات في غرفة للا يقل عن 5 دقائق. أداء طريقة الثانوي للقتل الرحيم عن طريق خلع عنق الرحم.
  2. منطقة البطن نظيفة مع الايثانول (ETOH) 70٪ وأداء البطن مع واحد شق خط الوسط في البطن. استخدام مقص جراحي ونمط قياسي (مشرشر على التوالي) ملقط.
  3. عزل قرون الرحم باستخدام ملقط ومقص غرامة وعلى الفور وضع الأنسجة في طبق بتري تحتوي على فتور حل برنامج تلفزيوني. الحفاظ على الأنسجة على الجليد حتى المتابعةلعزل الأجنة.
  4. عزل الأجنة من قرون الرحم. تشريح الجنينية أنسجة القصبة الهوائية في الرئة باستخدام المجهر تشريح. استخدام ملقط غيض الجميلة ومقص لعقد وثقب أنسجة الرحم وconcepti الإفراج عن الأجنة.
    1. إزالة الأغشية الجنينية المتبقية. مع مساعدة من ريش إبرة قطع رأس الأجنة وانخفاض جزء من الجسم أسفل الحجاب الحاجز. تحديد الكبد كمعلم.
    2. بعد عزل المنطقة الصدرية من الجنين، والمضي قدما لإزالة الجانبين الجانبية للجدار الجسم والعمود الفقري والقلب باستخدام شفرات إبرة. رعاية أثناء إزالة القلب لتجنب إصابة الأنسجة القصبة الهوائية. وأخيرا، بعناية، فصل المريء من القصبة الهوائية عن طريق سحب المريء بمساعدة من شفرات إبرة. الحفاظ على الأنسجة في حل برنامج تلفزيوني على الجليد.
  5. مكان الأنسجة في 4 مل المسمار قارورة كاب استخدام الزجاج أو نقل الماصات. إصلاح أنسجة الرئة القصبة الهوائية في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة. بعد التثبيت،شطف الأنسجة مع برنامج تلفزيوني. في حين الشطف، وإعداد حل X-غال تلطيخ (إضافة 5 ملي K 3 الحديد (CN) 6، (100 ميكرولتر 0.5 M الأسهم) 5 ملي K 4 الحديد (CN) 6 (100 ميكرولتر 0.5 M الأسهم) 2 مم MgCl 2، ( 20 ميكرولتر 1 م الأوراق المالية) بنسبة 0.01٪ NaDOC (الأسهم 50 ميكرولتر 2٪)، 0.02٪ NP 4 O (الأسهم 100 ميكرولتر 2٪)، 1 ملغ / مل X-غال (500 ميكرولتر من 20 ملغ / الأسهم مل) و9.13 مل من الماء المقطر لجلب إلى الحجم النهائي من 10 مل).
  6. إزالة أي برنامج تلفزيوني المتبقية وإضافة 2 مل من X-غال حل تلطيخ إلى قارورة زجاجية. ضع قارورة في علبة على شاكر. الأنسجة وصمة عار 1-2 ساعة في X-غال حل تلطيخ. احتضان النسيج في محلول X-غال لمدة 4 ساعة لمزيد من المعالجة والتضمين.
  7. وقف رد فعل من الأنسجة الغسيل في 3٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد-برنامج تلفزيوني. شطف في برنامج تلفزيوني، و 3 مرات لمدة 5 دقائق كل غسل وتخزينها في 70٪ من الإيثانول.
  8. ملء أطباق بتري مع الحل 1٪ الاغاروز / برنامج تلفزيوني. السماح للالاغاروز لترسيخ. استخدام ماصات نقل الزجاج، ووضع النسيج على التعاون الاغاروزلوحات ATED مملوءة بمحلول برنامج تلفزيوني. تصوير يتصاعد بأكملها باستخدام مجهر تشريح. اختيار مرشح مناسب لbrightfield.
  9. للتمييز بين أفضل مواقع X-غال عينات عملية تلطيخ لتضمين البارافين وباجتزاء. عينات مكان في أشرطة الشاشة الجميلة.
    1. لمعالجة عينات لتضمين البارافين استخدام معالج الآلي واقامت دورة قصيرة على النحو التالي: ستة تغييرات الكحول: 5 دقيقة التغيير الأول و 3 دقائق في كل تغيير المتبقية. ثلاثة تغييرات من الزيلين: 5 دقيقة التغيير الأول و 3 دقيقة التغييرات المقبلين. يتم تنفيذ الخطوات السابقة عند 30 درجة مئوية. وأخيرا، نفذ ثلاثة تغييرات من البارافين في 62 درجة مئوية: 25 دقيقة، 8 دقيقة و 5 دقائق.
  10. عينات توجيه لتضمين مع الأنسجة الاستلقاء على الجزء السفلي من تضمين القارب. بعناية إضافة البارافين لملء قارب التضمين. تبريد مباشرة على لوحة الباردة من تضمين المحطة حتى يتصلب البارافين. إزالة كتلة من تضمين القارب. باستخدام مبضع للفحص المجهري، وتوليد 6 ميكرون الصورةections. أقسام جبل على الشرائح سابقة التجهيز والشرائح الجافة على الشريحة الأكثر دفئا مجموعة في 42 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  11. خبز الشرائح بين عشية وضحاها في الفرن على حرارة 56 درجة مئوية. ضع الشرائح في رفوف. Deparaffinize الشرائح مع ثلاثة تغييرات من 100٪ الزيلين، 10 دقيقة لكل منهما. استخدام تلطيخ أطباق مليئة 200 مل من الزيلين.
  12. ترطيب الشرائح باستخدام متدرج سلسلة ETOH (100٪، 70٪، 50٪ و 30٪، 1 دقيقة لكل خطوة) لبرنامج تلفزيوني قبل counterstaining مع الأحمر السريع النووي لمدة 10 إلى 30 ثانية. شطف الشرائح مع ماء الصنبور ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في كل مرة لإزالة الزائدة من أحمر سريع النووي.
  13. يذوى الشرائح في سلسلة ETOH متدرج (50٪، 70٪ و 100٪ ETOH) قبل غسلها في ثلاثة تغييرات من الزيلين (20 الانخفاضات كل تغيير) وغطاء الانزلاق مع وسائل الإعلام تصاعد الزيلين مقرها.

2. كتين تلطيخ

  1. تشريح E13.5 والقصبة الهوائية E14.5 أنسجة الرئة كما هو موضح في الخطوات 1،1-1،4. استخدام ماصات نقل الزجاج مكان الأنسجة في قارورة كاب المسمار. إصلاح أنسجة الرئة القصبة الهوائية مع 2 مل من2٪ محلول PFA بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. بعد التثبيت، شطف العينات في برنامج تلفزيوني ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة كل غسل.
  2. إعداد عازلة تمنع، وعادة ما يكون الحجم النهائي من 10 مل من محلول. إضافة 0.1 غرام من جيش صرب البوسنة (1٪) إلى 8 مل من برنامج تلفزيوني. السماح للجيش صرب البوسنة إلى حل. إضافة 0.2 مل من مصل الماعز (2٪) 0.03ml تريتون X-100 (0.3٪). جلب الحجم النهائي إلى 10 مل مع برنامج تلفزيوني. عينات كتلة لمدة 1 ساعة في 0.5 مل من عازلة تمنع في درجة حرارة الغرفة.
  3. إزالة عازلة تمنع باستخدام ماصة نقل واستبدال الحل كتين تتألف من 50 ميكروغرام / ميكرولتر من كتين، و 10٪ مصل الماعز وبرنامج تلفزيوني. استخدام 250 ميكرولتر من حل كتين لكل عينة. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. تأكد من تغطية قارورة زجاجية تحتوي على الأنسجة مع رقائق الألومنيوم. بعد الحضانة مع حل كتين، شطف العينات في برنامج تلفزيوني ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة.
  4. مكان إإكسبلنتس في الاغاروز المغلفة أطباق بتري تحتوي على ما يكفي من برنامج تلفزيوني لتغطية العينات. تصوير يتصاعد بأكملها باستخدام مجهر تشريح مضان. حدد appropمرشح riate للكشف عن مضان. عادة ما يقترن كتين السلطة الوطنية الفلسطينية إلى GFP.

3. الجامع جبل المناعي تلطيخ ومتحد البؤر المجهري

  1. عزل القصبة الهوائية أنسجة الرئة، ونقل إلى 4 مل الزجاج المسمار قارورة الغطاء وإصلاح بين عشية وضحاها في PFA 4٪. الأنسجة E11.5 يمكن أن تكون ثابتة في 2٪ PFA. متجر في الميثانول بنسبة 100٪. العينات ويمكن تخزين تصل إلى عدة أشهر عند -20 درجة مئوية.
  2. إزالة الميثانول باستخدام ماصة نقل وpermeabilize العينات باستخدام بليتش دنت (4 أجزاء الميثانول، 1 جزء DMSO و 1 جزء 30٪ H 2 O 2) لمدة 2 ساعة. الأنسجة الهيدرات في سلسلة متدرجة من الميثانول مخففة في برنامج تلفزيوني على النحو التالي: الميثانول بنسبة 100٪، 75٪ الميثانول، و 50٪ الميثانول، و 25٪ الميثانول، و 100٪ في برنامج تلفزيوني. احتضان 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة خلال كل خطوة من الماء.
  3. الأنسجة كتلة في 0.5٪ كاشف الحجب مخففة في برنامج تلفزيوني (انظر المواد للحصول على التفاصيل) لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة مع الإثارة.
  4. تمييع الأجسام المضادة الأولية في عرقلةالحل (Sox9 1: 100، Nkx2.1 1: 200، αSMA 1: 250)، واحتضان عينات بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. غسل العينات مع برنامج تلفزيوني خمس مرات في درجة حرارة الغرفة. تنفيذ كل غسل لمدة 1 ساعة.
  5. تطبيق الأجسام المضادة الثانوية في التخفيف 1: 500 في 0.5٪ عرقلة الحل. حدد بعناية الأجسام المضادة الثانوية لمنع ملزم بين الأجسام المضادة الثانوية. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في غرفة مظلمة. غسل العينات ثلاث مرات لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يذوى العينات في سلسلة متدرجة من الميثانول مخففة في برنامج تلفزيوني على النحو التالي: 25٪ الميثانول، و 50٪ الميثانول 75٪ والميثانول، والميثانول بنسبة 100٪، و 10 دقيقة في كل خطوة.
    ملاحظة: تأكد من أن العينات لا تزال مغطاة بورق الألومنيوم وتقليل التعرض للضوء. ويمكن الآن أن يتم تخزين الأنسجة عند 4 درجة مئوية لعدة أسابيع حتى تصويرها.
  6. بنقل العينات إلى العرف لوحات المرحلة، إزالة الميثانول واضحة مع ما يقرب من 200 ميكرولتر من حل موراي واضح 19،20 (2 أجزاء البنزيل بنزوات، 1 جزء البنزيل الكحول) على الفور فرنكاتصوير خام. تصوير باستخدام مجهر متحد البؤر. معالجة وتحليل الصور باستخدام برامج التصوير.

انتشار 4. خلية

  1. حقن الفئران E11.5 الحوامل داخل peritoneally بمحلول مكون من BrdU بتركيز 100 ميكروغرام BrdU / غرام من وزن الجسم. التضحية أنثى كما هو موضح في المادة 1 من البروتوكول وعزل الأجنة في E12.5 أو E13.5. باستخدام شفرات سكين، ورؤساء المكوس والجزء السفلي من الجسم أقل من تجويف الصدر.
  2. وضع الأنسجة الصدرية في 4 مل المسمار قارورة الغطاء وإصلاح في 1 مل من 4٪ PFA بين عشية وضحاها. غسل العينات مع برنامج تلفزيوني مرتين لمدة 5 دقائق ويذوى العينات من خلال سلسلة الإيثانول المخفف في الماء المقطر تصل إلى 70٪ من الإيثانول على النحو التالي: 30٪، 50٪ و 70٪ من الإيثانول، لمدة 5 دقائق كل خطوة.
    1. عينات مكان في أشرطة شاشة متوسطة الحجم. الأنسجة عملية التضمين البارافين باستخدام والمعالج الآلي. اقامة دورة على النحو التالي: ستة تغييرات من الكحول لمدة 8 دقائق لكل منهما، ثلاثة تغييرات من الزيلين لمدة 6 دقائق لكل منهما، ثلاثة جhanges من البارافين، لمدة 25 دقيقة، 9 دقيقة و 8 دقيقة.
  3. تضمينها في البارافين توجيه النسيج في الموضع المطلوب لتوليد 6 ميكرون عرضية أو المقاطع الطولية كما هو موضح في القسم 1. مكان أقسام على الشرائح والسماح الأنسجة التمسك الشريحة على الشريحة مجموعة دفئا في 42 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  4. شرائح خبز، على جنوبهم، بين عشية وضحاها في الفرن على حرارة 56 درجة مئوية. ضع الشرائح في رفوف بلاستيكية. الشرائح دي paraffinize عن طريق الغمر في ثلاثة تغييرات من 100٪ الزيلين، 10 دقيقة لكل تغيير. استخدام 200 مل من الزيلين لغمر تماما الشرائح. ترطيب الشرائح باستخدام متدرج سلسلة ETOH (100٪، 70٪، 50٪ و 30٪، 5 دقيقة لكل خطوة مع الإثارة) لبرنامج تلفزيوني (5 دقائق).
  5. أداء استرجاع مستضد باستخدام 10 ملي العازلة سيترات، ودرجة الحموضة 6. إعداد 100 مل من مزيج عازلة سيترات 18 مل من 0.1 M حمض الستريك أحادي الإماهة و 82 مل من 0.1 M سيترات الصوديوم.
    1. عينات مكان في الجرار coplin بلاستيكية مملوءة حل استرجاع مستضد والميكروويف لمدة 6.5 دقيقة في الطاقة العالية. إضافة ديسحرث الماء إلى جرة coplin للتعويض عن تبخرت-سترات العازلة ويسخن في السلطة 40٪ لمدة 6 دقائق.
    2. ملء coplin جرة إلى أعلى مع الماء، ويسخن مرة أخرى في السلطة 40٪ لمدة 6 دقائق. قد تختلف الأوقات الميكروويف على أساس الميكروويف المستخدمة.
    3. تسمح الشرائح لتبرد لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل غسل الشرائح في الماء المقطر لمدة 1 دقيقة، يليه برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق. بعد برنامج تلفزيوني يغسل، والشرائح كتلة لمدة 2 ساعة في عرقلة الحل تحتوي على TBS (2.425 غرام من قاعدة تريس و8.765 غرام من كلوريد الصوديوم المخفف في 1 لتر من الماء المقطر) 10٪ حمار المصل و 1٪ BSA.
  6. إضافة الأجسام المضادة الأولية مخففة في عرقلة الحل (TBS تحتوي على 10٪ حمار المصل و 1٪ BSA). BrdU (الانقسام علامة)، Nkx2.1 (الجهاز التنفسي ظهارة)، Sox9 (الخلايا التي سوف تؤدي إلى الغضروف) وαSMA (خلايا العضلات الملساء). احتضان الشرائح بين عشية وضحاها، في 4 درجات مئوية. استخدام طريقة تراكب للحفاظ على الأجسام المضادة. تطبيق 180 ميكرولتر من الأجسام المضادة لطوقا ثم نعلق الشرائح كما لو انزلاق الغطاءبينغ.
  7. فصل طوقا بواسطة غمس الشرائح في الماء المقطر. بعد إزالة طوقا، وغسل الأجسام المضادة الأولية غير منضم عن طريق أداء ستة 5 يغسل دقيقة مع TBS تحتوي على 0.1٪ توين-20.
    1. احتضان الشرائح مع الضد الثانوية مخففة في عرقلة الحل في التخفيف من 1: 200، لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. تحديد الأجسام المضادة الثانوية بعناية لمنع غير مرغوب ملزمة فيما بينهم. إزالة الأجسام المضادة الثانوية غير منضم عن طريق إجراء ثلاثة خمسة يغسل دقيقة مع TBS تحتوي على 0.1٪ توين.
    2. غسل الشرائح في 0.1 قاعدة M تريس مرتين لمدة 5 دقائق ثم 0.05 قاعدة M تريس مرتين لمدة 5 دقائق. الشرائح قد يكون غادر في 0.05 قاعدة M تريس بينما coversliping باستخدام وسائل الإعلام المتصاعدة مع أو بدون دابي (1.5 ميكروغرام / مل). متجر الشرائح في مجلد الشرائح في 4 درجات مئوية، وحماية من الضوء من خلال تغطية مجلد بورق الألمنيوم.
  8. تصور تلطيخ وصورة باستخدام مجهر مضان الآلي. عدد المسمى الخلايا ومجموع الخلايا في الحقل صورت في20X 40X ولتحديد نسب الخلايا المتكاثرة إلى مجموع الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

WNT النشاط / β-كاتينين

تم الكشف عن جبل بأكمله لاك-Z تلطيخ في الأنسجة القصبة الهوائية والرئة للأجنة معزولة عن مراسل Axin2 لاك -Z الفئران 11. مواقع تلطيخ تشير WNT النشاط / β-كاتينين. تحليل أجزاء من جبل بأكمله تلطيخ قرر أن WNT النشاط / β-كاتينين كان حاضرا في اللحمة المتوسطة من القصبة الهوائية وفي اللحمة المتوسطة من المناطق الطرفية من الرئتين النامية. في الأجنة WlsShhCre (حيث تم إلغاؤها إفراز بروابط WNT من ظهارة من الجهاز التنفسي) ولاك-Z تلطيخ غائبة تقريبا (الشكل 1).

تكثفات الوسيطة في اللحمة المتوسطة القصبة الهوائية

خطوة حاسمة في الغضروف هي العملية التي من خلالها خلايا اللحمة المتوسطة الطالع لإعطاء صايسي إلى الغضروف تتكثف. وتعرف هذه تجمعات ضيقة من الخلايا كما تكثفات الوسيطة. لاختبار ما إذا كان عدم وجود الغضروف لوحظ في WlsShhCre الفئران يعود إلى غياب تكثفات الوسيطة، أنسجة الرئة القصبة الهوائية من سن الحمل E12.5 إلى E14.5 كانت ملطخة مع السلطة الوطنية الفلسطينية كتين. في E13.5 وE14.5، تم الكشف عن مضان كما العصابات دورية في اللحمة المتوسطة القصبة الهوائية في المواقع التي سيتم تشكيلها الغضروف. عدم وجود مضان كشفها في أنسجة القصبة الهوائية للأجنة WlsShhCre يشير إلى أن الأديم الباطن إشارات Wnt إلى اللحمة المتوسطة القصبة الهوائية ضروري لتكثفات الوسيطة (الشكل 2).

مواصفات خلية الجهاز التنفسي

جبل بأكمله المناعي للأنسجة الرئة القصبة الهوائية تحديد نمط التعبير عن Sox9، Nkx2.1 وαSMA في E11.5. في أنسجة القصبة الهوائية، Sox9 التعبير هو الحدed لاللحمة المتوسطة من القصبة الهوائية كما شريط مستمر (السهم في الشكل 3A و B) بينما في الرئة Sox9 النامية لوحظ في محيط ظهارة التنفسية (رؤساء السهم في الشكل 3A، B و C). Nkx2.1 يقدم نمط التعبير متميزة يقتصر على ظهارة من القصبة الهوائية في الرئة. منع إفراز بروابط WNT من ظهارة يسبب تقلص تعبير عن Sox9 في اللحمة المتوسطة القصبة الهوائية ولكنه لا يؤثر على التعبير Sox9 في ظهارة الرئة الطرفية. لم يتم الكشف عن التعبير عن αSMA بسهولة في اللحمة المتوسطة القصبة الهوائية، تم الكشف عن ولكن تلطيخ على مستوى الحنجرة (السهم الأصفر، الشكل 3) والمعدة (الشكل 3).

تكاثر الخلايا في القصبة الهوائية تطوير

انتشار في الظهارة واللحمة المتوسطةمن القصبة الهوائية والكشف عن بعد في الجسم الحي وسم الأنسجة مع BrdU. كانت ملطخة أقسام الأنسجة القصبة الهوائية مع الأجسام المضادة الاعتراف BrdU، Sox9 وαSMA. الملف الشخصى انتشار في اللحمة المتوسطة القصبة الهوائية يشير إلى أن مستويات Sox9 الخلايا الملون تمر انتشار أعلى من مستوى αSMA الخلايا الملون تمر انتشار الأسلحة النووية. ويبدو أن هذا النمط انتشار إلى أن عادت في القصبات WlsShhCre (الشكل 4).

شكل 1
الشكل 1: WNT النشاط / β-كاتينين غير المنطوق في اللحمة المتوسطة القصبة الهوائية الأنسجة E13.5 القصبة الهوائية في الرئة، معزولة عن Axin2-LacZ وWlsShhCre: الفئران Axin2-LacZ، كانت ملطخة مع X-غال (A و B). تم counterstained أقسام الأنسجة القصبة الهوائية في الرئة مع الأحمر سريع (A، B). لاحظ عدم وجود X-غالتلطيخ في WlsShhCre، Axin2 لاك-Z الفئران مما يدل على عدم وجود WNT النشاط / β-كاتينين (B '). الأنسجة E14.5 من الفئران Axin2 LacZ ملطخة X-غال يصور مواقع الحلقات الغضروفية في المستقبل (C)؛ ومع ذلك، اقتصر النشاط Axin2 إلى المحيط (رأس السهم) من تكثفات الوسيطة (السهم) (D). شريط النطاق A و B و C = 500 ميكرون. B '، D' وD = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
كانت ملطخة التكثيف الوسيطة في تطوير أنسجة القصبة الهوائية E13.5 إإكسبلنتس القصبة الهوائية والرئة مع السلطة الوطنية الفلسطينية كتين: الرقم 2. وكانت السيطرة أنسجة القصبة الهوائية تصور مناطق خلايا اللحمة المتوسطة يظهر مكثف (الأسهم و C). تم الكشف عن أي تكثفات الوسيطة في WlsShhCre الفئران (B والسهم في D). C و D تصوير انخفاض تضخم الأنسجة القصبة الهوائية والرئة هو مبين في ألف وباء. مقياس شريط A و B = 1 مم؛ C و D = 2 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3: نمط التعبير كليا prechondrogenic جبل تم الكشف القصبة الهوائية Nkx2.1 وSox9 تلطيخ في إإكسبلنتس E11.5. لوحة ويصور صورة من الأنسجة السيطرة، في حين يظهر لوحة B قسم البصري للنسيج 20 ميكرون السيطرة. لاحظ عدم وجود التعبير الوسيطة من Sox9 في الأنسجة WlsShhCre (السهم في C)، بور صيانة التعبير الطرفية من Sox9 (رأس السهم في C). تم الكشف عن αSMA تلطيخ عند مستويات منخفضة في trachealmesenchyme من الأنسجة E11.5 لكن لوحظ في منطقة الحنجرة (رأس السهم الأصفر في D و E) والمعدة (S) وتبقى الأنسجة القلبية (CT) (E). وأعرب عن Nkx2.1 في ظهارة تطوير القصبة الهوائية والرئتين (D، E). شريط النطاق = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
كانت ملطخة خلية نمط انتشار في اللحمة المتوسطة prechondrogenic أقسام أجنة E13.5 مع مكافحة BrdU، Sox9 وαSMA الأجسام المضادة: الرقم 4. لوحات C و D هي تكبير أعلى من A وباء على التوالي. تمثل الخطوط المنقطة حدود ظهارة القصبة الهوائية. ملاحظة Sox9 الملون خلية التكاثري (رأس السهم C) وαSMA الملون خلية التكاثري (رأس السهم في D). T = القصبة الهوائية، E = المريء. مقياس شريط A و B = 50 ميكرون، C و D = 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الأحداث الكامنة وراء التشكل من الجهاز التنفسي ليست مفهومة تماما، وخاصة العمليات اللازمة لتنميط الشعب الهوائية إجراء. وقد استخدمت الدراسات السابقة المجراة سابقا تقنيات حيث إإكسبلنتس النامية مثقف في الطور البيني الهواء السائل أو جزءا لا يتجزأ من matrigel 21،22. وقد أظهرت هذه الدراسات كيف تؤثر عوامل النمو والزخرفة من القصبة الهوائية النامية وتشكيل غضروف القصبة الهوائية. وجود قيود على هذه الدراسات هو أن بنية الأنسجة لم يتم المحافظة بشكل صحيح، وبالتالي، فإنها قد لا ألخص تماما عملية في الجسم الحي من الغضروف.

النهج الذي تعهدنا دراسة دور إشارات Wnt في عملية إجراء الهوائية الزخرفة شملت الدراسات المجراة جانب كلها تقنيات تلطيخ جبل، المناعي والتصوير. X-غال تلطيخ من الأنسجة جبل بأكمله تليها حد ذاتها ctioning ومكافحة تلطيخ، ويعرض المزايا على تلطيخ أقسام البارافين. جبل بأكمله تلطيخ يسمح للكشف المباشر من المواقع التي تشهد نشاطا WNT / β-كاتينين هو المنطوق. وعلاوة على ذلك، باجتزاء من إإكسبلنتس الملون تحديد مواقع دقيقة في اللحمة المتوسطة حيث كانت تقع النشاط مع تقدم التنمية. وهذا الأخير هو قراءات أفضل ودقة من الكشف عن التعبير عن انزيم β غالاكتوزيداز في أقسام البارافين. في حين يمكن أن يتم الكشف عن النشاط الأنزيمي في الفروع، وهذا الإجراء يتطلب cryosections أنه لن يكون من السهل دائما لتوليد وقد لا الحفاظ على بنية عينات صغيرة. وجود قيود في بروتوكول وصفها في هذه الورقة، هو أن تجهيز العينات لتضمين البارافين بعد جبل بأكمله تلطيخ يؤدي إلى فقدان الإشارة. لذلك، تحتاج عينات البقاء لمدة أطول في حل X-غال ويجب أن تستخدم دورة أقصر لتضمين البارافين للحصول على إشارة جيدة على الأبواب.

"jove_content"> تجهيز الأنسجة صغيرة لتضمين البارافين سيؤدي إلى الحد من حجم الأنسجة. هذا هو نتيجة غير مرغوب فيها أثناء العمل مع تخفيض كمية الأنسجة. لذلك، قمنا بتطوير دورة معالجة القصيرة التي تسمح في نفس الوقت للحفاظ الكافي للهيكل دون أن تسبب انخفاضا في حجم الأنسجة.

من ناحية أخرى، جبل بأكمله إجراء المناعي، بعد تعديل هذه التقنية التي وصفها Ahnfelt-رون 23، يسمح لتصور ثلاثي الأبعاد لتطوير القصبة الهوائية والأنسجة الرئوية، مع وجود نمط التعبير محددة من البروتينات المشفرة بواسطة عوامل النسخ رئيسية مثل Nkx2.1 و Sox9. عندما المرجوة، يمكن أن تعرض جبل تلطيخ كله كما مداخن بمساعدة متحد البؤر Z من الصور، والتي تصور أعماق مختلفة من الأنسجة القصبة الهوائية في الرئة. بينما التصوير إإكسبلنتس صغيرة، يجب أن يتم تنفيذ المقاصة من الأنسجة في لوحة المرحلة. استخدمنا معدني سميكمصنوعة خصيصا لوحات المسرح مع أسفل البصرية حيث يتم مسح العينات وتصويرها. هذا يمنع فقدان المواد أثناء نقل الأنسجة صغيرة بعد إزالة خطوة. بينما جبل بأكمله المناعي هو تقنية مناسبة لتلطيخ من الأنسجة الصغيرة، ونحن نعترف القيود المفروضة على هذه التقنية. على وجه الخصوص، لاحظنا أداء متباينة من الأجسام المضادة التي تعترف المستضدات أفضل في أقسام بدلا من جبل بأكمله. قد تمنع هذه المسألة أداء هذه التقنية إذا لم الأجسام المضادة البديلة المتاحة. ومن الممكن أيضا أن استخدام الميثانول والمقاصة مع موراي واضح قد يكون لها أثر سلبي في إشارة لوحظ. في المستقبل، ونحن اختبار حلول المقاصة الأخرى غير العضوية وتعديل البروتوكول بشكل صحيح لهذا الغرض 24. وهناك اعتبار الأخير هو أن جبل بأكمله سوف تسمح هذه الدراسة من عدد قليل من البروتينات وأعرب في الأنسجة في وقت واحد معين.

وقد أظهرت التقارير السابقة للفائدةالسلطة الوطنية الفلسطينية كتين تلطيخ للكشف عن تكثفات الوسيطة في أجزاء من أنسجة القصبة الهوائية 21،25. في هذه الدراسة، ونحن التقرير منهجية التي تم تنفيذ تلطيخ في جبل بأكمله، مما يسهل تصور أفضل للمناطق القصبة الهوائية حيث سيتم تشكيل الغضروف. أثناء أداء كتين الرعاية تلطيخ ينبغي أن توضع في استخدام التركيز المناسب من كتين إلى عدم الإفراط وصمة عار، كما يقترن المتاحة تجاريا السلطة الوطنية الفلسطينية-كتين لGFP. لصناعة السيارات في مضان من الأنسجة قد تحجب النتائج مما يجعل من الصعب التمييز العصابات الموافق المزنشيمية تكثفات.

وأخيرا، في الجسم الحي وسم الأنسجة مع BrdU تليها باجتزاء وتلطيخ المناعي هو أسلوب الممكنة لتحديد تكاثر الخلايا التي تقدم مزايا أكثر من تلطيخ نموذجي وثابت مثل PPH3 أو بكنا 26،27. تقدم هذه التقنية الأخيرة القيود، وتلطيخ سوف تختلف تبعا لمرحلة دورة الخلية. يتم القضاء على هذه المشكلة عن طريق تقنية موضح لدينا. الجمع في الجسم الحي العلامات تليها التضمين، باجتزاء والمناعي سمح لنا لتحديد أن الظهارية WNT بروابط التوازن انتشار التفاضلية من Sox9 وα-SMA معربا عن الخلايا التي من شأنها أن تؤدي إلى غضروف القصبة الهوائية والعضلات 7.

وباختصار، نهج متعددة تقنية لدراسة الزخرفة الجهاز التنفسي وضع يسمح لتحليل عميق لدور إشارات Wnt في إجراء الهوائية التشكل. حددت هذه الدراسات مواقع دقيقة من WNT / β-كاتينين في أنسجة القصبة الهوائية، وكذلك إشارات الاستقرائي ومفيدة تقدمها ظهارة القصبة الهوائية ما هو مطلوب للمواصفات، التفاضلية انتشار الأنساب خلية القصبة الهوائية اللحمة المتوسطة، فضلا عن تكوين الغضاريف. وتشمل الاتجاهات المستقبلية لتعظيم الاستفادة من جبل تلطيخ كله لولس التي تم تحديدها مؤخراالجينات المستهدفة، فضلا عن أداء كله المناعي جبل في تركيبة مع تلطيخ كتين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

"الكتاب ليس لديهم ما يكشف."

Acknowledgments

ونحن نعترف مساعدة مايك Muntifering ومات Kofron مع التصوير متحد البؤر وغيل ماكي مع إجراءات النسيجية. وأيد هذا العمل جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة، NHLBI (K01HL115447 إلى DS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti Sox9 ab. Millipore AB5535 1:400 , rabbit
Anti Sox9 ab. Santa Cruz Sc-20095 1:50, rabbit
Anti Smooth Muscle Actin ab. Sigma A5228 1:2k, mouse
Anti NKX2.1 ab. Seven Hills n/a 1:100, guinea pig
Anti NKX2.1 ab. Seven Hills n/a 1:400, mouse
Anti Brdu ab. Abcam AB1893 1:200, sheep
Anti Brdu ab. Santa Cruz Sc-32323 1:4k, mouse
PNA Lectin Sigma L 7381
Secondary antibodies Life technologies Alexa fluor Molecular probes
K3Fe(CN)6 Sigma P8131
K4Fe(CN)6 Sigma-Aldrich P3289
MgCl2 Sigma-Aldrich M9272
NaDOC Life Technologies 89905
NP4O Life Technologies 85124
Alcian Blue 8GX Sigma A-3157
Fisher brand super-frost plus Fisher 12-550-15
PFA (16%) EMS 15710
PBS Gibco 70011-044
Fetal Calf Serum Sigma 11K413
Blocking reagent Invitrogen Component of TSA kit #2    ( T20932)
BrDu Sigma B5002-5g
Vectashield mounting medium Vector labs H-1000
Permount Fisher SP15-500
Tissue-loc cassettes Histoscreen Fisher C-0250-GR
Biopsy cassettes Premiere BC0109 Available in different colors
Nuclear fast red  Kernechtrot 0.1% Sigma N3020
Citric acid Sigma C1909-500G
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma S4641-1Kg
Trizma hydrochloride Sigma T5941-500G
Xylene Pharmco-AAPER 399000000
Ethanol Pharmco-AAPER 111000200
Micro knives FST 10318-14
Dumont #5 ceramic coated FST 11252-50
Dumont #5CO FST 11295-20
Dumont # 5 FST 91150-20
Thermo/Shandon Excelsior ES Thermo Fisher
Microtome Leica RM2135
Nikon i90 Nikon Wide field microscope
NikonA1Rsi Nikon Confocal microscopy. Settings:NikonA1 plus camera, scanner: Galvano, detector:DU4. Optics Plan Apo lambda 10X. Modality: Widefield fluorescence laser confocal. 
Leica MS 16 FA Leica Fluorescence Dissecting microscope
Zeiss Zeiss Automated fluorescence microscope
Leica Application suite Leica Leica imaging software
NIS Nikon Nikon imaging software
IMARIS Bitplane Imaging processing software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maeda, Y., Dave, V., Whitsett, J. A. Transcriptional control of lung morphogenesis. Physiol Rev. 87, 219-244 (2007).
  2. Morrisey, E. E., Hogan, B. L. Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development. Dev Cell. 18, 8-23 (2010).
  3. Fausett, S. R., Klingensmith, J. Compartmentalization of the foregut tube: developmental origins of the trachea and esophagus. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, 184-202 (2012).
  4. Goss, A. M., et al. Wnt2/2b and beta-catenin signaling are necessary and sufficient to specify lung progenitors in the foregut. Dev Cell. 17, 290-298 (2009).
  5. Harris-Johnson, K. S., Domyan, E. T., Vezina, C. M., Sun, X. beta-Catenin promotes respiratory progenitor identity in mouse foregut. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 16287-16292 (2009).
  6. Cornett, B., et al. Wntless is required for peripheral lung differentiation and pulmonary vascular development. Dev Biol. 379, 38-52 (2013).
  7. Snowball, J., Ambalavanan, M., Whitsett, J., Sinner, D. 34;Endodermal Wnt signaling is required for tracheal cartilage formation". Dev Biol. , (2015).
  8. Shannon, J. M., Hyatt, B. A. Epithelial-mesenchymal interactions in the developing lung. Annu Rev Physiol. 66, 625-645 (2004).
  9. Shannon, J. M., Nielsen, L. D., Gebb, S. A., Randell, S. H. Mesenchyme specifies epithelial differentiation in reciprocal recombinants of embryonic lung and trachea. Dev Dyn. 212, 482-494 (1998).
  10. Li, C., et al. Wnt5a regulates Shh and Fgf10 signaling during lung development. Dev Biol. 287, 86-97 (2005).
  11. Loscertales, M., Mikels, A. J., Hu, J. K., Donahoe, P. K., Roberts, D. J. Chick pulmonary Wnt5a directs airway and vascular tubulogenesis. Development. 135, 1365-1376 (2008).
  12. Yin, Y., et al. An FGF-WNT gene regulatory network controls lung mesenchyme development. Dev Biol. 319, 426-436 (2008).
  13. Shu, W., et al. Wnt/beta-catenin signaling acts upstream of N-myc, BMP4, and FGF signaling to regulate proximal-distal patterning in the lung. Dev Biol. 283, 226-239 (2005).
  14. Bretholz, A., Morrisey, R., Hoffman, R. S. The use of OpdA in rat models of organic phosphorus (OP) poisoning. Toxicology. 257, (2009).
  15. Goss, A. M., et al. Wnt2 signaling is necessary and sufficient to activate the airway smooth muscle program in the lung by regulating myocardin/Mrtf-B and Fgf10 expression. Dev Biol. 356, 541-552 (2011).
  16. Mucenski, M. L., et al. beta-Catenin is required for specification of proximal/distal cell fate during lung morphogenesis. J Biol Chem. 278, 40231-40238 (2003).
  17. Hyatt, B. A., Shangguan, X., Shannon, J. M. FGF-10 induces SP-C and Bmp4 and regulates proximal-distal patterning in embryonic tracheal epithelium. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L1116-L1126 (2004).
  18. Del Moral, P. M., et al. VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis. Dev Biol. 290, 177-188 (2006).
  19. Ott, S. R. Confocal microscopy in large insect brains: zinc-formaldehyde fixation improves synapsin immunostaining and preservation of morphology in whole-mounts. J Neurosci Methods. 172, 220-230 (2008).
  20. Jahrling, N., Becker, K., Dodt, H. U. 3D-reconstruction of blood vessels by ultramicroscopy. Organogenesis. 5, 145-148 (2009).
  21. Park, J., et al. Regulation of Sox9 by Sonic Hedgehog (Shh) is essential for patterning and formation of tracheal cartilage. Dev Dyn. 239, 514-526 (2010).
  22. Elluru, R. G., Thompson, F., Reece, A. Fibroblast growth factor 18 gives growth and directional cues to airway cartilage. Laryngoscope. 119, 1153-1165 (2009).
  23. Ahnfelt-Ronne, J., et al. An improved method for three-dimensional reconstruction of protein expression patterns in intact mouse and chicken embryos and organs. J Histochem Cytochem. 55, 925-930 (2007).
  24. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
  25. Gillotte, D. M., Fox, P. L., Mjaatvedt, C. H., Hoffman, S., Capehart, A. A. An in vitro method for analysis of chondrogenesis in limb mesenchyme from individual transgenic (hdf) embryos. Methods Cell Sci. 25, 97-104 (2003).
  26. Cohen, E. D., et al. Wnt signaling regulates smooth muscle precursor development in the mouse lung via a tenascin C/PDGFR pathway. J Clin Invest. 119, 2538-2549 (2009).
  27. Boucherat, O., et al. Partial functional redundancy between Hoxa5 and Hoxb5 paralog genes during lung morphogenesis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 304, L817-L830 (2013).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 116، WNT والقصبة الهوائية والرئة والغضاريف والعضلات، والسلطة الوطنية الفلسطينية كتين، المناعي
دراسة إشارات Wnt خلال الزخرفة من إجراء الخطوط الجوية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Snowball, J., Ambalavanan, M.,… More

Snowball, J., Ambalavanan, M., Sinner, D. Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways. J. Vis. Exp. (116), e53910, doi:10.3791/53910 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter