Summary
Het gebruik van reporter muizen gekoppeld aan ganse berg en rubriek vlekken, microscopie en in vivo assays vergemakkelijkt de analyse van de onderliggende mechanismen van het normale patroon van de luchtwegen. Hier beschrijven we hoe deze technieken hebben bijgedragen aan de analyse van Wnt signalering gedurende tracheale ontwikkeling.
Introduction
Luchtwegen ontwikkeling wordt geïnitieerd door embryonale dag 9 (E9) met het verschijnen van Nkx2.1 positieve cellen in het ventrale endodermale voordarm 1,2. Slokdarm-tracheatube scheiding zal oplossen door E11.5 wanneer de buizen kunnen worden onderscheiden als afzonderlijke entiteiten, elk omringd door mesenchymale weefsel 3. Wnt signalering speelt een belangrijke rol in de beschrijving van de luchtwegen als deletie van Wnt2 en Wnt2b door de splanchnische mesenchym en verwijdering van β-catenine uit de endodermale luchtwegepitheel expressie resulteert in de longen agenesis 4,5. Onze eerdere studies vastgesteld dat de schrapping van Wls, een lading receptor bemiddelen afscheiding van alle Wnt liganden, uit de endodermale luchtwegen resultaten in long hypoplasie, defecten in de longvaten ontwikkeling en mis-patroonvorming van de tracheale mesenchym 6,7. Deze gegevens ondersteunen het belang van de epitheliale-mesenchymale cross praten celdifferentiatie en specificatie, zoals ook in andere studies 8,9 getoond.
De studie van de vroegste stadia van ontwikkeling van de longen vertrouwt op genetische, in vitro en ex vivo technieken die liet ons toe om beter te begrijpen mechanismen achter de luchtwegen identiteit 10-16. Hele long explantkweken bij Air Liquide interfase op grote schaal gebruikt om de effecten van groeifactoren in een vroege pulmonale vertakkende morfogenese 10,17,18 bestuderen. Hoewel deze methode wordt gebruikt als uitlezing van morfologische veranderingen, zoals vertakkingen morfogenese en genexpressie moduleren, is beperkt tot de studie van de vroege stadia van het ontwikkelingsproces, de cultuur zelf ondersteunt de ontwikkeling van bloedvaten 17. Ontwikkeling van tracheale kraakbeen vereist langere incubatietijden die niet compatibel zijn met deze cultuur techniek kan zijn.
om Analyze de rol van Wnt signalering tijdens luchtwegen vormen, hebben we standaardtechnieken aangepast aan de behoeften van embryonale studies voldoen. We hebben gewijzigd volumes, kleuring tijden, verwerking fietsen voor paraffine inbedding en de timing voor de clearing van tracheale-longweefsel. Het belangrijkste doel van het optimaliseren van de in deze studie beschreven technieken was om de vroegste stadia van tracheale ontwikkeling te analyseren bij muizen die plaatsvinden van E11 naar E14.5. Met behulp van de reporter muizen lijn Axin2LacZ we nauwkeurig bepaalde plaatsen van Wnt / β-catenine activiteit in de ontwikkeling van tracheale mesenchym. We hebben ook aangepast lectine kleuring procedure voor het ganse berg tracheale weefsel. Zo waren we in staat om mesenchymale verdichtingen visualiseren en locaties waar chondrogenese zal plaatsvinden voorspellen. Kleuring van ganse berg en secties van embryonaal weefsel verkregen uit WlsShhCre muizen, gecombineerd met geavanceerde microscopische technieken, konden we de rol van Wnt liganden door de tra onthullenCheal epitheel in tracheale patronen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De dieren werden gehuisvest in pathogeenvrije omstandigheden. De muizen werden behandeld volgens de protocollen door CCHMC Institutional Animal Care en gebruik Comite (Cincinnati, OH USA) goedgekeurd. Muizen gebruikt tijdens deze studies werden een gemengde achtergrond gehandhaafd.
1. hele berg X-galactosidase kleuring
- Euthanaseren zwangere vrouw op E11.5 naar E14.5 door CO 2 inhalatie. Plaats dieren in CO 2 kamer, laad de kamer met CO 2. Handhaving van dieren in de kamer voor minimaal 5 min. Voer secundaire methode van euthanasie door cervicale dislocatie.
- Schone buikstreek met ethanol (EtOH) en 70% laparotomie uitgevoerd met een abdominale incisie. Maak gebruik van chirurgische schaar en standaard patroon (rechte gezaagd) tang.
- Isoleer baarmoederhoorns behulp van een tang en fijne schaar en onmiddellijk plaats weefsel in petrischaaltje met gekoelde PBS-oplossing. Handhaaf weefsel op ijs tot procedureisolatie van embryo.
- Isoleer embryo's uit de baarmoeder horens. Ontleden embryonaal tracheale longweefsel met behulp van dissectie microscoop. Maak gebruik van fijne punt pincet en een schaar te houden en doorboren van de baarmoeder weefsel en concepti vrijgeven van de embryo's.
- Verwijder de resterende embryonale membranen. Met de hulp van de naald messen snijden hoofd van embryo's en onderlichaam deel onder het middenrif. Zoek lever als een mijlpaal.
- Na isolatie van de thoracale embryo, overgaan tot zijkanten van de lichaamswand, wervelkolom en hart met behulp naald messen te verwijderen. Wees voorzichtig tijdens het verwijderen van het hart om te voorkomen dat verwonden tracheale weefsel. Tenslotte zorgvuldig scheiden de slokdarm van de luchtpijp door aan de slokdarm met behulp van naald bladen. Handhaaf weefsel in PBS-oplossing op het ijs.
- Plaats weefsel in 4 ml schroefdop flesjes met behulp van glas of overdracht pipetten. Fix tracheale longweefsel in 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS gedurende 30 min. Na fixatieSpoel weefsel met PBS. Tijdens het spoelen, voor te bereiden X-gal kleuroplossing (voeg 5 mM K 3 Fe (CN) 6, (100 pi 0,5 M voorraad) 5 mM K 4 Fe (CN) 6 (100 pi 0,5 M voorraad) 2 mM MgCl2, ( 20 ui 1 M voorraad) 0,01% NaDOC (50 pi 2% voorraad), 0,02% NP 4 O (100 pi 2% voorraad), 1 mg / ml X-gal (500 pl van 20 mg / ml voorraad) en 9,13 ml gedestilleerd water tot een eindvolume van 10 ml) te bewerkstelligen.
- Verwijder alle overgebleven PBS en voeg 2 ml X-gal kleuroplossing aan het glazen flesje. Plaats flacons in dienblad op shaker. Vlek weefsels 1-2 uur in X-gal kleuroplossing. Incubeer het weefsel in X-gal oplossing 4 uur voor verdere verwerking en inbedding.
- Stop de reactie door het wassen van weefsels in 3% dimethylsulfoxide-PBS. Spoelen in PBS, 3 maal gedurende 5 minuten elk wassen en opslag in 70% ethanol.
- Vul Petrischalen met een 1% agarose / PBS oplossing. Agarose laten stollen. Het gebruik van glas overdracht pipetten, plaatst het weefsel op agarose coated platen gevuld met PBS-oplossing. Fotograferen hele mounts met behulp van een dissectie microscoop. Selecteer de gewenste filter voor helderveld.
- Om beter te onderscheiden plaatsen van X-gal kleuring proces monsters voor paraffine inbedding en snijden. Leg monsters in fijne zeef cassettes.
- Te verwerken monsters voor paraffine inbedding gebruik van een geautomatiseerde processor en het opzetten van een korte cyclus als volgt: zes veranderingen van alcohol: 5 min eerste verandering en 3 min per elke resterende verandering. Drie wijzigingen van Xyleen: 5 min eerste verandering en 3 min komende twee wijzigingen. De voorgaande stappen worden uitgevoerd bij 30 ° C. Voer uiteindelijk drie veranderingen van paraffine bij 62 ° C: 25 min, 8 min en 5 min.
- Orient monsters voor inbedding tissue plat op de bodem van inbedding boot. toevoegen paraffine goed naar de inbedding boot te vullen. Koel onmiddellijk op koude plaat van het inbedden van station tot paraffine stolt. Verwijder blok aan het inbedden boot. Met behulp van een microtoom genereren 6 urn sreflecties. Mount hoofdstukken over voorbehandeld-dia's en droge dia's op dia warmere set bij 42 ° C gedurende 1 uur.
- Bak dia's 's nachts in de oven op 56 ° C. Plaats de dia's in racks. Deparaffinize dia's met drie veranderingen van 100% Xyleen, 10 min elk. Gebruik kleuring schotels gevuld met 200 ml xyleen.
- Rehydrateren slides via gegradeerde serie EtOH (100%, 70%, 50% en 30%, 1 min per stap) PBS voordat tegenkleuring met Nuclear Fast Red gedurende 10 tot 30 sec. Spoel de dia's met leidingwater driemaal gedurende 5 minuten elke keer om meer dan Nuclear Fast Red verwijderen.
- Dehydrateer objectglaasjes in een gegradeerde reeks EtOH (50%, 70% en 100% EtOH) voor het wassen in drie verse xyleen (20 dips elke wijziging) en deksel glijden met xyleen gebaseerd fixeermiddelen.
2. lectine kleuring
- Ontleden E13.5 en E14.5 tracheale longweefsel, zoals beschreven in de stappen 1,1-1,4. Het gebruik van glas overdracht pipetten plaats weefsel in schroefdop flesjes. Fix tracheale longweefsel met 2 ml2% PFA oplossing overnacht bij 4 ° C. Na fixatie afspoelen monsters in PBS driemaal gedurende 10 minuten per wasbeurt.
- Bereid blokkeerbuffer, gewoonlijk een eindvolume van 10 ml oplossing. Voeg 0,1 g BSA (1%) tot 8 ml PBS. Laat BSA op te lossen. Voeg 0,2 ml geit serum (2%) 0,03 ml Triton X-100 (0,3%). Breng uiteindelijke volume tot 10 ml met PBS. Blok monsters gedurende 1 uur in 0,5 ml blokkerende buffer bij kamertemperatuur.
- Verwijderen blokkerende buffer met behulp van een pipet en vervangen door lectine oplossing bestaande uit 50 ug / ul lectine, 10% geit serum en PBS. Gebruik 250 ul lectine oplossing per monster. Incubeer overnacht bij 4 ° C. Zorg ervoor dat de glazen flacon met weefsel met aluminiumfolie bedekken. Na incubatie met lectine, spoel monsters in PBS driemaal gedurende 10 minuten.
- Plaats explantaten in agarose gecoate platen met PBS genoeg om monsters te dekken. Fotograferen whole mounts behulp van een fluorescentie microscoop ontleden. Selecteer de appropriate filter om fluorescentie te detecteren. Lectine PNA wordt gewoonlijk gekoppeld aan GFP.
3. Hele Mount immunofluorescentiekleuring en confocale microscopie
- Isoleer tracheale longweefsel, transfer naar 4 ml glazen schroefdop flesjes en bevestig overnacht in 4% PFA. E11.5 weefsel kan in 2% PFA worden vastgesteld. Store in methanol 100%. Monsters kunnen tot enkele maanden worden bewaard bij -20 ° C.
- Verwijder methanol met behulp van de overdracht pipet en permeabilize monsters met behulp van Dent's Bleach (4 delen methanol, 1 deel DMSO en 1 deel 30% H 2 O 2) gedurende 2 uur. Hydraat weefsel in een gegradeerde reeks methanol verdund in PBS als volgt: 100% methanol, 75% methanol, 50% methanol, 25% methanol, 100% PBS. Incubeer 10 min bij kamertemperatuur gedurende elke stap van hydratatie.
- Blok weefsel in 0,5% blokkerend reagens verdund in PBS (zie Materialen voor details) gedurende twee uur bij kamertemperatuur onder roeren.
- Verdun primair antilichaam in het blokkerenoplossing (SOX9 1: 100, Nkx2.1 1: 200, αSMA 1: 250) en incubeer de monsters gedurende de nacht bij 4 ° C. Spoelmonsters met PBS vijfmaal bij kamertemperatuur. Voer elke wasbeurt gedurende 1 uur.
- Toepassen secundair antilichaam bij een 1: 500 verdunning in 0,5% blokkeeroplossing. selecteer secundaire antilichamen zorgvuldig binding tussen de secundaire antilichamen te voorkomen. Incubeer overnacht bij 4 ° C in een donkere kamer. Spoelmonsters driemaal gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Uitdrogen monsters in een gegradeerde reeks methanol verdund in PBS als volgt: 25% methanol, 50% methanol 75% methanol, 100% methanol, 10 min elke stap.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de monsters blijven afgedekt met aluminiumfolie en de blootstelling te minimaliseren aan het licht. Weefsel kan nu worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende enkele weken tot gefotografeerd. - Transfer monsters om op maat gemaakte stadium platen, verwijder methanol en duidelijk met ongeveer 200 ul van heldere oplossing Murray's 19,20 (2 delen Benzylbenzoaat, 1 deel Benzylalcohol) onmiddellijk beferts beeldvorming. Fotograferen met een confocale microscoop. Verwerken en analyseren van beeld met beeldbewerkingssoftware.
4. Cell Proliferation
- Injecteer E11.5 zwangere muizen intraperitoneaal met een oplossing van BrdU in een concentratie van 100 ug BrdU / g lichaamsgewicht. Offer vrouwelijke zoals beschreven in hoofdstuk 1 van het protocol en isoleren van embryo's in E12.5 en E13.5. Met behulp van messen, accijnzen hoofden en het onderste deel van het lichaam onder de borstholte.
- Plaats thoracale weefsel in 4 ml schroefdop flesjes en lossen in 1 ml van 4% PFA 's nachts. Spoelmonsters met PBS tweemaal gedurende 5 min en dehydrateren monsters via een ethanol reeks verdund in gedestilleerd water tot 70% ethanol als volgt: 30%, 50% en 70% ethanol, gedurende 5 minuten elke stap.
- Leg monsters in middelgrote scherm cassettes. Werkwijze weefsel voor paraffine inbedding en het gebruik van geautomatiseerde processor. Stel een cyclus als volgt: zes veranderingen van alcohol 8 minuten elk, drie veranderingen van xyleen gedurende 6 min elk, drie cijzigingen van paraffine, gedurende 25 minuten, 9 minuten en 8 min.
- Insluiten in paraffine oriënteren het weefsel in de gewenste positie om 6 pm dwarse of longitudinale secties te genereren zoals beschreven in hoofdstuk 1. Plaats secties op dia's en laat het weefsel te houden aan te schuiven op dia warmere set bij 42 ° C gedurende 1 uur.
- Bak dia's, op hun kant, 's nachts in de oven op 56 ° C. Plaats de dia's in plastic rekken. De-paraffinize dia's door onderdompeling in drie veranderingen van 100% Xyleen, 10 min per wissel. Gebruik 200 ml xyleen om dia's volledig onder te dompelen. Rehydrateren slides via gegradeerde serie EtOH (100%, 70%, 50% en 30%, 5 min per stap onder roeren) tot PBS (5 min).
- Voeren antigeenterugtrekking middels 10 mM citraatbuffer, pH 6 Aan 100 ml van citraatbuffer mengsel 18 ml 0,1 M citroenzuur monohydraat en 82 ml 0,1 M Natriumcitraat bereiden.
- Leg monsters in plastic Coplin potten gevuld met antigen retrieval oplossing en een magnetron voor 6,5 minuten bij een hoog vermogen. dis toevoegenbebouwd water naar Coplin jar ter compensatie van verdampt-citraatbuffer en opwarmen bij 40% vermogen voor 6 min.
- Vul Coplin pot naar boven met water, en opnieuw opwarmen bij 40% vermogen voor 6 min. Magnetron tijden kunnen variëren op basis van microgolf gebruikt.
- Laten afkoelen objectglaasjes 20 minuten bij kamertemperatuur vóór het wassen glaasjes in gedestilleerd water gedurende 1 minuut, gevolgd door PBS gedurende 5 minuten. Na de PBS wassen, blok dia's voor 2 uur in het blokkeren van oplossing met TBS (2,425 g Tris base en 8,765 g NaCl verdund in 1 liter gedestilleerd water) 10% Donkey serum en 1% BSA.
- Voeg primaire antilichamen verdund in blokkeeroplossing (TBS dat 10% ezel serum en 1% BSA). BrdU (mitose marker), Nkx2.1 (luchtwegen epitheel), SOX9 en αSMA (gladde spiercellen) (cellen die zal leiden tot kraakbeen te geven). Incubeer dia overnacht bij 4 ° C. Gebruik overlay methode om antilichamen te besparen. Solliciteer 180 ul van antilichaam tegen een pakking en bevestig slide alsof dekglasping.
- Maak pakking door dompelen dia's in gedestilleerd water. Na verwijdering van de afdichting, was gebonden primaire antilichaam door het uitvoeren van zes 5 min wassingen met TBS dat 0,1% Tween-20.
- Incubeer dia's met secundair antilichaam verdund in blokkeeroplossing bij een verdunning van 1: 200, gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Selecteer secundaire antilichamen zorgvuldig om ongewenste binding tussen hen te voorkomen. Verwijder ongebonden secundair antilichaam door het uitvoeren van drie vijf minuten wassen met TBS dat 0,1% Tween.
- Wassen slides in 0,1 M Tris-base tweemaal gedurende 5 minuten en daarna 0,05 M Tris-base tweemaal gedurende 5 minuten. Slides kunnen worden achtergelaten in 0,05 M Tris-base tijdens coversliping middels fixeermiddelen met of zonder DAPI (1,5 ug / ml). Store dia's in slide folder bij 4 ° C en beschermen tegen licht door het bedekken map met aluminiumfolie.
- Visualiseer kleuring en een foto met behulp van een geautomatiseerde fluorescentiemicroscoop. Count-gelabelde cellen en de totale cellen per veld gefotografeerd bij20X en 40X verhoudingen van prolifererende cellen tot totale cellen te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wnt / β-catenine activiteit
Whole mount Lac-Z kleuring werd gedetecteerd in tracheale-longweefsel van embryo geïsoleerd uit reporter Axin2 Lac -Z muizen 11. Sites van kleuring geven Wnt / β-catenine-activiteit. Analyse van de secties van de hele berg kleuring vastgesteld dat Wnt / β-catenine-activiteit aanwezig is in het mesenchym van de luchtpijp en in mesenchym van de perifere regio's van de ontwikkeling van de longen was. In WlsShhCre embryo (waarin secretie van Wnt liganden van het epitheel van de luchtwegen werd ingetrokken) werd Lac-Z kleuring bijna afwezig (figuur 1).
Mesenchymale verdichtingen in tracheale mesenchym
Een cruciale stap in het chondrogenese is het proces waarbij mesenchymale cellen gedoemd om r te gevenise te condenseren kraakbeen. Deze strakke combinaties van cellen staan bekend als mesenchymale verdichtingen. Om te testen of het gebrek aan kraakbeen waargenomen in WlsShhCre muizen was te wijten aan een gebrek aan mesenchymale verdichtingen, tracheale longweefsel van zwangerschapsduur leeftijden E12.5 naar E14.5 werden gekleurd met PNA lectine. Bij E13.5 en E14.5, werd fluorescentie gedetecteerd als periodieke bereiken in de tracheale mesenchym op plaatsen waar kraakbeen zal worden gevormd. Gebrek aan detecteerbare fluorescentie in de tracheale weefsel van WlsShhCre embryo blijkt dat endodermale Wnt signalering naar de tracheale mesenchym nodig mesenchymale verdichtingen (figuur 2) is.
Luchtwegen celspecificatie
Hele mount immunofluorescentie van tracheale longweefsel bepaald de expressie patroon van SOX9, Nkx2.1 en αSMA op E11.5. In het tracheale weefsel, SOX9 expressie limieted het mesenchym van de trachea als een continue strook (pijl in figuur 3A en B), terwijl in de derde long SOX9 waargenomen aan de omtrek van het luchtwegepitheel (pijlpunten in Figuur 3A, B en C). Nkx2.1 presenteert een duidelijk expressiepatroon beperkt tot het epitheel van de trachea van de long. Voorkomen secretie van Wnt liganden van epitheel veroorzaakt verminderde expressie van SOX9 in tracheale mesenchym maar heeft geen invloed SOX9 expressie in perifere longepitheel. Expressie van αSMA niet gemakkelijk gedetecteerd in tracheale mesenchym, werd echter kleuring waargenomen op het niveau van de larynx (gele pijl, figuur 3) en de maag (figuur 3).
celproliferatie in ontwikkeling trachea
Proliferatie in epitheel en mesenchymvan de luchtpijp werd gedetecteerd na in vivo labeling van weefsel met BrdU. Delen van tracheale weefsel werden gekleurd met antilichamen die BrdU, SOX9 en αSMA. De proliferatie-profiel in de trachea mesenchym geeft aan dat de niveaus van SOX9 gekleurde cellen ondergaan proliferatie hoger dan het niveau van αSMA gekleurde cellen ondergaan proliferatie. Deze proliferatie patroon lijkt te worden terug WlsShhCre trachea (figuur 4).
Figuur 1: Wnt / β-catenine activiteit werkzaam in tracheale mesenchym E13.5 tracheale longweefsel, geïsoleerd uit Axin2-LacZ en WlsShhCre. Axin2-LacZ muizen werden gekleurd met X-gal (A en B). Delen van tracheale longweefsel werden tegengekleurd met snelle rode (A ', B'). Let op het ontbreken van X-galkleuring in WlsShhCre; Axin2-Lac-Z muizen demonstreren afwezigheid van Wnt / β-catenine-activiteit (B '). E14.5 weefsel van Axin2 LacZ muizen gekleurd met X-gal toont plaatsen van toekomstige kraakbeen ringen (C); was echter Axin2 activiteit beperkt tot de periferie (pijlpunt) van de mesenchymale verdichtingen (pijl) (D). Schaalbalk A, B en C = 500 urn; B ', D' en D = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. Mesenchymale condensatie in ontwikkelingslanden tracheaweefsel E13.5 tracheale long explantaten werden gekleurd met PNA lectine. Controle tracheale weefsel beeltenis van de regio's waren mesenchymale cellen gecondenseerd wordt getoond (pijlen A C). Geen mesenchymale verdichtingen werden gedetecteerd in WlsShhCre muizen (B en pijl in D). C en D tonen lagere vergroting van tracheale-longweefsel getoond in A en B. Schaal bar A en B = 1 mm; C en D = 2 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Expressie patroon in prechondrogenic hele mount luchtpijp Nkx2.1 en SOX9 kleuring werd waargenomen in E11.5 explantaten.. Paneel A toont een afbeelding van een controleweefsel, terwijl paneel B toont een doorsnede van een optisch 20 urn controleweefsel. Let op het gebrek aan mesenchymale expressie van SOX9 in WlsShhCre weefsel (pijl in C), but onderhoud van perifere expressie van SOX9 (pijlpunt in C). αSMA kleuring werd gedetecteerd op lage niveaus trachealmesenchyme van E11.5 weefsel maar waargenomen in de larynx gebied (gele pijlpunt in D en E), maag (S) en de resterende hartweefsel (CT) (E). Nkx2.1 wordt uitgedrukt in epitheel ontwikkelen luchtpijp en longen (D, E). Schaal bar = 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4:. Cell proliferatie patroon in prechondrogenic mesenchym Delen van E13.5 embryo's werden gekleurd met anti BrdU, SOX9 en αSMA antilichaam. Panelen C en D zijn sterkere vergrotingen van A B respectievelijk. De gestippelde lijnen geven grenzen van het tracheale epitheel. Opmerking SOX9 gekleurde proliferatieve cel (pijlpunt C) en αSMA gekleurd proliferatieve cel (pijlpunt in D). T = luchtpijp, E = slokdarm. Schaal bar A en B = 50 pm, C en D = 20 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gebeurtenissen achter de morfogenese van de luchtwegen worden niet volledig begrepen, met name de voor de patroonvorming van de geleidende luchtwegen processen. Eerdere studies hebben ex vivo technieken, waarbij de ontwikkeling van explantaten worden gekweekt in de lucht-vloeistof interfase of ingebed in Matrigel 21,22 benut. Deze studies hebben aangetoond hoe groeifactoren de patroonvorming van de ontwikkeling trachea en de vorming van tracheale kraakbeen beïnvloeden. Een beperking van deze studies is dat de architectuur van het weefsel niet werd aangehouden en daarom kunnen zij niet helemaal herhalen het in vivo proces van chondrogenese.
De benadering die nodig was van- wege de rol van Wnt signalering in het uitvoeringsproces van luchtwegen bestuderen patroonvorming in vivo studies gekoppeld ganse berg kleuringstechnieken, immunofluorescentie en beeldvorming. X-gal kleuring van ganse berg weefsel gevolgd door sectioning en contra-kleuring, biedt voordelen ten opzichte van de kleuring van paraffine secties. Whole mount kleuring zorgt voor directe detectie van sites waar Wnt / β-catenine-activiteit werkzaam is. Verder snijden van de gekleurde explantaten bepaald precieze locaties in het mesenchym, waarbij de activiteit werd gevestigd als ontwikkeling vorderde. De laatste is een betere en nauwkeurige uitlezing dan detectie van expressie van β-galactosidase enzym in paraffinecoupes. Terwijl enzymatische activiteit in secties kan worden gedetecteerd, zal deze procedure vriescoupes die niet altijd eenvoudig te genereren en kan de architectuur van kleine monsters niet behouden vereist. Een beperking in de in dit document beschreven protocol, is dat de verwerking van de monsters voor het inbedden in paraffine na ganse berg kleuring zal een verlies van het signaal veroorzaken. Daarom moeten monsters langer in X-gal oplossing blijven en een kortere cyclustijd voor het inbedden in paraffine worden gebruikt om goed signaal te verkrijgen over secties.
Anderzijds, ganse berg immunofluorescentie procedure gewijzigd na de door Ahnfelt-Ronne 23 techniek toegestaan driedimensionale visualisatie van het ontwikkelen en tracheale longweefsel, met een gedefinieerde expressiepatroon van eiwitten waarvoor belangrijke transcriptiefactoren zoals Nkx2.1 en SOX9. Indien gewenst kan de gehele mount kleuring worden gepresenteerd als confocale-aided z stapels afbeeldingen, voorstellende verschillende diepten van de tracheale longweefsel. Terwijl beeldvorming kleine explantaten moet clearing van het weefsel wordt uitgevoerd in een fase plaat. We gebruik gemaakt van dikke metalliccustom made podium platen met optische bodem, waar monsters worden gewist en afgebeeld. Dit voorkomt het verlies van materiaal tijdens de overdracht van kleine weefsel na het wissen stap. Terwijl de hele mount immunofluorescentie is een geschikte techniek voor het kleuren van kleine weefsel, we erkennen beperkingen aan de techniek. In het bijzonder, zagen we ongelijke prestaties van antilichamen die antigeen beter in secties te herkennen in tegenstelling tot de ganse berg. Dit probleem kan de prestaties van de techniek in de weg als er geen alternatieve antilichamen beschikbaar zijn. Het is ook mogelijk dat het gebruik van methanol en open plek Murray duidelijk een negatief effect op het signaal waargenomen kan hebben. In de toekomst, zullen wij andere niet-organische clearing oplossingen te testen en stel de juiste protocol hiervoor 24. Een laatste overweging is dat hele berg de studie van enkele eiwitten tot expressie gebracht in een weefsel op een gegeven moment zal toestaan.
Vorige rapporten hebben het nut van de getoondePNA lectine kleuring om mesenchymale verdichtingen te detecteren in delen van tracheale weefsel 21,25. In deze studie rapporteren we een methode waarbij de kleuring werd uitgevoerd in ganse berg, die een betere visualisatie van de gebieden van de trachea vergemakkelijkt waarbij het kraakbeen worden gevormd. Tijdens het uitvoeren lectine kleuring zorg met de juiste concentratie lectine niet overdreven vlek worden geplaatst zoals commercieel verkrijgbaar PNA-lectine gekoppeld aan GFP. Auto-fluorescentie van het weefsel kunnen de resultaten verhullen die moeilijk banden die overeenkomen met verdichtingen mesenchymale onderscheiden.
Tenslotte, in vivo labeling weefsel met BrdU gevolgd door snijden en immunofluorescentiekleuring een haalbare techniek om celproliferatie die voordelen boven statische typische en vlekken zoals PPh3 of PCNA 26,27 weer vast. De laatste techniek stelt beperkingen kunnen vlekken variëren afhankelijk van decelcyclus podium. Dit probleem wordt geëlimineerd door ons beschreven techniek. Combineren vivo labeling gevolgd door inbedden, snijden en immunofluorescentie konden we vaststellen dat epitheliale Wnt liganden balans van de differentiële proliferatie van SOX9 en α-SMA expressie brengende cellen die leiden tot tracheale kraakbeen en spier 7 geeft.
Kortom, een multiple-techniek benadering bestuderen van de patroonvorming van de ontwikkeling luchtwegen maakt een diepgaande analyse van de rol van Wnt-signalering in geleidende luchtwegen morfogenese. Deze studies bepaalden de precieze plaatsen van Wnt / β-catenine in de tracheale weefsel, evenals inductieve en leerzaam signalering door het tracheale epitheel dat nodig is voor specificatie differentiële proliferatie van tracheale mesenchym cellijnen, evenals kraakbeenvorming. Onze toekomstige richtingen onder de optimalisatie van de hele berg kleuring voor recent geïdentificeerde Wlsdoelwitgenen, en tevens met ganse berg immunofluorescentie in combinatie met lectine kleuring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
"De auteurs hebben niets te onthullen."
Acknowledgments
Wij erkennen de hulp van Mike Muntifering en Matt Kofron met confocale beeldvorming en Gail Macke met histologische procedures. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health-NHLBI (K01HL115447 DS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti Sox9 ab. | Millipore | AB5535 | 1:400 , rabbit |
| Anti Sox9 ab. | Santa Cruz | Sc-20095 | 1:50, rabbit |
| Anti Smooth Muscle Actin ab. | Sigma | A5228 | 1:2k, mouse |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:100, guinea pig |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:400, mouse |
| Anti Brdu ab. | Abcam | AB1893 | 1:200, sheep |
| Anti Brdu ab. | Santa Cruz | Sc-32323 | 1:4k, mouse |
| PNA Lectin | Sigma | L 7381 | |
| Secondary antibodies | Life technologies | Alexa fluor Molecular probes | |
| K3Fe(CN)6 | Sigma | P8131 | |
| K4Fe(CN)6 | Sigma-Aldrich | P3289 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| NaDOC | Life Technologies | 89905 | |
| NP4O | Life Technologies | 85124 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A-3157 | |
| Fisher brand super-frost plus | Fisher | 12-550-15 | |
| PFA (16%) | EMS | 15710 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | |
| Fetal Calf Serum | Sigma | 11K413 | |
| Blocking reagent | Invitrogen | Component of TSA kit #2 ( T20932) | |
| BrDu | Sigma | B5002-5g | |
| Vectashield mounting medium | Vector labs | H-1000 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Tissue-loc cassettes Histoscreen | Fisher | C-0250-GR | |
| Biopsy cassettes | Premiere | BC0109 | Available in different colors |
| Nuclear fast red Kernechtrot 0.1% | Sigma | N3020 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-500G | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | S4641-1Kg | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T5941-500G | |
| Xylene | Pharmco-AAPER | 399000000 | |
| Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Micro knives | FST | 10318-14 | |
| Dumont #5 ceramic coated | FST | 11252-50 | |
| Dumont #5CO | FST | 11295-20 | |
| Dumont # 5 | FST | 91150-20 | |
| Thermo/Shandon Excelsior ES | Thermo Fisher | ||
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Nikon i90 | Nikon | Wide field microscope | |
| NikonA1Rsi | Nikon | Confocal microscopy. Settings:NikonA1 plus camera, scanner: Galvano, detector:DU4. Optics Plan Apo lambda 10X. Modality: Widefield fluorescence laser confocal. | |
| Leica MS 16 FA | Leica | Fluorescence Dissecting microscope | |
| Zeiss | Zeiss | Automated fluorescence microscope | |
| Leica Application suite | Leica | Leica imaging software | |
| NIS | Nikon | Nikon imaging software | |
| IMARIS | Bitplane | Imaging processing software |
References
- Maeda, Y., Dave, V., Whitsett, J. A.
- Morrisey, E. E., Hogan, B. L. Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development. Dev Cell. 18, 8-23 (2010).
- Fausett, S. R., Klingensmith, J. Compartmentalization of the foregut tube: developmental origins of the trachea and esophagus. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, 184-202 (2012).
- Goss, A. M., et al. Wnt2/2b and beta-catenin signaling are necessary and sufficient to specify lung progenitors in the foregut. Dev Cell. 17, 290-298 (2009).
- Harris-Johnson, K. S., Domyan, E. T., Vezina, C. M., Sun, X. beta-Catenin promotes respiratory progenitor identity in mouse foregut. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 16287-16292 (2009).
- Cornett, B., et al. Wntless is required for peripheral lung differentiation and pulmonary vascular development. Dev Biol. 379, 38-52 (2013).
- Snowball, J., Ambalavanan, M., Whitsett, J., Sinner, D. 34;Endodermal Wnt signaling is required for tracheal cartilage formation". Dev Biol. , (2015).
- Shannon, J. M., Hyatt, B. A.
- Shannon, J. M., Nielsen, L. D., Gebb, S. A., Randell, S. H. Mesenchyme specifies epithelial differentiation in reciprocal recombinants of embryonic lung and trachea. Dev Dyn. 212, 482-494 (1998).
- Li, C., et al. Wnt5a regulates Shh and Fgf10 signaling during lung development. Dev Biol. 287, 86-97 (2005).
- Loscertales, M., Mikels, A. J., Hu, J. K., Donahoe, P. K., Roberts, D. J. Chick pulmonary Wnt5a directs airway and vascular tubulogenesis. Development. 135, 1365-1376 (2008).
- Yin, Y., et al. An FGF-WNT gene regulatory network controls lung mesenchyme development. Dev Biol. 319, 426-436 (2008).
- Shu, W., et al. Wnt/beta-catenin signaling acts upstream of N-myc, BMP4, and FGF signaling to regulate proximal-distal patterning in the lung. Dev Biol. 283, 226-239 (2005).
- Bretholz, A., Morrisey, R., Hoffman, R. S. The use of OpdA in rat models of organic phosphorus (OP) poisoning. Toxicology. 257, (2009).
- Goss, A. M., et al. Wnt2 signaling is necessary and sufficient to activate the airway smooth muscle program in the lung by regulating myocardin/Mrtf-B and Fgf10 expression. Dev Biol. 356, 541-552 (2011).
- Mucenski, M. L., et al. beta-Catenin is required for specification of proximal/distal cell fate during lung morphogenesis. J Biol Chem. 278, 40231-40238 (2003).
- Hyatt, B. A., Shangguan, X., Shannon, J. M. FGF-10 induces SP-C and Bmp4 and regulates proximal-distal patterning in embryonic tracheal epithelium. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L1116-L1126 (2004).
- Del Moral, P. M., et al. VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis. Dev Biol. 290, 177-188 (2006).
- Ott, S. R. Confocal microscopy in large insect brains: zinc-formaldehyde fixation improves synapsin immunostaining and preservation of morphology in whole-mounts. J Neurosci Methods. 172, 220-230 (2008).
- Jahrling, N., Becker, K., Dodt, H. U. 3D-reconstruction of blood vessels by ultramicroscopy. Organogenesis. 5, 145-148 (2009).
- Park, J., et al. Regulation of Sox9 by Sonic Hedgehog (Shh) is essential for patterning and formation of tracheal cartilage. Dev Dyn. 239, 514-526 (2010).
- Elluru, R. G., Thompson, F., Reece, A. Fibroblast growth factor 18 gives growth and directional cues to airway cartilage. Laryngoscope. 119, 1153-1165 (2009).
- Ahnfelt-Ronne, J., et al. An improved method for three-dimensional reconstruction of protein expression patterns in intact mouse and chicken embryos and organs. J Histochem Cytochem. 55, 925-930 (2007).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
- Gillotte, D. M., Fox, P. L., Mjaatvedt, C. H., Hoffman, S., Capehart, A. A. An in vitro method for analysis of chondrogenesis in limb mesenchyme from individual transgenic (hdf) embryos. Methods Cell Sci. 25, 97-104 (2003).
- Cohen, E. D., et al. Wnt signaling regulates smooth muscle precursor development in the mouse lung via a tenascin C/PDGFR pathway. J Clin Invest. 119, 2538-2549 (2009).
- Boucherat, O., et al. Partial functional redundancy between Hoxa5 and Hoxb5 paralog genes during lung morphogenesis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 304, L817-L830 (2013).
