Summary
全体のマウントと切片染色に連結されたレポーターマウスの使用、顕微鏡およびin vivoアッセイは、気道の正常なパターニングのメカニズムの解析を容易にします。ここでは、これらの技術は気管開発中のWntシグナル伝達の解析にどのように貢献したかを説明します。
Introduction
気道の開発は腹側内胚葉の前腸1,2におけるNkx2.1陽性細胞の出現と日胚9（E9）により開始されます。管は別個のエンティティとして区別することができるときに食道・気管チューブ分離は、E11.5によって間葉組織3で囲まれたを解決します。 Wntシグナル伝達は、肺の発育不全4,5になります内胚葉気道上皮からの内臓間葉とβカテニンの欠失によって表現さWNT2とWnt2bの削除など気道の仕様に重要な役割を果たしています。我々の以前の研究では、肺の発育不全における内胚葉気道結果から、肺血管の開発および気管間葉6,7の誤パターニングの欠陥をWLSの削除、すべてのWntリガンドの分泌を媒介する貨物の受容体を決定しました。これらのデータは、上皮間葉CROの重要性をサポートそれはまた、他の研究8,9に示されているように、SSは、細胞分化および仕様で話します。
肺の開発の初期段階の研究では、私たちはより良い呼吸アイデンティティ10-16を駆動する機構を理解することができましたvitroおよびex vivoの技術では、遺伝的に依存しています。空気液体間期における全肺外植片培養物を広く形態形成10,17,18に分岐肺の初期段階での成長因子の効果を研究するために利用されています。この方法は、形態素など分枝形態形成などの変更、および遺伝子発現調節の読み出しとして使用されているが、それは文化そのものが血管系17の開発をサポートしていないとして、発達過程の初期段階の研究に限定されています。気管軟骨の発達は、この培養技術と互換性がないとすることができる、より長いインキュベーション時間を必要とします。
アナライザーへ電子気道形成中のWntシグナル伝達の役割は、私たちは、胚の研究のニーズを満たすために、標準的な技術を適応しています。我々は、気管・肺組織の清算のためのパラフィン包埋し、タイミングのためにボリューム、染色倍、処理サイクルを変更しました。本研究に記載された技術の最適化の主な目的は、E14.5までE11から行わマウスにおける気管開発の初期段階を分析することでした。レポーターマウスラインAxin2LacZ開発気管間充織におけるWnt /βカテニン活性を、我々正確に決定部位を使用して。また、全体のマウント気管組織のためのレクチン染色法を適応しています。したがって、我々は、間葉系縮合を視覚化し、軟骨形成が行われる部位を予測することができました。高度な顕微鏡技術と相まって、全体のマウントとWlsShhCreのマウスから得られた胚組織の切片の染色は、私たちはTRAによって生成されたWntリガンドの役割を明らかにするために許可されました気管パターニングでCHEAL上皮。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
動物を無菌条件下で飼育しました。マウスはCCHMC施設内動物管理使用委員会（オハイオ州シンシナティUSA）によって承認されたプロトコルに従って取り扱われました。これらの研究を通して利用したマウスは混合バックグラウンドで維持しました。
1.ホールマウントX-ガラクトシダーゼ染色
- CO 2吸入によって、E14.5にE11.5で妊娠中の女性を安楽死させます。 、CO 2室で動物を置き、CO 2でチャンバーを充電。 5分間の最低室で動物を維持します。頚椎脱臼により安楽死の二次方法を実行します。
- エタノール（エタノール）70％と、単一の腹部正中切開で開腹術を行うときれいな腹部領域。手術用ハサミと標準パターン（ストレート鋸歯状）鉗子を利用します。
- 鉗子と細かいハサミを使用して子宮角を分離し、直ちに冷却したPBS溶液を含むペトリ皿に組織を配置します。先に進むまで氷上で組織を維持胚を単離します。
- 子宮角から胚を分離します。解剖顕微鏡を使用して、胚気管肺組織を分析。胚を放出子宮組織とconceptiを保持し、穿刺する先端の細いピンセットやハサミを使用しています。
- 残りの胚膜を削除します。針刃の支援を受けて胚および横隔膜下の下半身部分の頭をカット。ランドマークとして、肝臓の位置を確認します。
- 胚の胸部の単離後、針の刃を使用して、体壁、脊椎、心臓の側面を除去するために進んでください。気管組織を傷つける避けるために心を除去しながら注意してください。最後に、慎重に、針の刃の支援を受けて食道を引いて、気管から食道を分離します。氷上のPBS溶液中で組織を維持します。
- 4ミリリットル中に組織を置き、ガラスを使用して、キャップバイアルまたは転送ピペットをねじ込みます。 30分間、PBS中の4％パラホルムアルデヒド（PFA）で気管肺組織を修正しました。固定後、PBSで組織をすすぎます。すすぎながら、X-gal染色溶液（5mMのK 3のFe（CNを追加）6を、（100μlの0.5 Mストック）5 mMのK 4のFe（CN）6（100μlの0.5 Mストック）2のMgCl 2、（準備20μlの1 Mストック）0.01％NaDOC（50μlの2％ストック）、0.02％NP 4 O（100μlの2％ストック）、1mg / mlのX-galを（20 mg / mlでストック500μlの）および9.13ミリリットル10mlの最終容量）をもたらすために蒸留水。
- 残りのPBSを削除し、ガラスバイアルにX-gal染色溶液の2ミリリットルを追加します。シェーカー上トレイにバイアルを置きます。 X-gal染色溶液で染色組織1~2時間。さらに処理および埋め込みのために4時間のX-gal溶液中で組織をインキュベートします。
- 3％のジメチルスルホキシド-PBSで組織を洗浄することによって反応を停止させます。 5分間、PBS中の70％エタノール中で各洗浄や店舗を3回すすいでください。
- 1％アガロース/ PBS溶液でペトリ皿を埋めます。アガロース固化することを可能にします。ガラス転移ピペットを用いて、アガロース共同で組織を配置PBS溶液で満たされたatedプレート。解剖顕微鏡を使用して全体のマウントを撮影。明のための適切なフィルタを選択します。
- 優れたパラフィン包埋し、切片用のX-gal染色処理サンプルのサイトを区別するために。細かい画面カセットでサンプルを置きます。
- 自動化されたプロセッサを使用するパラフィン包埋のためにサンプルを処理し、次のように短い周期を設定するには：アルコールの6変更：5分最初の変更及び残りの各変化当たり3分。キシレンの三つの変化：5分最初の変更と3分次の二つの変更。前の手順は、30℃で実施されています。 25分、8分および5分：最後に、62℃におけるパラフィンの3変更を行います。
- ボートを埋め込むの底に平らに横たわっている組織で埋め込むための東洋サンプル。慎重に埋め込むボートを埋めるためにパラフィンを追加します。パラフィンが凝固するまで駅を埋め込むのコールドプレートにすぐに冷却します。ボートを埋め込むからブロックを削除してください。ミクロトームを用いて、6ミクロンのを生成ections。スライド上の前処理し、スライドやドライスライド上のマウント部1時間42℃で暖かいセット。
- 焼く56ºCのオーブンで一晩スライドします。ラックにスライドを置きます。脱パラフィンは、100％キシレンの3変化、10分ごとにスライドします。キシレンの200ミリリットルで満たされた皿を染色に使用します。
- 10〜30秒間核ファーストレッドで対比染色する前にPBSに段階的エタノールシリーズ（100％、70％、50％及び30％、工程ごとに1分間）を用いてスライドを再水和します。水道水で5分間の核ファストレッドの過剰を削除するたびに3回スライドを洗浄します。
- キシレンベースの取り付けメディアで滑る3キシレンの変化（20ディップそれぞれ変化する）と、カバー中で洗浄する前に段階的エタノールシリーズ（50％、70％および100％エタノール）でスライドを脱水。
2.レクチン染色
- ステップ1.4から1.1に記載されているようにE13.5とE14.5の気管肺組織を解剖。ガラス転送ピペットを使用すると、スクリューキャップバイアルに組織を配置します。 2mlで気管肺組織を修正しました。4℃で2％PFA溶液を一晩。固定後、PBSで10分間ずつ洗浄するための三回の試料をすすぎます。
- 緩衝溶液の10mlを、通常、最終容積を遮断準備します。 8mlのPBSにBSA（1％）の0.1グラムを追加します。 BSAが溶解することを可能にします。ヤギ血清（2％）トリトンX-100（0.3％）の0.03ミリリットルの0.2ミリリットルを追加します。 PBSで10ミリリットルに最終容量を持参。室温でブロッキング緩衝液の0.5ミリリットルで1時間ブロックサンプル。
- トランスファーピペットを使用して、ブロッキング緩衝液を除去し、レクチンのを50μg/μlの、10％ヤギ血清およびPBSで構成されるレクチン溶液と交換してください。サンプルあたりのレクチン溶液の250μlのを使用してください。 4℃で一晩インキュベートします。アルミホイルで組織を含有するガラスバイアルをカバーすることを確認します。レクチン溶液とインキュベートした後、10分間、PBS中で3回のサンプルをリンス。
- サンプルをカバーするのに十分なPBSを含むアガロースコーティングされたペトリ皿に入れ植。蛍光解剖顕微鏡を使用して全体のマウントを撮影。 appropを選択riateフィルタは、蛍光を検出します。レクチンPNAは通常、GFPに結合されています。
3.ホールマウント免疫染色および共焦点顕微鏡
- 4ミリリットルガラススクリューキャップバイアルに移し、4％PFAで一晩固定し、気管肺組織を分離します。 E11.5組織を2％PFAで固定することができます。メタノール中の100％を保管してください。サンプルは-20℃で数ヶ月まで保存することができます。
- トランスファーピペットを用いてメタノールを除去し、2時間デントのブリーチ（4部メタノール、1部のDMSOと1部の30％H 2 O 2）を用いて試料を透過。次のようにPBSで希釈したメタノールの段階的シリーズの水和物組織：100％メタノール、75％メタノール、50％メタノール、25％メタノール、100％PBS。水和の各ステップ中、室温で10分間インキュベートします。
- PBSで希釈した0.5％ブロッキング試薬でブロック組織攪拌しながら室温で2時間（詳細は材料を参照されたいです）。
- ブロッキング、一次抗体を希釈溶液（Sox9を1：100、Nkx2.1 1：200、αSMA1：250）と4℃で一晩サンプルをインキュベートします。室温でPBSでサンプルを5回洗浄。 1時間ごとの洗浄を行います。
- 0.5％のブロッキング溶液中で1：500希釈で二次抗体を適用します。二次抗体の間で結合を防止するために二次抗体を慎重に選択します。暗い部屋で4℃で一晩インキュベートします。洗浄サンプルを室温で20分間3回洗浄しました。 25％メタノール、50％メタノール75％メタノール、100％メタノール、10分で各工程を以下のようにPBSで希釈したメタノールの段階的な系列でサンプルを脱水します。
注：サンプルはアルミホイルで覆い、光への曝露を最小限に抑えるたままであることを確認してください。撮影されるまで、組織は現在、数週間4℃で保存することができます。 - カスタムメイドへの転送サンプルステージプレートは、マレーの透明な溶液19,20（2部安息香酸ベンジル、1部ベンジルアルコール）、直ちにBEFの約200μlのメタノールとクリアを削除します鉱石イメージング。共焦点顕微鏡を用いて写真。プロセスおよびイメージングソフトウェアを用いて画像を解析します。
4.細胞増殖
- 体重を100μgのBrdU / gの濃度でのBrdUの溶液で腹腔内E11.5妊娠マウスに注入します。 E12.5またはE13.5で胚を、プロトコルのセクション1で説明し、単離のように女性を生け贄に捧げます。ナイフの刃、消費税ヘッドや胸腔下の下半身を使用。
- 4ミリリットルキャップバイアルをねじで胸部組織を置き、一晩4％PFAの1ミリリットルで固定します。 5分間のPBSで2回洗浄サンプルを、以下のように70％エタノールを蒸留水までで希釈したエタノールの一連のサンプルを脱水：30％、50％および70％エタノールを、5分間、各ステップは。
- ミディアムサイズの画面カセットに入れサンプル。プロセッサを使用し、自動化されたパラフィン包埋のためのプロセスの組織。 8分間、アルコールの6変化、6分間、キシレンの3変化、3つのCを次のように周期を設定します25分、9分と8分間のパラフィンのhanges、。
- スライド上のセクション1.セクションで説明したように6ミクロンの横方向または縦方向のセクションを生成し、組織が1時間42℃でスライドウォーマーセットにスライドするように付着することを可能にする所望の位置に組織を配向パラフィンに埋め込みます。
- 一晩56℃のオーブンでその両側にスライドし、焼きます。プラスチック製のラックにスライドを置きます。 100％キシレンの3変化、変化当たり10分に浸漬することによって脱パラフィンを塗るスライド。完全にスライドを沈めるためにキシレンの200ミリリットルを使用してください。 PBS（5分）まで段階的エタノールシリーズ（100％、70％、50％および30％、攪拌しながらステップごとに5分）を用いてスライドを再水和します。
- 0.1 Mクエン酸の18ミリリットルは、一水和物、クエン酸緩衝液混合物の100ミリリットルと0.1 Mクエン酸ナトリウムの82ミリリットルを調製するために、10mMのにクエン酸緩衝液、pHが6を用いて、抗原回復を実行します。
- 高電力で6.5分間、抗原回収溶液とマイクロ波で満たされたプラスチック製のコプリンジャーに入れサンプル。 DISを追加6分間40％のパワーで蒸発させ、クエン酸緩衝液と再加熱を補償するために、コプリンジャーに水を耕作。
- 水でトップ、そして6分間、40％のパワーで再び再加熱するコプリンジャーを記入してください。マイクロ波の時間は、使用されるマイクロ波に基づいて異なる場合があります。
- スライドを5分間PBSに続いて、1分間蒸留水でスライドを洗浄する前に室温で20分間冷却してください。 PBS後TBS（トリス塩基の2.425 gの蒸留水1Lに希釈したNaClを8.765 g）を10％ロバ血清および1％BSAを含有するブロッキング溶液中で、2時間ブロックスライドを洗います。
- 溶液（10％ロバ血清および1％BSAを含むTBS）をブロックに希釈した一次抗体を加えます。 BrdU（有糸分裂マーカー）、Nkx2.1（気道上皮）、Sox9を（軟骨に上昇を与える細胞）およびαSMA（平滑筋細胞）。 4℃で、一晩スライドをインキュベートします。抗体を節約するために、オーバーレイメソッドを使用します。ガスケットへの抗体の180μLを適用した後、カバースリップかのようにスライドを取り付けpingを実行。
- 蒸留水にスライドを浸漬することによりガスケットを外します。ガスケットを除去した後、0.1％のTween-20を含むTBSで6 5分間の洗浄を行うことにより、未結合一次抗体を洗浄します。
- 室温で1時間、200：1の希釈でブロッキング溶液中に希釈した二次抗体を用いてスライドをインキュベートします。それらの間の望ましくない結合を防ぐために慎重に二次抗体を選択します。 0.1％のTweenを含むTBSで3 5分間洗浄を行うことにより、未結合の二次抗体を除去します。
- 5分間二回、0.1Mトリス塩基でスライドを洗浄し、5分間二回、その後0.05 M Tris塩基。またはDAPI（1.5 / mlの）せずに取り付けメディアを使用してcoverslipingながらスライドを0.05 Mトリス塩基のままになることがあります。 4℃でスライドフォルダに保管スライドとアルミホイルでフォルダを覆うことにより、光から保護します。
- 自動化された蛍光顕微鏡を用いて染色し、写真を視覚化します。標識細胞とで撮影フィールドあたりの全細胞を数えます20Xと40Xは、全細胞に増殖細胞の割合を決定します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wnt /βカテニン活動
ホールマウントラック-Z染色は記者Axin2 ラック -Zマウス 11から分離された胚の気管・肺組織で検出されました。染色のサイトは、Wnt /βカテニンの活性を示しています。全マウント染色のセクションの分析は、Wnt /βカテニン活性は気管の間充織における途上の肺の周辺領域の間充織に存在したと判断しました。 （気道の上皮からWntリガンドの分泌が抑制された前記）WlsShhCre胚ではラック-Z染色はほとんど存在しない（ 図1）でした。
気管間充織における間葉系縮合
軟骨形成における重要なステップは、間葉系細胞をrを与えることを運命づけられているプロセスであります軟骨凝縮に伊勢。細胞のこれらのタイトな集計は、間葉系縮合として知られています。 WlsShhCreマウスで観察された軟骨の欠如は、PNAレクチンで染色したE14.5に在胎齢のE12.5から間葉系縮合、気管肺組織が存在しないことによるものであったかどうかをテストします。 E13.5およびE14.5では、蛍光は軟骨が形成される部位での気管間充織の周期的なバンドとして検出されました。 WlsShhCre胚の気管組織における検出可能な蛍光の欠如は、気管間葉に内胚葉Wntシグナル伝達は、間葉系縮合（ 図2）のために必要であることを示しています。
気道細胞の仕様
全体気管肺組織の免疫蛍光をマウントE11.5でのSox9、Nkx2.1とαSMAの発現パターンを決定しました。気管組織では、Sox9発現は限界があります発展途上肺のSox9に気道上皮（ 図3A、B及びCの矢印ヘッド）の周辺で観察しながら連続ストライプ（ 図3AおよびBの矢印）として気管の間葉に編。 Nkx2.1は肺の気管の上皮に制限異なる発現パターンを示します。上皮からWntリガンドの分泌を防ぐことは気管間充織でのSox9の発現が減少を引き起こすが、末梢肺上皮でのSox9の発現に影響を与えません。 αSMAの発現を容易に気管間葉では検出されない、しかし、染色は喉頭（黄色の矢印、 図3）、胃（ 図3）のレベルで検出されました。
気管の開発における細胞増殖
上皮と間充織における増殖気管のBrdUを有する組織のin vivo標識後に検出されました。気管組織の切片を、BrdUを、のSox9およびαSMAを認識する抗体で染色しました。気管間充織における増殖プロフィールは、Sox9を染色された細胞のレベルは、増殖を起こしていることを示し、増殖を起こしαSMA染色された細胞のレベルよりも高いです。この増殖パターンはWlsShhCreの気管（ 図4）に戻っているようです。
図1のWnt /βカテニン活性は気管間充織で動作する Axin2-LacZおよびWlsShhCreから単離されたE13.5気管肺組織、：Axin2-LacZのマウスを、X-GAL（A及びB）で染色しました。気管肺組織の切片をファーストレッド（A '、B'）で対比染色しました。 X-galの欠如に注意してください。WlsShhCreで染色;のWnt /βカテニン活性（B '）が存在しないことを実証するAxin2-Lacの-Zマウス。 X-galで染色したAxin2のLacZマウスのE14.5組織は将来の軟骨環（C）の部位を示します。しかし、Axin2活性は、間葉系縮合（矢印）（D）の周辺部（矢印の頭）に制限されていました。スケールバーA、BおよびC = 500ミクロン; B '、D'およびD =100μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2： 気管組織を開発する間葉系結露 E13.5気管・肺外植片をPNAレクチンで染色しました。地域を描いた制御気管組織が示されている凝縮間葉系細胞であった（矢印A >、C）。いいえ間葉縮合は、（B及びDの矢印）WlsShhCreマウスにおいて検出されなかった。C及びDは、AとBに示し、気管、肺組織の低倍率を示します。スケールバーAおよびB = 1ミリメートル; C、Dは= 2ミリメートル。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 3： 発現パターンprechondrogenic全体では、気管 Nkx2.1とのSox9染色はE11.5外植片で検出されたマウント 。パネルBは、20ミクロンコントロール組織の光学部を示しているパネルAは、対照組織の画像を示しています。 WlsShhCre組織 （Cの矢印）でのSox9の間葉発現の欠如に注意してください、府Sox9の周辺表現のトンのメンテナンス（Cにアローヘッド）。 αSMA染色はE11.5組織のtrachealmesenchymeに低レベルで検出されたが、喉頭領域（DおよびE黄色矢印）、胃（S）及び残りの心臓組織（CT）（E）で観察されました。 Nkx2.1は、気管と肺（D、E）の開発の上皮で発現されます。スケールバー=10μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：prechondrogenic 間充織における細胞増殖パターン E13.5胚の切片を抗BrdUを、Sox9をとαSMA抗体で染色しました。パネルC及びDは、Aのより高い倍率でありますBそれぞれ。点線は、気管上皮の限界を表しています。 Sox9を染色し、増殖細胞（矢尻C）およびαSMA染色された増殖性細胞（Dにおける矢印）に注意してください。 T =気管、E =食道。スケールバーAおよびB = 50μmで、CおよびD =20μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
気道の形態形成の基礎となるイベントは、完全に、誘導気道のパターニングのために必要な、特にプロセスを理解されていません。以前の研究では、現像外植片が気液相間での培養またはマトリゲル21,22内に埋め込まれている、請求エキソビボ技術を利用しています。これらの研究は、成長因子は現像気管のパターニングおよび気管軟骨の形成にどのように影響するかを示しています。これらの研究の限界は、組織の構造が適切に維持されていないので、それらは非常に軟骨の生体内プロセスを再現しないことです。
我々は気道のパターニングを行う過程におけるWntシグナル伝達の役割を研究することを約束したアプローチは、全マウント染色技術、免疫蛍光およびイメージングと相まってin vivo試験に含まれています。全体のマウント・組織のX-gal染色は、それ自体が続きますctioningと対比染色、パラフィン切片の染色に勝る利点を提供します。ホールマウント染色は、Wnt /βカテニン活性が動作するサイトの直接検出を可能にします。また、染色された外植片の切片は、開発が進むにつれて活性が配置された前記間充織での正確な部位を決定しました。後者は、パラフィン切片におけるβガラクトシダーゼ酵素の発現の検出よりも優れた、正確な読み出しです。酵素活性は、セクションで検出することができるが、この手順は常に生成することが容易ではないだろうと小さなサンプルのアーキテクチャを保持しないことがあり凍結切片が必要になります。このホワイトペーパーで説明されたプロトコルでの制限は、信号の損失の原因となりますホールマウント染色後パラフィン包埋のための試料の処理です。したがって、サンプルは、X-galの溶液中に長く残るする必要がありますし、パラフィン包埋のためのより短いサイクルは、セクションに良好な信号を得るために使用されるべきです。
一方、Ahnfelt-レンネ23で記載された技術の後に変更された全載免疫蛍光手順は、例えば、Nkx2.1およびなどの主要な転写因子がコードするタンパク質の定義された発現パターンを、気管及び肺組織を開発する三次元可視化のために許可されましたSox9。所望であれば、ホールマウント染色は、気管、肺組織の異なる深さを示す、画像の焦点支援Zスタックとして提示することができます。小さな外植片を画像化する一方で、組織のクリアはステージプレートで行われるべきです。私たちは、厚い金属を利用しましたカスタムサンプルがクリアされ、結像される光下部にステージ板を作りました。ステップをクリアした後、小さな組織を転送しながらこれは、材料の損失を防ぎます。全体のマウント免疫蛍光は小さな組織の染色に適した技術であるが、我々は技術の限界を認めます。特に、我々は全体のマウントとは対照的に、セクションでより良い抗原を認識する抗体の非類似の性能を観察しました。何の代替抗体が用意されていない場合、この問題は、技術の性能を妨げることがあります。マレーの明確なメタノール及び決済の使用は、観測信号に負の影響を与えることも可能です。今後は、他の非有機決済ソリューションをテストし、この目的の24のために適切にプロトコルを調整します。最終的な考慮事項は、全体のマウントは1与えられた時間での組織で発現し、いくつかのタンパク質の研究を可能にするということです。
以前の報告は、の有用性を示していますPNAレクチン染色は、気管組織21,25のセクションで間葉系縮合を検出します。本研究では、我々は、染色は、軟骨が形成される、請求気管の地域のより良い可視化を容易に全体のマウントで実行されたことにより、方法論を報告しています。レクチン染色のケアを行っているが、市販のPNAレクチンは、GFPに連結されているようではなく、過剰染色にレクチンの適切な濃度を使用して配置する必要があります。組織の自家蛍光は、縮合を間葉系に対応するバンドを区別することが困難になる結果を曖昧にすることができます。
最後に、切片および免疫蛍光染色に続いてBrdUで組織のin vivo標識化は、PPh 3を又はPCNA 26,27などの典型的な静的な染色を上回る利点を提供する、細胞増殖を決定するための実行可能な技術です。後者の技術は、染色に依存して変化するように、制限を提示します細胞周期段階。この問題は、私たちの記載された技術によって除去されます。埋め込み切片および免疫蛍光が続くin vivo標識を組み合わせることで、私たちは、上皮のWntリガンドが気管軟骨と筋肉7に上昇を与える発現細胞のSox9とα-SMAの差動増殖のバランスをとることを決定するために許可されました。
要約すると、開発気道のパターニングを研究する複数の手法のアプローチは、気道形態形成を行う上でWntシグナル伝達の役割を深く分析することが可能になります。これらの研究は、気管組織におけるWnt /βカテニンの正確なサイトだけでなく、仕様、気管間充織細胞系列の差分の増殖、ならびに軟骨形成のために必要とされる気管上皮が提供する誘導性および有益なシグナルを決定しました。当社の将来の方向性は、最近同定されたWLSのための全マウント染色の最適化、標的遺伝子、ならびにレクチン染色との組み合わせで行う全体のマウント免疫蛍光。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
"著者らは、開示することは何もありません。」
Acknowledgments
私たちは、組織学的手順で共焦点イメージングとゲイルマッケとマイクMuntiferingとマットKofronの支援を認めます。この作品は、部分的に健康NHLBI（DSへK01HL115447）の国立研究所によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti Sox9 ab. | Millipore | AB5535 | 1:400 , rabbit |
| Anti Sox9 ab. | Santa Cruz | Sc-20095 | 1:50, rabbit |
| Anti Smooth Muscle Actin ab. | Sigma | A5228 | 1:2k, mouse |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:100, guinea pig |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:400, mouse |
| Anti Brdu ab. | Abcam | AB1893 | 1:200, sheep |
| Anti Brdu ab. | Santa Cruz | Sc-32323 | 1:4k, mouse |
| PNA Lectin | Sigma | L 7381 | |
| Secondary antibodies | Life technologies | Alexa fluor Molecular probes | |
| K3Fe(CN)6 | Sigma | P8131 | |
| K4Fe(CN)6 | Sigma-Aldrich | P3289 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| NaDOC | Life Technologies | 89905 | |
| NP4O | Life Technologies | 85124 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A-3157 | |
| Fisher brand super-frost plus | Fisher | 12-550-15 | |
| PFA (16%) | EMS | 15710 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | |
| Fetal Calf Serum | Sigma | 11K413 | |
| Blocking reagent | Invitrogen | Component of TSA kit #2 ( T20932) | |
| BrDu | Sigma | B5002-5g | |
| Vectashield mounting medium | Vector labs | H-1000 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Tissue-loc cassettes Histoscreen | Fisher | C-0250-GR | |
| Biopsy cassettes | Premiere | BC0109 | Available in different colors |
| Nuclear fast red Kernechtrot 0.1% | Sigma | N3020 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-500G | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | S4641-1Kg | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T5941-500G | |
| Xylene | Pharmco-AAPER | 399000000 | |
| Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Micro knives | FST | 10318-14 | |
| Dumont #5 ceramic coated | FST | 11252-50 | |
| Dumont #5CO | FST | 11295-20 | |
| Dumont # 5 | FST | 91150-20 | |
| Thermo/Shandon Excelsior ES | Thermo Fisher | ||
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Nikon i90 | Nikon | Wide field microscope | |
| NikonA1Rsi | Nikon | Confocal microscopy. Settings:NikonA1 plus camera, scanner: Galvano, detector:DU4. Optics Plan Apo lambda 10X. Modality: Widefield fluorescence laser confocal. | |
| Leica MS 16 FA | Leica | Fluorescence Dissecting microscope | |
| Zeiss | Zeiss | Automated fluorescence microscope | |
| Leica Application suite | Leica | Leica imaging software | |
| NIS | Nikon | Nikon imaging software | |
| IMARIS | Bitplane | Imaging processing software |
References
- Maeda, Y., Dave, V., Whitsett, J. A. Transcriptional control of lung morphogenesis. Physiol Rev. 87, 219-244 (2007).
- Morrisey, E. E., Hogan, B. L. Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development. Dev Cell. 18, 8-23 (2010).
- Fausett, S. R., Klingensmith, J. Compartmentalization of the foregut tube: developmental origins of the trachea and esophagus. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, 184-202 (2012).
- Goss, A. M., et al. Wnt2/2b and beta-catenin signaling are necessary and sufficient to specify lung progenitors in the foregut. Dev Cell. 17, 290-298 (2009).
- Harris-Johnson, K. S., Domyan, E. T., Vezina, C. M., Sun, X. beta-Catenin promotes respiratory progenitor identity in mouse foregut. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 16287-16292 (2009).
- Cornett, B., et al. Wntless is required for peripheral lung differentiation and pulmonary vascular development. Dev Biol. 379, 38-52 (2013).
- Snowball, J., Ambalavanan, M., Whitsett, J., Sinner, D. 34;Endodermal Wnt signaling is required for tracheal cartilage formation". Dev Biol. , (2015).
- Shannon, J. M., Hyatt, B. A. Epithelial-mesenchymal interactions in the developing lung. Annu Rev Physiol. 66, 625-645 (2004).
- Shannon, J. M., Nielsen, L. D., Gebb, S. A., Randell, S. H. Mesenchyme specifies epithelial differentiation in reciprocal recombinants of embryonic lung and trachea. Dev Dyn. 212, 482-494 (1998).
- Li, C., et al. Wnt5a regulates Shh and Fgf10 signaling during lung development. Dev Biol. 287, 86-97 (2005).
- Loscertales, M., Mikels, A. J., Hu, J. K., Donahoe, P. K., Roberts, D. J. Chick pulmonary Wnt5a directs airway and vascular tubulogenesis. Development. 135, 1365-1376 (2008).
- Yin, Y., et al. An FGF-WNT gene regulatory network controls lung mesenchyme development. Dev Biol. 319, 426-436 (2008).
- Shu, W., et al. Wnt/beta-catenin signaling acts upstream of N-myc, BMP4, and FGF signaling to regulate proximal-distal patterning in the lung. Dev Biol. 283, 226-239 (2005).
- Bretholz, A., Morrisey, R., Hoffman, R. S. The use of OpdA in rat models of organic phosphorus (OP) poisoning. Toxicology. 257, (2009).
- Goss, A. M., et al. Wnt2 signaling is necessary and sufficient to activate the airway smooth muscle program in the lung by regulating myocardin/Mrtf-B and Fgf10 expression. Dev Biol. 356, 541-552 (2011).
- Mucenski, M. L., et al. beta-Catenin is required for specification of proximal/distal cell fate during lung morphogenesis. J Biol Chem. 278, 40231-40238 (2003).
- Hyatt, B. A., Shangguan, X., Shannon, J. M. FGF-10 induces SP-C and Bmp4 and regulates proximal-distal patterning in embryonic tracheal epithelium. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L1116-L1126 (2004).
- Del Moral, P. M., et al. VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis. Dev Biol. 290, 177-188 (2006).
- Ott, S. R. Confocal microscopy in large insect brains: zinc-formaldehyde fixation improves synapsin immunostaining and preservation of morphology in whole-mounts. J Neurosci Methods. 172, 220-230 (2008).
- Jahrling, N., Becker, K., Dodt, H. U. 3D-reconstruction of blood vessels by ultramicroscopy. Organogenesis. 5, 145-148 (2009).
- Park, J., et al. Regulation of Sox9 by Sonic Hedgehog (Shh) is essential for patterning and formation of tracheal cartilage. Dev Dyn. 239, 514-526 (2010).
- Elluru, R. G., Thompson, F., Reece, A. Fibroblast growth factor 18 gives growth and directional cues to airway cartilage. Laryngoscope. 119, 1153-1165 (2009).
- Ahnfelt-Ronne, J., et al. An improved method for three-dimensional reconstruction of protein expression patterns in intact mouse and chicken embryos and organs. J Histochem Cytochem. 55, 925-930 (2007).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
- Gillotte, D. M., Fox, P. L., Mjaatvedt, C. H., Hoffman, S., Capehart, A. A. An in vitro method for analysis of chondrogenesis in limb mesenchyme from individual transgenic (hdf) embryos. Methods Cell Sci. 25, 97-104 (2003).
- Cohen, E. D., et al. Wnt signaling regulates smooth muscle precursor development in the mouse lung via a tenascin C/PDGFR pathway. J Clin Invest. 119, 2538-2549 (2009).
- Boucherat, O., et al. Partial functional redundancy between Hoxa5 and Hoxb5 paralog genes during lung morphogenesis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 304, L817-L830 (2013).
