Summary
Die Verwendung von Reporter - Mäuse gekoppelt ganze Berg und Abschnitt Färbung, Mikroskopie und in - vivo - Tests erleichtert die Analyse der Mechanismen , die die normale Strukturierung der Atemwege zu Grunde liegen. Hier beschreiben wir, wie diese Techniken zur Analyse der Wnt-Signal während trachealen Entwicklung beigetragen.
Introduction
Respirationstrakt Entwicklung wird durch embryonaler Tag 9 (E9) mit dem Auftreten von Nkx2.1 - positiven Zellen in der Bauch endodermalen foregut 1,2 eingeleitet. Ösophagus-Trachealtubus Trennung wird durch E11.5 lösen , wenn die Rohre als getrennte Einheiten unterschieden werden kann, die jeweils 3 durch mesenchymale Gewebe umgeben. Wnt - Signalisierung spielt eine Schlüsselrolle in der Spezifikation des Respirationstraktes wie Deletion Wnt2 und Wnt2b durch die splanchnic Mesenchym und Löschung von β-Catenin von der endodermalen respiratorischen Epithels exprimiert wird in Lunge agenesis 4,5 führen. Unsere früheren Studien festgestellt , dass das Löschen von Wls, einer Ladung Rezeptor vermittelnde Sekretion aller Wnt - Liganden, von den endodermaler Atemwege führt zu Lungenhypoplasie, Mängel bei der pulmonalen Gefäßentwicklung und Fehl Strukturierung der trachealen Mesenchyms 6,7. Diese Daten unterstützen die Bedeutung der epithelial-mesenchymalen cross sprechen bei der Zelldifferenzierung und der Beschreibung , wie es auch in anderen Studien 8,9 gezeigt wurde.
Die Untersuchung der frühesten Stadien der Lungenentwicklung stützt sich auf genetische, in vitro und ex vivo - Techniken , die uns besser erlaubt haben , Mechanismen zu verstehen , Atem Identität Fahr 16.10. Ganze Lunge Explantatkulturen am Luft Flüssigkeit Interphase wurden in frühen Stadien der Lungenverzweigungs Morphogenese 10,17,18 die Effekte der Wachstumsfaktoren zu untersuchen weithin verwendet. Während dieses Verfahren als Auslesen von morphologischen Veränderungen verwendet wird, wie beispielsweise Verzweigungs Morphogenese und Genexpressionsmodulation, ist es für das Studium der frühen Stadien des Entwicklungsprozesses begrenzt, da die Kultur selbst nicht die Entwicklung der Vaskulatur 17 unterstützt. Entwicklung Trachealknorpels erfordert längere Inkubationszeiten, die nicht mit dieser Kultur-Technik kompatibel sind.
Um Analyze die Rolle der Wnt-Signal während der Atemwege Bildung haben wir Standardtechniken angepasst auf die Bedürfnisse unserer embryonalen Studien zu erfüllen. Wir haben Volumina geändert, Färbungszeiten, Bearbeitungs Radfahren für Paraffineinbettung und den Zeitpunkt für die Reinigung der Tracheal-Lungengewebe. Das Hauptziel der Techniken in der vorliegenden Studie beschrieben Optimierung war die frühesten Stadien der trachealen Entwicklung bei Mäusen zu analysieren, die von E11 bis E14,5 stattfinden. Unter Verwendung der Reportermäuse Linie Axin2LacZ wir genau bestimmten Stellen von Wnt / β-Catenin - Aktivität in der Entwicklung von trachealen Mesenchym. Wir haben auch Lektin Färbeverfahren für ganze Berg Luftröhrengewebe angepasst. So konnten wir mesenchymalen Verdichtungen zu visualisieren und zu Websites, vorherzusagen, wo Chondrogenese stattfinden wird. Die Färbung der ganze Berg und Abschnitte von embryonalem Gewebe erhalten von WlsShhCre Mäuse, gepaart mit erweiterten Mikroskopietechniken, erlaubt uns , die Rolle der Wnt - Liganden durch die tra produziert zu enthüllenCheal Epithel in trachealen Musterung.
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Protocol
Die Tiere wurden in pathogenfreien Bedingungen untergebracht. Die Mäuse wurden nach Protokollen genehmigt durch CCHMC Institutional Animal Care und Use Committee (Cincinnati, OH USA) behandelt. Mäuse in diesen Studien verwendet wurden, in einem gemischten Hintergrund gehalten.
1. Ganze Berge X-Galactosidase-Färbung
- Euthanize schwangere Frau bei E11,5 bis E14,5, durch CO 2 Inhalation. Setzen Sie Tiere in CO 2 Kammer, laden Sie die Kammer mit CO 2. Pflegen Sie Tiere in der Kammer für mindestens 5 min. Führen Sie sekundäre Methode der Euthanasie durch Genickbruch.
- Saubere Bauchbereich mit Ethanol (EtOH) 70% und führen Laparotomie mit einem einzigen Bauchmittelschnitt. Nutzen chirurgische Scheren und Standardmuster (gerade gesägten) Zange.
- Isolieren Gebärmutterhörner Zange und einer feinen Schere verwenden und sofort setzen Gewebe in Petrischale gekühlt enthaltenden PBS-Lösung. Pflegen Gewebe auf Eis, bis Sie fortfahrenzur Isolierung von Embryonen.
- Isolieren Embryonen von Gebärmutterhörner. Präparieren embryonale trachealen Lungengewebe Binokular mit. Nutzen Sie feine Spitze Pinzette und Schere zu halten und das Gebärmuttergewebe durchlöchern und concepti die Embryonen freizugeben.
- Entfernen Eihüllen bleiben. Mit Hilfe von Nadelklingen geschnitten Kopf von Embryonen und unteren Körperteil unterhalb des Zwerchfells. Finde Leber als Wahrzeichen.
- Nach Isolierung des Thoraxbereich des Embryos, gehen lateralen Seiten der Körperwand, der Wirbelsäule und des Herzens unter Verwendung von Nadelklingen zu entfernen. Achten Sie darauf, während das Herz Entfernen zu vermeiden Luftröhrengewebe zu verletzen. Schließlich vorsichtig, trennen Sie die Speiseröhre aus der Luftröhre durch die Speiseröhre mit Hilfe von Nadelblätter ziehen. Pflegen Gewebe in PBS-Lösung auf Eis.
- Platz Gewebe in 4 ml Schraubdeckel Fläschchen unter Verwendung von Glas oder Transferpipetten. Fix trachealen Lungengewebe in 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS für 30 min. Nach der Fixierungspülen Gewebe mit PBS. Während dem Spülen X-gal - Färbung - Lösung ( je 5 mm K 3 Fe (CN) 6, (100 & mgr; l 0,5 M Lager) 5 mM K 4 Fe (CN) 6 (100 & mgr; l 0,5 M Lager) 2 mM MgCl 2, vorbereiten ( 20 & mgr; l 1 M Lager) 0,01% NaDOC (50 & mgr; l 2% Lager), 0,02% NP 4 O (100 & mgr; l 2% Lager), 1 mg / ml X-gal (500 & mgr; l von 20 mg / ml Brühe) und 9,13 ml Wasser destilliert, um ein Endvolumen von 10 ml zu bringen).
- Entfernen Sie alle verbleibenden PBS und 2 ml X-gal-Färbung Lösung für das Glasfläschchen. Legen Sie Fläschchen in Fach auf Schüttler. Stain Gewebe 1 bis 2 h in X-gal-Färbelösung. Inkubieren des Gewebes in X-gal-Lösung für 4 Stunden zur weiteren Verarbeitung und Einbettung.
- Die Reaktion durch Waschen Gewebe in 3% Dimethylsulfoxid-PBS. Spülen in PBS, 3-mal für jeweils 5 min waschen und lagern in 70% Ethanol.
- Füllen Petrischalen mit einem 1% Agarose / PBS-Lösung. Lassen Sie Agarose erstarren. Mit Glastransferpipetten, legen Sie das Gewebe auf Agarose-coated Platten mit PBS-Lösung gefüllt. Fotografieren ganze Halterungen ein Binokular mit. Wählen Sie den entsprechenden Filter für Hell.
- Um besser zu Websites von X-gal-Färbung Prozessproben für Paraffineinbettung und Schneiden unterscheiden. Prüfmuster in feinen Rasterkassetten.
- Zur Verarbeitung von Proben für die Paraffineinbettung eines automatisierten Prozessor verwenden und einen kurzen Zyklus wie folgt aufgestellt: sechs Änderungen von Alkohol: 5 min erste Änderung und 3 min pro jede verbleibende Veränderung. Drei Änderungen von Xylen: 5 min erste Änderung und 3 min nächsten zwei Änderungen. Die vorherigen Schritte werden bei 30 ° C durchgeführt wird. Schließlich führen drei Änderungen von Paraffin bei 62 ° C: 25 min, 8 min und 5 min.
- Orient Proben zum Einbetten mit Gewebe einzubetten Boot flach auf dem Boden liegend. Sorgfältig Paraffin fügen Sie das Einbetten von Boot zu füllen. Kühlen Sie sofort auf kalte Platte Station bis Paraffin erstarrt der Einbettung. Entfernen Block vom Boot einbetten. Mit einem Mikrotom, erzeugen 6 um sexionen. Berg Abschnitte auf vorbehandelte Spangen und trockenen Folien auf Folie wärmer Satz bei 42 ° C für 1 Stunde.
- Backen Sie gleitet über Nacht in einem Ofen bei 56 ºC. Die Objektträger in Racks. Deparaffinisieren Träger mit drei Änderungen von 100% Xylen, jeweils 10 min. Verwenden Sie Schalen gefüllt mit 200 ml Xylen Färbung.
- Rehydrieren Folien unter Verwendung von abgestuften Serie EtOH (100%, 70%, 50% und 30%, 1 min pro Schritt) zu PBS, bevor sie für 10 bis 30 sec mit Nuclear Fast Red Gegenfärbung. Spülen Sie Objektträger mit Leitungswasser dreimal für jeweils 5 min über Kernechtrot zu entfernen.
- Entwässern Dias in einer abgestuften EtOH-Serie (50%, 70% und 100% EtOH) vor dem Waschen in drei Änderungen von Xylen (20 taucht jede Änderung) und Abdeckung Abrutschen mit Xylen auf Basis Eindeckmedien.
2. Lektin Färbung
- Präparieren E13.5 und E14.5 trachealen Lungengewebe als 1,1 bis 1,4 in Schritten beschrieben. Mit Glastransferpipetten Ort Gewebe in Schraubdeckel Fläschchen. Fix trachealen Lungengewebe mit 2 ml2% PFA-Lösung über Nacht bei 4 ° C. Nach der Fixierung spülen Proben in PBS dreimal für jeweils 10 Minuten zu waschen.
- Bereiten Blocking-Puffer, in der Regel um ein Endvolumen von 10 ml Lösung. Mit 0,1 g BSA (1%) auf 8 ml PBS. Erlauben BSA aufzulösen. Fügen 0,2 ml Ziegenserum (2%) 0,03 ml von Triton X-100 (0,3%). Bringen Endvolumen auf 10 ml mit PBS. Block Proben für 1 Stunde in 0,5 ml Puffer bei Raumtemperatur blockiert.
- Entfernen Blockierungspuffer eine Transferpipette und ersetzen mit Lektin Lösung, die aus 50 ug / ul Lektin, 10% Ziegenserum und PBS. Verwenden Sie 250 ul Lektinlösung pro Probe. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C. Achten Sie darauf, das Glas Fläschchen mit Gewebe mit Aluminiumfolie zu bedecken. Nach Inkubation mit Lektin-Lösung gründlich Proben in PBS dreimal für 10 min.
- Platz Explantate in Agarose-beschichteten Petrischalen genug PBS, die Proben zu decken. Fotografieren ganze Halterungen ein Fluoreszenz-Binokular mit. Wählen Sie das geeignet friate Filter zur Detektion Fluoreszenz. Lectin PNA ist in der Regel an GFP gekoppelt.
3. Ganze Berge Immunfluoreszenzanfärbung und konfokale Mikroskopie
- Isolieren trachealen Lungengewebe, Transfer zum 4 ml Glas Schraubverschluss Fläschchen und fixieren über Nacht in 4% PFA. E11,5 Gewebe kann in 2% PFA fixiert werden. Shop in Methanol 100%. Die Proben können bei -20 ° C mehrere Monate gelagert werden.
- Entfernen Sie unter Verwendung von Methanol Transferpipette und Permeabilisierung Proben Dent Bleach mit (4 Teilen Methanol, 1 Teil DMSO und 1 Teil 30% H 2 O 2) für 2 Stunden. Hydrats Gewebe in einer abgestuften Reihe von Methanol in PBS verdünnt, wie folgt: 100% Methanol, 75% Methanol, 50% Methanol, 25% Methanol, 100% PBS. Inkubiere 10 Minuten bei Raumtemperatur während jeder Stufe der Hydratisierung.
- Block Gewebes in 0,5% Blockierungsreagenz in PBS verdünnt (siehe Materialien für Details) für zwei Stunden bei Raumtemperatur unter Rühren.
- Verdünnte primärer Antikörper in BlockingLösung (Sox9 1: 100, Nkx2.1 1: 200, αSMA 1: 250) und Inkubation Proben über Nacht bei 4 ° C. Waschproben mit PBS fünfmal bei Raumtemperatur. Führen Sie jede Wäsche für 1 Stunde.
- Anwenden sekundären Antikörper bei einer 1: 500-Verdünnung in 0,5% Blockierungslösung. Wählen Sie sorgfältig Sekundärantikörper Bindung zwischen Sekundärantikörper zu verhindern. über Nacht bei 4 ° C in einem dunklen Raum inkubieren. Waschproben dreimal für 20 min bei Raumtemperatur. Dehydratisieren Proben in einer abgestuften Reihe von Methanol in PBS verdünnt, wie folgt: 25% Methanol, 50% Methanol 75% Methanol, 100% Methanol, 10 min jeden Schritt.
Stellen Sie sicher, dass die Proben mit Aluminiumfolie bedeckt bleiben und minimieren Belichtung: HINWEIS. Gewebe kann nun bei 4 ° C für mehrere Wochen gelagert werden, bis photographiert. - Transfer - Proben , um benutzerdefinierte Stufe Platten, entfernen Methanol und klar mit etwa 200 ul Murrays klare Lösung 19,20 (2 Teile Benzylbenzoat, 1 Teil Benzylalkohol) sofort befErz-Bildgebung. Fotografieren Sie mit einem konfokalen Mikroskop. Verarbeitung und Analyse von Bild Imaging-Software.
4. Zellproliferation
- Injizieren E11.5 trächtigen Mäusen intraperitoneal mit einer Lösung von BrdU in einer Konzentration von 100 ug BrdU / g Körpergewicht. Sacrifice weiblich, wie in Abschnitt 1 des Protokolls beschrieben und isolieren Embryonen bei E12,5 oder E13.5. Mit Messerklingen, die Verbrauchs Köpfe und unteren Teil des Körpers unterhalb Brusthöhle.
- Legen Sie thorakalen Gewebe in 4 ml Fläschchen Kappe schrauben und reparieren in 1 ml 4% PFA über Nacht. Waschproben mit PBS zweimal für 5 min und entwässern Proben durch eine Ethanolreihe in destilliertem Wasser bis zu 70% Ethanol verdünnt, wie folgt: 30%, 50% und 70% Ethanol, 5 min jeden Schritt.
- Prüfmuster in mittlerer Größe Bildschirm-Kassetten. Prozess Gewebe für Paraffineinbettung mit und automatisierten Prozessor. Stellen Sie einen Zyklus wie folgt zusammen: sechs Änderungen von Alkohol für jeweils 8 min, drei Änderungen von Xylen für 6 min jeweils drei cHanges von Paraffin, 25 min, 9 min und 8 min.
- Einbetten in Paraffin, das Gewebe in gewünschte Position auszurichten 6 um quer zu erzeugen oder Längsschnitte, wie in Abschnitt 1. Platz Abschnitte auf Folien beschrieben und ermöglichen Gewebe haften auf Folie wärmer Satz bei 42 ° C für 1 Stunde gleiten.
- Backen Sie Dias, auf ihren Seiten, über Nacht in einem Ofen bei 56 ° C. Die Objektträger in Kunststoff-Racks. De-Paraffin säubern Folien durch Eintauchen in drei Änderungen von 100% Xylene, 10 min pro Wechsel. Verwenden 200 ml Xylol vollständig zu Folien unterzutauchen. Rehydrieren Folien unter Verwendung von abgestuften Serie EtOH (100%, 70%, 50% und 30%, 5 min pro Schritt unter Rühren) zu PBS (5 min).
- Führen Antigen-Retrieval 10 mM Citratpuffer, pH 6 Zu 100 ml Citratpuffer Mischung 18 ml 0,1 M Citrat-Citronensäure-monohydrat und 82 ml 0,1 M Natrium herzustellen.
- Platz Proben in Kunststoff Färbetrog gefüllt mit Antigen-Retrieval-Lösung und Mikrowelle für 6,5 min bei hoher Leistung. In distilled Wasser Glasküvette für verdampfte-Citrat-Puffer und reheat bei 40% Leistung für 6 min zu kompensieren.
- Füllen Sie Coplin Glas mit Wasser nach oben, und aufwärmen wieder bei 40% Leistung für 6 min. Mikrowelle Zeiten können auf Mikrowelle benutzt variieren.
- Erlauben Folien für 20 min bei Raumtemperatur vor dem Waschen Folien in destilliertem Wasser für 1 min, gefolgt von PBS für 5 Minuten abkühlen lassen. Nach dem PBS waschen Blockobjektträger für 2 Stunden in TBS Blockierungslösung (2,425 g Tris-Base und 8,765 g NaCl verdünnt in 1 l destilliertem Wasser) 10% Eselserum und 1% BSA enthält.
- Hinzufügen primären Antikörpern, verdünnt in Blockierlösung (TBS, enthaltend 10% Eselserum und 1% BSA). BrdU (Mitose-Marker), Nkx2.1 (Atemwege Epithel), Sox9 (Zellen, die wird Anlass zu Knorpel geben) und αSMA (glatte Muskelzellen). Inkubiere Objektträger über Nacht bei 4 ° C. Verwenden Sie Overlay-Methode Antikörper zu erhalten. Bewerben 180 ul Antikörper an eine Dichtung und befestigen Sie dann Schieber als ob DeckglasKlingeln.
- Trennen Dichtung durch Schieber in destilliertes Wasser getaucht wird. Nach dem Entfernen der Dichtung, nicht gebundenen primären Antikörper waschen von sechs 5 min wäscht Durchführung mit TBS 0,1% Tween-20 enthält.
- Inkubiere Objektträger mit Antikörper Sekundär verdünnten Lösung bei einer Verdünnung von 1 in Blockierungs: 200, 1 Stunde bei Raumtemperatur. Wählen Sekundärantikörper sorgfältig unerwünschte Bindung zwischen ihnen zu verhindern. Entfernen ungebundenen sekundären Antikörper, indem es drei 5 Minuten Waschungen mit TBS, das 0,1% Tween.
- Waschen Sie Folien in 0,1 M Tris-Base zweimal für 5 min und dann 0,05 M Tris-Base zweimal für 5 min. Die Objektträger können in 0,05 M Tris-Base gelassen werden, während coversliping mit Montage Medien mit oder ohne DAPI (1,5 ug / ml). Shop Dias in Dia-Ordner bei 4 ° C und vor Licht schützen, indem Ordner mit Aluminiumfolie abdecken.
- Visualisieren Färbung und Fotografie unter Verwendung eines automatisierten Fluoreszenzmikroskop. Graf markierte Zellen und Gesamt Zellen pro Feld fotografiert bei20X und 40X, um zu bestimmen Verhältnisse von Zellen zu Gesamtzellen vermehren.
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Representative Results
Wnt / β-Catenin-Aktivität
Ganze Berge Lac-Z - Färbung wurde in Tracheal-Lungengewebe von Embryonen aus Reporter Axin2 Lac -Z Mäuse 11 getrennt nachgewiesen werden . Seiten der Färbung zeigen Wnt / β-Catenin-Aktivität. Analyse von Abschnitten ganze Berg Färbung bestimmt, dass Wnt / β-Catenin-Aktivität im Mesenchym der Trachea vorhanden war und in Mesenchym der peripheren Regionen der Entwicklung der Lunge. In WlsShhCre Embryonen (worin Sekretion von Wnt - Liganden aus dem Epithel des Atemtrakts wurde aufgehoben) Lac-Z - Färbung war fast nicht vorhanden (Abbildung 1).
Mesenchymale Verdichtungen in trachealen Mesenchyms
Ein entscheidender Schritt in Chondrogenese ist der Prozess, durch den mesenchymalen Zellen r zu geben, vom Schicksal bestimmtise kondensieren zu Knorpel. Diese enge Aggregationen von Zellen als mesenchymale Verdichtungen bekannt. Um zu testen, ob der Mangel an in WlsShhCre Mäusen beobachtet Knorpel zu einer Abwesenheit von mesenchymalen Kondensationen, Tracheal Lungengewebe von Schwangerschaftsalter E12.5 bis E14.5 zurückzuführen waren mit PNA-Lektin gefärbt. Bei E13.5 und E14.5, Fluoreszenz wurde an den Standorten als periodische Bands in der trachealen Mesenchyms erkannt, wo Knorpel gebildet werden. Mangel an nachweisbare Fluoreszenz in dem trachealen Gewebe WlsShhCre Embryos zeigt , dass endodermalen Wnt - Signalisierung an das tracheale Mesenchym für mesenchymale Kondensationen erforderlich ist (Abbildung 2).
Atemwegszell Spezifikation
Whole Mount Immunofluoreszenz von trachealen Lungengewebe bestimmt das Expressionsmuster von Sox9, Nkx2.1 und αSMA bei E11,5. In der Luftröhrengewebe ist Grenze Sox9 Ausdrucked zum Mesenchym der Trachea als kontinuierlicher Streifen (Pfeil in 3A und B) , während in der Entwicklungslungen Sox9 an der Peripherie des respiratorischen Epithels (Pfeilköpfe in 3A, B und C) beobachtet wird. Nkx2.1 stellt einen deutlichen Expressionsmuster auf dem Epithel der Trachea der Lunge beschränkt. Verhindern, dass die Sekretion von Wnt-Liganden aus Epithel verursacht verminderte Expression von Sox9 in trachealen Mesenchyms aber keinen Einfluss auf Sox9 Expression im peripheren Lungenepithels. Expression von αSMA nicht ohne weiteres in trachealen Mesenchym detektiert jedoch Färbung wurde auf der Ebene des Larynx (gelber Pfeil, 3) und des Magens (3) detektiert.
Die Zellproliferation bei der Entwicklung von Trachea
Proliferation in Epithel und Mesenchymder Trachea wurde nach in vivo - Markierung von Gewebe mit BrdU nachgewiesen. Die Abschnitte der Luftröhrengewebe wurden mit Antikörpern, die BrdU, Sox9 und αSMA gefärbt. Das Proliferationsprofil in der Trachea Mesenchym zeigt an, dass die Konzentrationen von Sox9 gefärbten Zellen-Proliferation unterziehen ist höher als das Niveau der αSMA färbten Zellen unterzogen Proliferation. Dieses Proliferationsmuster scheint in WlsShhCre Tracheen (Abbildung 4) rückgängig gemacht werden.
Abbildung 1: Wnt / β-Catenin - Aktivität wirksam ist , in trachealen Mesenchyms E13.5 trachealen Lungengewebe, isoliert von Axin2-LacZ und WlsShhCre. Axin2-LacZ Mäuse wurden gefärbt mit X-gal (A und B). Die Abschnitte der trachealen Lungengewebe wurden mit schnell rot (A ', B') gegengefärbt . Beachten Sie das Fehlen von X-galFärbung in WlsShhCre; Axin2-Lac-Z Mäuse Abwesenheit von Wnt / β-Catenin - Aktivität (B ') zu demonstrieren. E14.5 Gewebe aus Axin2 LacZ - Mäusen gefärbt mit X-gal zeigt Seiten der zukünftigen Knorpelringe (C); jedoch wurde Axin2 Aktivität zur Peripherie (Pfeilspitze) beschränkt der mesenchymalen Kondensationen (Pfeil) (D). Maßstabsbalken A, B und C = 500 & mgr; m; B ', D' und D = 100 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb . 2: mesenchymale Kondensation in Luftröhrengewebe entwickeln E13.5 Tracheal-Lungen - Explantate wurden mit PNA - Lektin gefärbt. Steuerluftröhrengewebe die Regionen zeigt , waren kondensiert mesenchymalen Zellen dargestellt (Pfeile A C). Keine mesenchymalen Kondensationen wurden in WlsShhCre Mäusen (B und Pfeil in D) detektiert. C und D zeigen geringere Vergrößerung von trachealen-Lungengewebe in A und B gezeigt. Maßstabsbalken A und B = 1 mm; C und D = 2 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Expressionsmuster in prächondrogenen ganze Berg Trachea Nkx2.1 und Sox9 Färbung wurde in E11,5 Explantate nachgewiesen.. Panel A zeigt ein Bild eines Kontrollgewebe, während Feld B einen optischen Abschnitt eines 20 & mgr; m Kontrollgewebe zeigt. Notieren Sie sich den Mangel an mesenchymalen Expression von Sox9 in WlsShhCre Gewebe (Pfeil in C), but Aufrechterhaltung der peripheren Expression von Sox9 (Pfeilspitze in C). αSMA Färbung auf einem niedrigen Niveau in trachealmesenchyme von E11.5 Gewebe nachgewiesen wurde , aber in den Larynx - Bereich (gelbe Pfeilspitze in D und E), Magen (S) und restlichen Herzgewebe (CT) (E) beobachtet. Nkx2.1 ist in Epithel entwickeln Trachea und die Lungen (D, E) ausgedrückt. Maßstabsbalken = 10 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb . 4: Die Zellproliferation Muster in prächondrogenen Mesenchyms Abschnitte E13.5 Embryonen wurden mit anti BrdU, Sox9 und αSMA Antikörper gefärbt. Panels C und D sind höhere Vergrößerungen von A B ein . Gepunkteten Linien stellen Grenzen des trachealen Epithels. Hinweis Sox9 gefärbten proliferativen Zellen (Pfeilspitze C) und αSMA gefärbten proliferativen Zellen (Pfeilspitze in D). T = Trachea, E = Speiseröhre. Maßstabsbalken A und B = 50 & mgr; m, C und D = 20 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Veranstaltungen der Morphogenese der Atemwege zugrunde liegen, sind nicht vollständig verstanden, insbesondere die für die Strukturierung der leitenden Atemwege erforderlichen Prozesse. Frühere Studien haben ex vivo - Techniken verwendet , wobei die Entwicklung Explantate kultiviert werden an der Luft-Flüssigkeit - Zwischenphasen - oder eingebettet in Matrigel 21,22. Diese Studien haben gezeigt, wie Wachstumsfaktoren, die Strukturierung der Entwicklungs Trachea und die Bildung von Trachealknorpels beeinflussen. Eine Einschränkung dieser Studien ist , daß die Architektur des Gewebes nicht richtig gehalten wird , und daher kann sie nicht ganz die in vivo Verfahren der Chondrogenese rekapitulieren.
Der Ansatz, den wir übernahm die Rolle des Wnt - Signal in den Prozess der Durchführung von Atemwege zu untersuchen Musterung in - vivo - Studien in Verbindung mit whole mount Färbetechniken, Immunofluoreszenz und Imaging enthalten. X-gal-Färbung von whole mount Gewebe, gefolgt von sectioning und Gegenfärbung, stellt Vorteile gegenüber der Färbung von Paraffinschnitten. Ganze Berge Färbung ermöglicht die direkte Detektion von Stellen, an denen Wnt / β-Catenin-Aktivität wirksam ist. Darüber hinaus bestimmt im Mesenchym genaue Standorte der gefärbten Explantate sectioning wobei die Aktivität sich als Entwicklung fortgeschritten ist. Letzteres ist eine bessere und genaue Anzeige als Nachweis der Expression von β-Galactosidase-Enzyms in Paraffinschnitten. Während die enzymatische Aktivität in den Abschnitten festgestellt werden konnte, wird diese Prozedur Kryoabschnitte erfordern, die zu erzeugen, nicht immer einfach sein wird, und die Architektur von kleinen Proben nicht erhalten kann. Eine Einschränkung in dem Protokoll in diesem Dokument beschrieben wird, ist, dass die Verarbeitung von Proben für die Paraffineinbettung nach whole mount-Färbung einen Verlust des Signals führen. Deshalb müssen Proben länger in X-Gal-Lösung zu bleiben und einen kürzeren Zyklus für Paraffineinbettung verwendet werden sollte, gutes Signal auf Abschnitte zu erhalten.
Auf der anderen Seite, ganze Immunofluoreszenz Durchführung der Prüfung nach der Technik , die von Ahnfelt-Ronne 23 beschrieben modifiziert, tridimensional Visualisierung des Entwickelns tracheale und pulmonale Gewebe erlaubt, mit einer definierten Expressionsmuster von Proteinen durch Schlüsseltranskriptionsfaktoren wie Nkx2.1 codiert und Sox9. Wenn gewünscht, kann die gesamte Halterung Färbung als konfokale Gestützte z Stapel von Bildern dargestellt werden, unterschiedliche Tiefen des trachealen Lungengewebe zeigt. Während kleine Explantate Bebilderung, Clearing- des Gewebes sollte in einer Tischplatte durchgeführt werden. Wir verwendeten dicke Metallindividuelle Bühnenplatten mit optischen Boden gemacht, wo Proben gelöscht und abgebildet. Dies verhindert den Verlust von Material, während kleine Gewebe Übertragung nach dem Schritt zu löschen. Während ganze Berg Immunofluoreszenz eine geeignete Technik zur Färbung von kleinen Gewebe ist, erkennen wir auf die Technik Grenzen. Insbesondere beobachteten wir unähnlich Leistungen von Antikörpern, die Antigen besser in den Abschnitten erkennen als auf ganze Berg gegenüber. Dieses Problem kann die Leistung der Technik entgegen, wenn keine alternativen Antikörper verfügbar sind. Es ist auch möglich, dass die Verwendung von Methanol und Clearing mit Murray klar beobachtet eine negative Auswirkung auf das Signal haben kann. In Zukunft werden wir andere nicht-organischen Clearing - Lösungen zu testen und das Protokoll richtig zu diesem Zweck 24 einzustellen. Eine letzte Überlegung ist, dass ganze Berg wird die Studie von einigen Proteinen in einem Gewebe zu einem bestimmten Zeitpunkt zum Ausdruck zu ermöglichen.
In früheren Berichten wurde die Nützlichkeit gezeigtPNA - Lektin - Färbung mesenchymalen Verdichtungen in den Abschnitten von Luftröhrengewebe 21,25 zu erkennen. In der vorliegenden Studie berichten wir über eine Methode, durch die die Färbung in ganze Berg wurde durchgeführt, die eine bessere Visualisierung der Regionen der Trachea erleichtert, wobei wird der Knorpel gebildet werden. Während der Durchführung Pflege Lektin-Färbung sollte bei der Verwendung der entsprechenden Konzentration von Lektin nicht über Fleck platziert werden, als im Handel erhältliche PNA-Lektin an GFP gekoppelt ist. Auto-Fluoreszenz des Gewebes kann die Ergebnisse erschwert verschleiern Bands zu unterscheiden entsprechenden Verdichtungen mesenchymalen.
Schließlich wird in vivo - Markierung von Gewebe mit BrdU gefolgt von Schneiden und Immunfluoreszenzanfärbung ist eine mögliche Technik der Zellproliferation zu bestimmen , die Vorteile gegenüber typischen und statische Färbung wie PPh3 oder PCNA 26,27 präsentiert. Die letztere Technik stellt Beschränkungen, wie Färbung auf die variieren jeZellzyklus-Stadium. Dieses Problem wird durch unsere beschriebene Technik beseitigt. In vivo - Markierung durch das Einbetten, sectioning und Immunofluoreszenz gefolgt Kombination erlaubt uns , dass epithelialen Wnt zu bestimmen Liganden die Differential Proliferation von Sox9 und α-SMA - exprimierenden Zellen ausgleichen , die 7 Anlass zu Trachealknorpels und Muskeln geben.
Zusammengefasst ein Ansatz mit mehreren Technik, um die Strukturierung der Entwicklung der Atemwege zu studieren ermöglicht eine tiefe Analyse der Rolle der Wnt-Signalweg in Atemweg Morphogenese durch. Diese Studien bestimmt, die genauen Stellen von Wnt / β-Catenin in den trachealen Gewebe sowie induktiven und instruktive Signalisierungs vom Trachealepithel vorgesehen, die für die Spezifikation, differentielle Proliferation von trachealen Mesenchym Zelllinien, sowie der Knorpelbildung erforderlich ist. Unsere Zukunft Richtungen sind die Optimierung der ganze Berg Färbung für kürzlich identifizierten WlsZielgene, sowie die Durchführung von whole mount Immunofluoreszenz in Kombination mit Lektin Färbung.
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Disclosures
"Die Autoren haben nichts zu offenbaren."
Acknowledgments
Wir erkennen die Unterstützung von Mike Muntifering und Matt Kofron mit konfokaler Bildgebung und Gail Macke mit histologischen Verfahren. Diese Arbeit wurde teilweise von der National Institutes of Health-NHLBI (K01HL115447 DS) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti Sox9 ab. | Millipore | AB5535 | 1:400 , rabbit |
| Anti Sox9 ab. | Santa Cruz | Sc-20095 | 1:50, rabbit |
| Anti Smooth Muscle Actin ab. | Sigma | A5228 | 1:2k, mouse |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:100, guinea pig |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:400, mouse |
| Anti Brdu ab. | Abcam | AB1893 | 1:200, sheep |
| Anti Brdu ab. | Santa Cruz | Sc-32323 | 1:4k, mouse |
| PNA Lectin | Sigma | L 7381 | |
| Secondary antibodies | Life technologies | Alexa fluor Molecular probes | |
| K3Fe(CN)6 | Sigma | P8131 | |
| K4Fe(CN)6 | Sigma-Aldrich | P3289 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| NaDOC | Life Technologies | 89905 | |
| NP4O | Life Technologies | 85124 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A-3157 | |
| Fisher brand super-frost plus | Fisher | 12-550-15 | |
| PFA (16%) | EMS | 15710 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | |
| Fetal Calf Serum | Sigma | 11K413 | |
| Blocking reagent | Invitrogen | Component of TSA kit #2 ( T20932) | |
| BrDu | Sigma | B5002-5g | |
| Vectashield mounting medium | Vector labs | H-1000 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Tissue-loc cassettes Histoscreen | Fisher | C-0250-GR | |
| Biopsy cassettes | Premiere | BC0109 | Available in different colors |
| Nuclear fast red Kernechtrot 0.1% | Sigma | N3020 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-500G | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | S4641-1Kg | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T5941-500G | |
| Xylene | Pharmco-AAPER | 399000000 | |
| Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Micro knives | FST | 10318-14 | |
| Dumont #5 ceramic coated | FST | 11252-50 | |
| Dumont #5CO | FST | 11295-20 | |
| Dumont # 5 | FST | 91150-20 | |
| Thermo/Shandon Excelsior ES | Thermo Fisher | ||
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Nikon i90 | Nikon | Wide field microscope | |
| NikonA1Rsi | Nikon | Confocal microscopy. Settings:NikonA1 plus camera, scanner: Galvano, detector:DU4. Optics Plan Apo lambda 10X. Modality: Widefield fluorescence laser confocal. | |
| Leica MS 16 FA | Leica | Fluorescence Dissecting microscope | |
| Zeiss | Zeiss | Automated fluorescence microscope | |
| Leica Application suite | Leica | Leica imaging software | |
| NIS | Nikon | Nikon imaging software | |
| IMARIS | Bitplane | Imaging processing software |
References
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