Summary
Användningen av reporter möss kopplade till hela berget och avsnitt färgning, mikroskopi och in vivo underlättar analys av mekanismerna bakom den normala mönstring av luftvägarna. Här beskriver vi hur dessa tekniker har bidragit till analysen av Wnt-signalering under trakeal utveckling.
Introduction
Luftvägarna utveckling initieras av embryonala dag 9 (E9) med utseendet på Nkx2.1 positiva celler i den ventrala endodermalt foregut 1,2. Esofagus-trakealtub separation kommer att lösa genom E11.5 när rören kan urskiljas som separata enheter, alla omgivna av mesenkymala vävnaden tre. Wnt-signalering spelar en nyckelroll i specificeringen av luftvägarna som radering av Wnt2 och Wnt2b, uttrycks genom splanchnicus mesenkym och radering av β-catenin från endodermalt respiratoriska epitelet resulterar i lung agenesi 4,5. Våra tidigare studier fastställt att strykningen av WLS, en last receptor som medierar sekretion av alla Wnt-ligander, från endodermala andningsvägarna leder till lung hypoplasi, defekter i pulmonell vaskulär utveckling och mis-mönstring av luftrör mesenkym 6,7. Dessa data stöder betydelsen av epitel-mesenkymala cross prata i celldifferentiering och specifikation, eftersom det har också visats i andra studier 8,9.
Studien av de tidigaste stadierna av lungutveckling bygger på genetisk in vitro och ex vivo-tekniker som har gjort det möjligt för oss att bättre förstå mekanismer som driver andnings identitet 10-16. Hela lung Explantation kulturer vid luftvätskeinter har i stor utsträckning använts för att studera effekterna av tillväxtfaktorer i tidiga skeden av lung förgrening morfogenes 10,17,18. Även om denna metod används som avläsning av morfologiska förändringar, såsom förgrening morfogenes och genuttryck modulering, är den begränsad till studiet av tidiga stadier av utvecklingsprocessen, eftersom kulturen själv inte stödja utvecklingen av kärlsystemet 17. Utveckling av luftrör brosk kräver längre inkubationstider som kan vara inte är kompatibla med denna odlingsteknik.
att analyze roll Wnt-signalering under luftvägarna bildningen, har vi anpassat standardtekniker för att möta behoven hos våra embryonala studier. Vi har ändrat volymer, färgningstider, bearbetning cykling för paraffininbäddning och tidpunkten för clearing av luftrör-lungvävnad. Huvudsyftet med att optimera de metoder som beskrivs i denna studie var att analysera de tidigaste stadierna av trakeal utveckling hos möss som sker från E11 till E14.5. Använda reporter möss linje Axin2LacZ vi exakt bestämda platser i Wnt / β-catenin aktivitet i utvecklings luftrör mesenkym. Vi har också anpassat lektin färgningsprocedur för hela berget trakeal vävnad. Därför kunde vi visualisera mesenkymala förtätningar och förutsäga platser där kondrogenes kommer att äga rum. Färgning av hela berget och delar av embryonal vävnad som erhållits från WlsShhCre möss, tillsammans med avancerad mikroskopi tekniker tillät oss att avslöja den roll som Wnt-ligander som produceras av traCHEAL epitel i luftstrupen mönstring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djuren inhystes i patogenfria betingelser. Möss hanteras enligt protokoll som godkänts av CCHMC Institutional Animal Care och användning kommittén (Cincinnati, OH USA). Möss som användes genomgående i dessa studier hölls i en blandad bakgrund.
1. Hela Mount X-galaktosidas Färgning
- Avliva gravid kvinna vid E11.5 till E14.5, av CO 2 inandning. Placera djur i CO 2 kammare, ladda kammaren med CO2. Behåll djur i kammaren för minst 5 minuter. Utför sekundär metod för dödshjälp genom halsdislokation.
- Ren buken med etanol (EtOH) 70% och utför laparotomi med en enda abdominal mittlinjeincision. Utnyttja kirurgisk sax och standardmönster (rak Serrate) pincett.
- Isolera livmoderhornen använder pincett och fina saxar och omedelbart placera vävnaden i petriskål med kyld PBS-lösning. Hålla vävnader på is tills fortsätterisolering av embryon.
- Isolera embryon från livmoderhornen. Dissekera embryonala luftrör lungvävnad med hjälp av dissekera mikroskop. Utnyttja fin spets pincett och sax för att hålla och punktera livmodervävnad och concepti släppa embryona.
- Avlägsna kvarvarande embryonala membran. Med hjälp av nål knivar skär huvudet av embryon och lägre kroppsdel under diafragman. Leta lever som ett landmärke.
- Efter isolering av bröstregionen av embryot, fortsätt att avlägsna laterala sidorna hos kroppsväggen, ryggrad och hjärt med användning av nål bladen. Var försiktig när du tar bort hjärtat att undvika att skada trakeal vävnad. Slutligen, omsorgsfullt, separera matstrupen från luftstrupen genom att dra i matstrupen med hjälp av nål bladen. Hålla vävnader i PBS-lösning på is.
- Placera vävnad i 4 ml skruvlock flaskor med glas- eller överföringspipetter. Fix trakeal lungvävnad i 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS under 30 min. Efter fixering,skölj vävnaden med PBS. Under sköljningen, förbereda X-gal-färgningslösning (lägg 5 mM K3Fe (CN) 6, (100 | j, l 0,5 M stock) 5 mM K4Fe (CN) 6 (100 | j, l 0,5 M stock) 2 mM MgCl2, ( 20 | il 1 M stock) 0,01% NaDOC (50 | j, l 2% stock), 0,02% NP 4 O (100 | j, l 2% stock), 1 mg / ml X-gal (500 fil av 20 mg / ml lager) och 9,13 ml destillerat vatten för att bringa till en slutlig volym av 10 ml).
- Ta bort eventuella kvarvarande PBS och tillsätt 2 ml X-gal-färgning lösning på glasflaskan. Placera flaskorna i facket på shaker. Stain vävnader en till två timmar i X-gal-färgning lösning. Inkubera vävnaden i X-gal-lösning under 4 h för vidare bearbetning och inbäddning.
- Stoppa reaktionen genom att tvätta vävnader i 3% dimetylsulfoxid-PBS. Skölj i PBS, 3 gånger under 5 minuter varje tvätt och lagra i 70% etanol.
- Fyll petriskålar med en 1% -ig / PBS-lösning. Låt agarosen stelna. Använda glasöverföringspipetter, placera vävnad på agaros copade plattor fyllda med PBS-lösning. Fotografera hela monteringar med användning av ett dissektionsmikroskop. Välj lämpligt filter för bright.
- För att bättre skilja områden av X-gal-färgning processprover för paraffininbäddning och snittning. Placera proverna i fina skärmen kassetter.
- Att bearbeta prover för paraffininbäddning använda en automatiserad processor och inrätta en kort cykel enligt följande: sex byten av alkohol: 5 min första förändring och 3 minuter per varje återstående förändring. Tre byten av xylen: 5 min första förändring och 3 min nästa två förändringar. De föregående stegen utförs vid 30 ° C. Slutligen utför tre byten av paraffin vid 62 ° C: 25 min, 8 min och 5 min.
- Orient prover för att bädda med vävnad liggande på botten av bädda båt. Tillsätt försiktigt paraffin för att fylla inbäddning båten. Kyl omedelbart på kall platta bädda station tills paraffin stelnar. Ta kvarter från inbäddning båt. Med hjälp av en mikrotom, generera 6 pm sections. Mount avsnitt om förbehandlade-diabilder och torra glider på bild varmare inställd på 42 ° C under 1 timme.
- Baka glider över natten i en ugn vid 56 ° C. Placera objektglasen i ställningar. Avparaffinera glider med tre byten av 100% xylen, 10 min vardera. Använda färgning rätter fyllda med 200 ml xylen.
- Rehydrera diabilder som använder graderade EtOH serien (100%, 70%, 50% och 30%, en minut per steg) till PBS innan motfärgning med Nuclear Fast Red för 10 till 30 sekunder. Skölj objektglasen med kranvatten tre gånger i 5 minuter varje gång för att avlägsna överskott av Nuclear Fast Red.
- Torka objektglasen i en graderad EtOH serie (50%, 70% och 100% EtOH) före tvätt i tre byten av xylen (20 dips varje förändring) och lock halka med Xylen baserat monterings media.
2. Lektin Färgning
- Dissekera E13.5 och E14.5 luftrör lungvävnad som beskrivs i steg 1,1 till 1,4. Använda glasöverföringspipetter plats vävnad i skruvlock flaskor. Fix trakeal lungvävnad med 2 ml2% PFA lösning över natten vid 4 ° C. Efter fixering, skölj prov i PBS tre gånger under 10 min varje tvätt.
- Förbereda blockerande buffert, vanligtvis en slutlig volym av 10 ml av lösning. Lägg 0,1 g BSA (1%) till 8 ml PBS. Tillåt BSA för att lösa upp. Tillsätt 0,2 ml av getserum (2%) 0,03 ml av Triton X-100 (0,3%). Bringa den slutliga volymen till 10 ml med PBS. Blockera prover för 1 h i 0,5 ml av blockerande buffert vid rumstemperatur.
- Ta bort blockerande buffert med hjälp av en pipett och ersätta med lektin lösning bestående av 50 mikrogram / l av lektin, 10% getserum och PBS. Använd 250 pl lektin lösning per prov. Inkubera över natten vid 4 ° C. Se till att täcka glasflaska som innehåller vävnad med aluminiumfolie. Efter inkubation med lektin lösningen, skölj prov i PBS tre gånger under 10 min.
- Placera explantat i agarosbelagda petriskålar innehållande tillräckligt PBS för att täcka prover. Fotografera hela monteringar med användning av en fluorescens dissekera mikroskop. Välj appropriate filter för att detektera fluorescens. Lektin PNA brukar kopplas till GFP.
3. Hela Mount immunofluorescensfärgning och konfokalmikroskopi
- Isolera trakeal lungvävnad, överföra till 4 ml glasskruvlock flaskor och fixa över natten i 4% PFA. E11.5 vävnad kan fixeras i 2% PFA. Store i metanol 100%. Prover kan förvaras upp till flera månader vid -20 ° C.
- Avlägsnande av metanol med användning överföringspipett och permeabilize prover med hjälp av Dent s Bleach (4 delar metanol, 1 del DMSO och 1 del 30% H2O 2) under 2 h. Hydrat vävnad i en graderad serie av metanol utspädd i PBS på följande sätt: 100% metanol, 75% metanol, 50% metanol, 25% metanol, 100% PBS. Inkubera 10 minuter vid rumstemperatur under varje steg av hydrering.
- Blocket vävnad i 0,5% blockeringsreagens utspäddes i PBS (se Material för detaljer) under två timmar vid rumstemperatur med omrörning.
- Späd primär antikropp i blockerandelösning (Sox9 1: 100, Nkx2.1 1: 200, αSMA 1: 250) och inkubera proverna över natten vid 4 ° C. Tvätta prov med PBS fem gånger vid rumstemperatur. Utför varje tvätt för en timme.
- Tillämpa sekundär antikropp vid en 1: 500 utspädning i 0,5% blockeringslösningen. Välj noga sekundära antikroppar för att förhindra bindning bland sekundära antikroppar. Inkubera över natten vid 4 ° C i ett mörkt rum. Tvätta prover tre gånger under 20 min vid rumstemperatur. Dehydratisera prover i en graderad serie av metanol utspätt i PBS enligt följande: 25% metanol, 50% metanol 75% metanol, 100% metanol, 10 min varje steg.
OBS: Se till att proverna förblir täckt med aluminiumfolie och minimera exponeringen för ljus. Vävnaden kan nu lagras vid 4 ° C i flera veckor tills fotograferas. - Överför proverna till skräddarsydda scen plattor, avlägsnande av metanol och tydlig med cirka 200 pl Murrays klar lösning 19,20 (2 delar bensylbensoat, en del bensylalkohol) omedelbart BEFmalm avbildning. Fotografi med ett konfokalmikroskop. Bearbeta och analysera bilden med bildbehandlingsprogram.
4. Cell Proliferation
- Injicera E11.5 dräktiga möss intra-peritonealt med en lösning av BrdU i en koncentration av 100 | j, g BrdU / g kroppsvikt. Offra hona som beskrivs i avsnitt 1 i protokollet och isolera embryon vid E12.5 eller E13.5. Med användning av knivblad, punkt huvuden och nedre delen av kroppen nedanför brösthålan.
- Placera bröstkorg vävnad i 4 ml med skruvlock ampuller och fixera i 1 ml 4% PFA över natten. Tvätta prov med PBS två gånger under 5 min och dehydrera prover genom en etanolserie utspädd i destillerat vatten upp till 70% etanol enligt följande: 30%, 50% och 70% etanol, under 5 min varje steg.
- Placera proverna i medelstora skärmen kassetter. Process vävnad för paraffininbäddning använder och automatiserad processor. Inrätta en cykel enligt följande: sex byten av alkohol för 8 min vardera, tre byten av xylen under 6 min vardera, tre cHanges av paraffin, för 25 minuter, 9 min och 8 min.
- Bädda in i paraffin orientera vävnaden i önskad position för att generera 6 um tvärgående eller längsgående sektioner som beskrivs i avsnitt 1. Placera sektioner på objektglas och låta vävnad att följa glida på bild varmare inställd på 42 ° C under en timme.
- Baka diabilder, på deras sidor, över natten i ugn vid 56 ° C. Placera objektglasen i plast byglar. De-paraffinize glider genom nedsänkning i tre byten av 100% xylen, 10 min per förändring. Använd 200 ml xylen helt dränka diabilder. Rehydrera bilder med hjälp graderade EtOH serien (100%, 70%, 50% och 30%, 5 min per steg med omröring) till PBS (5 min).
- Utföra antigenåtervinning med användning av 10 mM citratbuffert, pH 6. För att bereda 100 ml av citratbuffert mix 18 ml 0,1 M citronsyra monohydratiserat och 82 ml 0,1 M natriumcitrat.
- Placera proverna i plast Coplin burkar fyllda med antigenåtervinning lösning och mikrovågsugn för 6,5 minuter vid hög effekt. Lägg distilled vatten till coplinkärlet för att kompensera för indunstas-citratbuffert och återuppvärmning vid 40% effekt under 6 min.
- Fyll coplinkärlet till toppen med vatten och värma igen vid 40% effekt under 6 min. Mikrovågsugn gånger kan variera beroende på mikrovågsugn används.
- Låt objektglasen svalna i 20 min vid rumstemperatur före tvättning glider i destillerat vatten under 1 min, följt av PBS under 5 min. Efter PBS-tvättar, blockera objektglasen i 2 h i blockerande lösning innehållande TBS (2,425 g Tris-bas och 8,765 g NaCl utspädd i 1 L destillerat vatten) 10% Donkey serum och 1% BSA.
- Lägg till primära antikroppar utspädda i blockerande lösningen (TBS innehållande 10% Donkey serum och 1% BSA). BrdU (mitos markör), Nkx2.1 (andningsvägarna epitel), Sox9 (celler som ger upphov till brosk) och αSMA (glatta muskelceller). Inkubera objektglasen över natt, vid 4 ° C. Använda överlagringsmetod för att spara på antikroppar. Applicera 180 pl antikropp mot en packning och sedan bifoga bilden som om täckglasping.
- Lösgöra packningen genom att doppa glasen i destillerat vatten. Efter avlägsnande av packningen, tvätta obundna primära antikroppen genom att utföra sex 5 minuterstvättar med TBS innehållande 0,1% Tween-20.
- Inkubera objektglasen med sekundär antikropp utspädd i blockeringslösning vid en utspädning av 1: 200, under 1 timme vid rumstemperatur. Välj sekundära antikroppar noggrant för att förhindra oönskad bindning bland dem. Avlägsna obunden sekundär antikropp genom att utföra tre fem minuters tvättar med TBS innehållande 0,1% Tween.
- Tvätta objektglasen i 0,1 M Tris-bas två gånger under 5 min och därefter 0,05 M Tris-bas två gånger under 5 min. Diabilder kan lämnas kvar i 0,05 M Tris-bas, medan coversliping hjälp av monteringsmedier med eller utan DAPI (1,5 | j, g / ml). Förvara bilder i glid mapp vid 4 ° C och skyddas från ljus genom att täcka mapp med aluminiumfolie.
- Visualisera färgning och fotografiet med hjälp av en automatiserad fluorescensmikroskop. Räkna märkta-celler och totala celler per fält som fotograferas på20X och 40X för att bestämma förhållandet mellan prolifererande celler till totala celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wnt / β-catenin aktivitet
Hela Mount Lac-Z-färgning detekterades i luftrör-lungvävnad av embryon isolerade från reportern Axin2 Lac Z-möss 11. Platser av färgning indikerar Wnt / β-catenin aktivitet. Analys av delar av hela montera färgning fastställt att Wnt / β-catenin aktiviteten var närvarande i mesenkym av luftstrupen och i mesenkym av perifera regioner i utvecklings lungor. I WlsShhCre embryon (vari utsöndring av Wnt-ligander från epitel luftvägarna upphävdes) Lac-Z-färgning var nästan frånvarande (Figur 1).
Mesenkymala kondensationer i trakeal mesenkym
Ett kritiskt steg i kondrogenes är den process genom vilken mesenkymala celler ödesbestämd att ge rISE till brosk kondens. Dessa snäva ansamlingar av celler kallas mesenkymala förtätningar. För att testa om bristen på brosk observerats i WlsShhCre möss berodde på en avsaknad av mesenkymala förtätningar, trakeala lungvävnader från graviditets åldrar E12.5 till E14.5 färgades med PNA lektin. Vid E13.5 och E14.5 ades fluorescens detekteras som periodiska band i trakeal mesenkymet på platser där brosk kommer att bildas. Brist på detekterbar fluorescens i trakeal vävnad hos WlsShhCre embryon indikerar att endodermalt Wnt-signalering till den trakeala mesenkymet är nödvändig för mesenkymala kondensationer (Figur 2).
Luftvägs cell specifikation
Hela Mount immunofluorescens av luftrör lungvävnad bestämdes uttrycksmönstret av Sox9, Nkx2.1 och αSMA vid E11.5. I luftrör vävnad, är Sox9 uttryck gränsed till mesenkymet av luftstrupen som en kontinuerlig remsa (pilen i figur 3A och B) medan i utveckla lung- Sox9 observeras vid periferin av det respiratoriska epitelet (pilspetsar i figur 3A, B och C). Nkx2.1 presenterar en distinkt uttrycksmönster begränsas till epitelet i luftstrupen av lungan. Förhindra utsöndring av Wnt-ligander från epitel orsakar minskad expression av Sox9 i luftrör mesenkym men påverkar inte Sox9 uttryck i perifera lung epitel. Expression av αSMA inte lätt detekteras i luftrör mesenkym, var dock färgning detekterades på samma nivå som struphuvudet (gul pil, Figur 3) och magen (Figur 3).
Cellproliferation i att utveckla luftstrupen
Spridning i epitel och mesenkymav luftstrupe detekterades efter in vivo märkning av vävnad med BrdU. Delar av trakeal vävnad färgades med antikroppar som känner igen BrdU, Sox9 och αSMA. Proliferationen profil i trakeal mesenkymet indikerar att nivåerna av Sox9 färgade celler undergår proliferation är högre än nivån på αSMA färgade celler som genomgår proliferation. Denna spridning mönster verkar vara åter i WlsShhCre tracheas (Figur 4).
Figur 1: Wnt / β-catenin-aktivitet är operativ i trakeal mesenkym E13.5 trakeal lungvävnad, isolerad från Axin2-LacZ och WlsShhCre:. Axin2-LacZ-möss, färgades med X-gal (A och B). Sektioner av trakeal lungvävnad motfärgades med fast red (A ', B'). Notera avsaknaden av X-galfärgning i WlsShhCre; Axin2-Lac-Z-möss som visar frånvaro av Wnt / β-catenin aktivitet (B '). E14.5 vävnad från Axin2 LacZ möss färgade med X-gal visar platser av framtida broskringar (C); var dock Axin2 aktivitet begränsad till periferin (pilhuvud) av de mesenkymala kondensationer (pil) (D). Skalstock A, B och C = 500 pm; B, D 'och D = 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Mesenkymala kondens i att utveckla luftrör vävnads E13.5 luftrör-lung explantat färgades med PNA lektin. Kontroll luftrör vävnad som visar regionerna var mesenkymala celler kondense visas (pilarna A C). Inga mesenkymala förtätningar upptäcktes i WlsShhCre möss (B och pil i D). C och D skildrar lägre förstoring av luftrör-lungvävnad visas i A och B. Skalstock A och B = 1 mm; C och D = 2 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Expression mönster i prechondrogenic hela montera luftstrupen Nkx2.1 och Sox9 färgning detekterades i E11.5 explants.. Panel A visar en bild av ett kontrollvävnad, medan panel B visar en optisk sektion av en 20 | j, m kontrollvävnad. Notera avsaknaden av mesenkymala uttryck av Sox9 i WlsShhCre vävnad (pil i C), but underhåll av perifer uttryck av Sox9 (pilspets i C). αSMA färgning detekterades vid låga nivåer i trachealmesenchyme av E11.5 vävnaden, men observerades i struphuvud-regionen (gul pilspets i D och E), mage (S) och återstående hjärtvävnad (CT) (E). Nkx2.1 uttrycks i epitel av att utveckla luftstrupe och lungor (D, E). Skala bar = 10 mikrometer. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. Celltillväxten mönster i prechondrogenic mesenkym Delar av E13.5 embryon färgades med anti BrdU, Sox9 och αSMA antikropp. Paneler C och D är större förstoringar av A B respektive. Streckade linjerna representerar gränserna för det trakeala epitelet. Obs Sox9 färgade proliferativ cell (pilspets C) och αSMA färgade proliferativ cell (pilspets i D). T = luftstrupe, E = matstrupen. Skala bar A och B = 50 um, C och D = 20 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Händelser ligger till grund för morfogenes av luftvägarna är inte klarlagd, speciellt de processer som krävs för mönstring av de ledande luftvägarna. Tidigare studier har använt ex vivo-tekniker, där utvecklings explantat odlas vid luft-vätskeinter eller inbäddade i matrigel 21,22. Dessa studier har visat hur tillväxtfaktorer påverkar mönstringen av framkallnings trakea och bildandet av trakeal brosk. En begränsning till dessa studier är att arkitekturen i vävnaden inte är väl underhållna och därför kan de inte riktigt sammanfatta processen för kondrogenes in vivo.
Den strategi som vi åtog sig att studera betydelsen av Wnt signalering i färd med att genomföra luftvägarna mönstringen ingår in vivo-studier i kombination med hela berget färgningsteknik, immunofluorescens och bildbehandling. X-gal-färgning av hela montera vävnad följt av sigctioning och kontra färgning, presenterar fördelar över färgning av paraffinsektioner. Hela Mount färgning möjliggör direkt detektion av platser där Wnt / β-catenin aktivitet är operativ. Dessutom sektionering av de färgade explantaten bestäms exakta platser i mesenkym varvid aktiviteten lokaliserades som utvecklingen fortskred. Det senare är ett bättre och korrekt avläsning än detektion av uttryck av β-galaktosidas enzym i paraffinsektioner. Medan enzymatisk aktivitet kunde detekteras i sektioner, kommer detta förfarande kräver kryosnitt som inte alltid är lätt att generera och kan inte bevara arkitekturen i små prover. En begränsning i det protokoll som beskrivs i detta dokument, är att behandlingen av prover för paraffininbäddning efter hela montera färgning kommer att orsaka en förlust av signalen. Därför prover behöver stanna kvar längre i X-gal-lösning och en kortare cykel för paraffininbäddning bör användas för att erhålla god signal på sektioner.
Å andra sidan, hela montera immunofluorescens förfarande, modifieras efter tekniken beskriven av Ahnfelt-Ronne 23, tillåtet för tredimensionella visualisering av att utveckla trakeal och lungvävnad, med en definierad uttrycksmönstret för proteiner som kodas av nyckeltranskriptionsfaktorer såsom Nkx2.1 och Sox9. När så önskas kan hela berget färgning presenteras som konfokala stödd z staplar av bilder, som avbildar olika djup i trakeal lungvävnad. Medan avbildning små explantat, bör utföras clearing av vävnaden i ett skede platta. Vi utnyttjade tjock metallskräddarsydda scen plattor med optisk botten där prover rensas och avbildas. Detta förhindrar förlust av material vid överföring liten vävnad efter att ha rensat steg. Medan hela montera immunofluorescens är en lämplig teknik för färgning av små vävnad, vi erkänner begränsningar för tekniken. Framför allt noterade vi olika föreställningar av antikroppar som känner igen antigen bättre i sektioner i motsats till hela berget. Det här problemet kan hindra utförandet av tekniken om inga alternativa antikroppar är tillgängliga. Det är också möjligt att användningen av metanol och clearing med Murrays klart kan ha en negativ inverkan på signalen observeras. I framtiden kommer vi att testa andra icke-organiska clearing lösningar och justera protokollet på rätt sätt för detta ändamål 24. En sista fråga är att hela berget kommer att möjliggöra studier av några proteiner som uttrycks i en vävnad vid en given tidpunkt.
Tidigare rapporter har visat nyttan avPNA lektin färgning att upptäcka mesenkymala förtätningar i delar av luftrör vävnad 21,25. I föreliggande studie rapporterar vi en metod genom vilken färgning utfördes i hela berget, vilket underlättar en bättre visualisering av de regioner i luftstrupen, vari brosket kommer att bildas. När de utför lektin färgning försiktighet bör placeras vid användning av lämplig koncentration av lektin till inte över fläck, som kommersiellt tillgängliga PNA-lektin är kopplad till GFP. Auto-fluorescens av vävnaden kan dölja resultaten gör det svårt att skilja band motsvarande mesenkymala förtätningar.
Slutligen är in vivo-märkning av vävnad med BrdU följt av sektionering och immunofluorescensfärgning en möjlig teknik för att bestämma celltillväxt som presenterar fördelar jämfört med typiska och statisk färgning såsom PPh3 eller PCNA 26,27. Den senare tekniken presenteras begränsningar, såsom färgning kommer att variera beroende på dencellcykelsteget. Detta problem elimineras genom vår beskrivna tekniken. Kombinering in vivo märkning följt av inbäddning, snittning och immunofluorescens tillät oss att bestämma att epitelial Wnt ligander balansera differens proliferation av Sox9 och α-SMA-uttryckande celler som kommer att ge upphov till trakeal brosk och muskel 7.
Sammanfattningsvis, en metod flera teknik för att studera mönstring av utvecklingsluftvägarna ger en djup analys av den roll som Wnt signalering i ledande luftvägarna morfogenes. Dessa studier fastställde exakta platser i Wnt / β-catenin i luftrör vävnad, liksom induktiv och lärorikt signaleringen som tillhandahålls av luftstrupen epitel som krävs för specifikation, differential spridning av luftrör mesenkym cellinjer, liksom broskbildning. Våra framtida inriktningar omfattar optimering av hela berget färgning för nyligen identifierade WLSmålgener, såväl som att utföra hela montera immunofluorescens i kombination med lektin-färgning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
"Författarna har ingenting att lämna ut."
Acknowledgments
Vi erkänner hjälp av Mike Muntifering och Matt Kofron med konfokal avbildning och Gail Macke med histologiska förfaranden. Detta arbete har delvis stöd av National Institutes of Health-NHLBI (K01HL115447 till DS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti Sox9 ab. | Millipore | AB5535 | 1:400 , rabbit |
| Anti Sox9 ab. | Santa Cruz | Sc-20095 | 1:50, rabbit |
| Anti Smooth Muscle Actin ab. | Sigma | A5228 | 1:2k, mouse |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:100, guinea pig |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:400, mouse |
| Anti Brdu ab. | Abcam | AB1893 | 1:200, sheep |
| Anti Brdu ab. | Santa Cruz | Sc-32323 | 1:4k, mouse |
| PNA Lectin | Sigma | L 7381 | |
| Secondary antibodies | Life technologies | Alexa fluor Molecular probes | |
| K3Fe(CN)6 | Sigma | P8131 | |
| K4Fe(CN)6 | Sigma-Aldrich | P3289 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| NaDOC | Life Technologies | 89905 | |
| NP4O | Life Technologies | 85124 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A-3157 | |
| Fisher brand super-frost plus | Fisher | 12-550-15 | |
| PFA (16%) | EMS | 15710 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | |
| Fetal Calf Serum | Sigma | 11K413 | |
| Blocking reagent | Invitrogen | Component of TSA kit #2 ( T20932) | |
| BrDu | Sigma | B5002-5g | |
| Vectashield mounting medium | Vector labs | H-1000 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Tissue-loc cassettes Histoscreen | Fisher | C-0250-GR | |
| Biopsy cassettes | Premiere | BC0109 | Available in different colors |
| Nuclear fast red Kernechtrot 0.1% | Sigma | N3020 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-500G | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | S4641-1Kg | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T5941-500G | |
| Xylene | Pharmco-AAPER | 399000000 | |
| Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Micro knives | FST | 10318-14 | |
| Dumont #5 ceramic coated | FST | 11252-50 | |
| Dumont #5CO | FST | 11295-20 | |
| Dumont # 5 | FST | 91150-20 | |
| Thermo/Shandon Excelsior ES | Thermo Fisher | ||
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Nikon i90 | Nikon | Wide field microscope | |
| NikonA1Rsi | Nikon | Confocal microscopy. Settings:NikonA1 plus camera, scanner: Galvano, detector:DU4. Optics Plan Apo lambda 10X. Modality: Widefield fluorescence laser confocal. | |
| Leica MS 16 FA | Leica | Fluorescence Dissecting microscope | |
| Zeiss | Zeiss | Automated fluorescence microscope | |
| Leica Application suite | Leica | Leica imaging software | |
| NIS | Nikon | Nikon imaging software | |
| IMARIS | Bitplane | Imaging processing software |
References
- Maeda, Y., Dave, V., Whitsett, J. A. Transcriptional control of lung morphogenesis. Physiol Rev. 87, 219-244 (2007).
- Morrisey, E. E., Hogan, B. L. Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development. Dev Cell. 18, 8-23 (2010).
- Fausett, S. R., Klingensmith, J. Compartmentalization of the foregut tube: developmental origins of the trachea and esophagus. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, 184-202 (2012).
- Goss, A. M., et al. Wnt2/2b and beta-catenin signaling are necessary and sufficient to specify lung progenitors in the foregut. Dev Cell. 17, 290-298 (2009).
- Harris-Johnson, K. S., Domyan, E. T., Vezina, C. M., Sun, X. beta-Catenin promotes respiratory progenitor identity in mouse foregut. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 16287-16292 (2009).
- Cornett, B., et al. Wntless is required for peripheral lung differentiation and pulmonary vascular development. Dev Biol. 379, 38-52 (2013).
- Snowball, J., Ambalavanan, M., Whitsett, J., Sinner, D. 34;Endodermal Wnt signaling is required for tracheal cartilage formation". Dev Biol. , (2015).
- Shannon, J. M., Hyatt, B. A. Epithelial-mesenchymal interactions in the developing lung. Annu Rev Physiol. 66, 625-645 (2004).
- Shannon, J. M., Nielsen, L. D., Gebb, S. A., Randell, S. H. Mesenchyme specifies epithelial differentiation in reciprocal recombinants of embryonic lung and trachea. Dev Dyn. 212, 482-494 (1998).
- Li, C., et al. Wnt5a regulates Shh and Fgf10 signaling during lung development. Dev Biol. 287, 86-97 (2005).
- Loscertales, M., Mikels, A. J., Hu, J. K., Donahoe, P. K., Roberts, D. J. Chick pulmonary Wnt5a directs airway and vascular tubulogenesis. Development. 135, 1365-1376 (2008).
- Yin, Y., et al. An FGF-WNT gene regulatory network controls lung mesenchyme development. Dev Biol. 319, 426-436 (2008).
- Shu, W., et al. Wnt/beta-catenin signaling acts upstream of N-myc, BMP4, and FGF signaling to regulate proximal-distal patterning in the lung. Dev Biol. 283, 226-239 (2005).
- Bretholz, A., Morrisey, R., Hoffman, R. S. The use of OpdA in rat models of organic phosphorus (OP) poisoning. Toxicology. 257, (2009).
- Goss, A. M., et al. Wnt2 signaling is necessary and sufficient to activate the airway smooth muscle program in the lung by regulating myocardin/Mrtf-B and Fgf10 expression. Dev Biol. 356, 541-552 (2011).
- Mucenski, M. L., et al. beta-Catenin is required for specification of proximal/distal cell fate during lung morphogenesis. J Biol Chem. 278, 40231-40238 (2003).
- Hyatt, B. A., Shangguan, X., Shannon, J. M. FGF-10 induces SP-C and Bmp4 and regulates proximal-distal patterning in embryonic tracheal epithelium. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L1116-L1126 (2004).
- Del Moral, P. M., et al. VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis. Dev Biol. 290, 177-188 (2006).
- Ott, S. R. Confocal microscopy in large insect brains: zinc-formaldehyde fixation improves synapsin immunostaining and preservation of morphology in whole-mounts. J Neurosci Methods. 172, 220-230 (2008).
- Jahrling, N., Becker, K., Dodt, H. U. 3D-reconstruction of blood vessels by ultramicroscopy. Organogenesis. 5, 145-148 (2009).
- Park, J., et al. Regulation of Sox9 by Sonic Hedgehog (Shh) is essential for patterning and formation of tracheal cartilage. Dev Dyn. 239, 514-526 (2010).
- Elluru, R. G., Thompson, F., Reece, A. Fibroblast growth factor 18 gives growth and directional cues to airway cartilage. Laryngoscope. 119, 1153-1165 (2009).
- Ahnfelt-Ronne, J., et al. An improved method for three-dimensional reconstruction of protein expression patterns in intact mouse and chicken embryos and organs. J Histochem Cytochem. 55, 925-930 (2007).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
- Gillotte, D. M., Fox, P. L., Mjaatvedt, C. H., Hoffman, S., Capehart, A. A. An in vitro method for analysis of chondrogenesis in limb mesenchyme from individual transgenic (hdf) embryos. Methods Cell Sci. 25, 97-104 (2003).
- Cohen, E. D., et al. Wnt signaling regulates smooth muscle precursor development in the mouse lung via a tenascin C/PDGFR pathway. J Clin Invest. 119, 2538-2549 (2009).
- Boucherat, O., et al. Partial functional redundancy between Hoxa5 and Hoxb5 paralog genes during lung morphogenesis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 304, L817-L830 (2013).
