Summary
전체 마운트에 연결된 리포터 생쥐 부 염색 현미경 및 생체 내 분석에 사용은 호흡기 정상 패터닝 기전의 분석을 용이하게한다. 여기에서 우리는 이러한 기술이 기관 개발하는 동안 Wnt 신호의 분석에 기여하는 방법에 대해 설명합니다.
Introduction
호흡 기계의 개발은 복부 내배엽 foregut 1, 2에서 Nkx2.1 양성 세포의 모양과 배아 일 9 (E9)에 의해 시작된다. 튜브가 별개의 실체로 구별 할 수있는 경우 식도 - 기관 튜브 분리, E11.5에 의해 중간 엽 조직 (3)에 의해 둘러싸인 해결됩니다. Wnt 신호는 폐 무 발생 4,5가 발생합니다 내배엽 호흡기 상피 세포에서 내장의 중간 엽과 β-catenin의 삭제로 표현 subtype 중 Wnt2 및 Wnt2b의 삭제와 호흡기의 사양에 중요한 역할을한다. 우리의 이전 연구는 폐 형성 부전에서 내배엽 호흡기 결과에서, WLS, 모두의 Wnt 리간드의화물 수용체 매개 분비의 삭제를 결정, 폐 혈관 개발 및 기관 간엽 6,7의 잘못된 패턴의 결함. 이러한 데이터는 상피 간엽 CRO의 중요성을 지원그것은 또한 다른 연구 8,9에 도시 된 바와 같이, SS는, 세포 분화 및 명세서에 말한다.
폐 개발의 초기 단계의 연구는 우리가 더 나은 호흡 정체성 10-16 구동 메커니즘을 이해 할 수있는 생체 외 및 생체 기법, 유전자에 의존한다. 공기 액체 계면에서 전체 폐 이식편 배양 널리 형태 형성 10,17,18 분기 폐의 초기 단계에서 성장 인자의 효과를 연구하는데 이용되고있다. 이 방법 형태와 같은 분지 형태 형성과 같은 변경 및 유전자 발현 조절의 리드로서 사용되는 반면, 배양 자체가 혈관 (17)의 개발을 지원하지 않으므로, 발달 과정의 초기 연구에 제한되어있다. 기관 연골의 개발이 문화 기술과 호환되지 수 있습니다 이상 배양 시간이 필요합니다.
analyz하려면호흡기 형성시 Wnt 신호의 역할 즉, 우리는 배아 연구의 요구를 충족하기 위해 표준 기술을 채택했다. 우리는 볼륨, 염색 시간, 기관 - 폐 조직의 청산을위한 파라핀 삽입 및 타이밍에 대한 처리 사이클을 수정했습니다. 본 연구에 기재된 기술을 최적화의 주요 목표는 E14.5로 E11에서 일어나는 생쥐 기관 발달의 초기 단계를 분석 하였다. 기자 마우스 라인 Axin2LacZ 개발 기관의 중간 엽에서의 Wnt / β-catenin이 활동의 우리 정확하게 결정된 사이트를 사용. 우리는 또한 전체 마운트 기관 조직에 대한 렉틴 염색 절차를 적용했다. 따라서, 우리는 중간 엽 응축을 시각화하고 연골이 일어날 사이트를 예측할 수 있었다. 전체 마운트 및 고급 현미경 기술과 결합 WlsShhCre 마우스에서 얻은 배아 조직의 섹션의 염색은 TRA에 의해 생산의 Wnt 리간드의 역할을 공개 할 우리에게 허용기관 패터닝에 cheal 상피.
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Protocol
동물은 무균 상태에서 보관 하였다. 마우스는 CCHMC 기관 동물 관리 및 사용위원회 (신시내티, OH USA)에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 처리 하였다. 이러한 연구를 통해 이용 마우스가 혼합 된 배경에서 유지 하였다.
1. 전체 마운트 X - 갈 락토시다 제 염색
- CO 2 흡입에 의해, E14.5에 E11.5에서 임신 여성을 안락사. , CO 2 챔버에서 동물을 배치 CO 2 챔버를 부과합니다. 5 분의 최소 챔버에서 동물을 유지한다. 자궁 전위에 의해 안락사의 보조 방법을 수행합니다.
- 에탄올 (EtOH로) 70 % 단일 복부 정중선 절개 개복술을 수행 청소 복부 영역입니다. 수술 가위 및 표준 패턴 (직선 톱니) 집게를 활용합니다.
- 페트리 접시에 배치 즉시 집게 및 미세 가위를 사용하여 자궁 뿔을 분리하고 조직을 PBS 용액을 냉각 함유. 진행까지 얼음에 조직을 유지배아의 분리합니다.
- 자궁 뿔에서 배아를 분리합니다. 해부 현미경을 사용하여 배아 기관 폐 조직을 해부하다. 상태에서 자궁 조직에 구멍과 배아를 해제 concepti하기 좋은 팁 집게와 가위를 사용한다.
- 배아 세포막을 나머지 제거합니다. 배아의 바늘 블레이드의 도움을 잘라 머리와 횡격막 아래의 하체 부분. 랜드 마크로 간을 찾습니다.
- 배아의 흉부 영역의 분리 후, 몸 벽, 척추, 심장 사용 바늘 블레이드의 측면을 제거하기 위해 진행합니다. 기관 조직 부상을 방지하기 위해 심장을 제거하는 동안주의하십시오. 마지막으로, 조심스럽게 바늘 블레이드의 도움으로 식도를 잡아 당겨 기관에서 식도를 구분합니다. 얼음에 PBS 용액에 조직을 유지한다.
- 4 용액에 장소 조직은 유리 또는 전송 피펫을 사용하여 캡 튜브를 나사. 30 분 동안 PBS 중의 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 기관 폐 조직을 고정한다. 고정 후,PBS로 조직을 씻어. 세정하는 동안, X-여자 염색 용액 (5 mM의 K 3의 Fe (CN 추가) (6), (100 ㎕의 0.5 M 주식) 5 mM의 K 4의 Fe (CN) 6 (100 ㎕의 0.5 M 주) 2 밀리미터의 MgCl 2, (준비 20 ㎕의 1 M 주식) 0.01 %의 NaDOC (50 μl의 2 % 주), 0.02 % NP 4 O (100 ㎕를 2 % 주), 1 ㎎ / ㎖ X-여자 (20 mg을 500 μL / ㎖ 주) 및 9.13 ml의 10 ㎖의 최종 부피)으로 가져다 증류수.
- 나머지 PBS를 제거하고 유리 바이알에 X-여자 염색 용액 2 ㎖를 추가합니다. 통에 트레이에 튜브를 놓습니다. 얼룩 조직 한 X-여자의 염색 액의 시간 2. 추가 처리 및 매립에 대한 4 시간 동안 X-여자 솔루션의 조직을 품어.
- 3 % 디메틸 술폭 시드-PBS에서 세척 조직에 의해 반응을 정지. 5 분 동안 PBS에서 70 % 에탄올에서 각각 세척하고 저장을 3 회 헹군다.
- 1 % 아가로 오스 / PBS 용액으로 배양 접시를 입력합니다. 아가로 오스 공고히 할 수 있습니다. 유리 전달 피펫을 사용하여, 아가로 공동의 조직을 올려PBS 용액으로 가득 ated 판. 해부 현미경을 사용하여 전체 마운트 사진. 시야에 적합한 필터를 선택합니다.
- 더 나은 파라핀 삽입 및 절편에 대한 X-여자 염색 과정 샘플 사이트를 구별합니다. 미세 스크린 카세트에 넣어 샘플.
- 여섯 알코올의 변경 : 5 분 첫번째 변화와 나머지 각 변경 당 3 분 파라핀 삽입에 대한 샘플은 자동화 된 프로세서를 사용하여 다음과 같이 짧은주기를 설정 처리합니다. 크실렌의 세 가지 변화 : 5 분 첫번째 변화와 3 분 다음이 변경됩니다. 이전 단계는 30 ° C에서 수행됩니다. 25 분, 8 분, 5 분 : 마지막으로, 62 ° C에서 파라핀의 세 가지 변화를 수행합니다.
- 조직이 보트를 삽입의 바닥에 평평하게 누워 삽입하는 동양 샘플. 조심스럽게 삽입 배를 채우기 위해 파라핀을 추가합니다. 파라핀 응고 될 때까지 역을 내장의 냉각 판에 즉시 쿨. 보트를 삽입에서 블록을 제거합니다. 마이크로톰을 사용하여, 6 μm의 S를 생성ections. 전처리 - 슬라이드와 1 시간 동안 42 ° C에서 슬라이드 따뜻한 설정에 건조 슬라이드 마운트 부분.
- 구워는 56 ºC에서 오븐에서 하룻밤 슬라이드. 랙에 슬라이드를 놓습니다. Deparaffinize 100 % 크실렌 세 변경, 10 분에 각각 슬라이드. 자일 렌 200 ㎖로 가득 요리를 염색 사용합니다.
- 10 내지 30 초 동안 핵 패스트 레드 대조 염색 전에 PBS로 등급을 EtOH 시리즈 (100 %, 70 %, 50 % 및 30 %, 단계 당 1 분)을 사용하여 슬라이드를 재수. 수돗물로 5 분 핵 고속 레드 초과를 제거 할 때마다 세 번 슬라이드를 씻어.
- 크실렌 기반 설치 미디어 미끄러지는 크실렌의 세 가지 변화 세척하기 전에 등급을 EtOH 시리즈의 슬라이드 (50 %, 70 % 및 100 %의 EtOH) (20 저러나 각 변경) 및 덮개를 탈수.
2. 렉틴 염색
- 단계 1.4-1.1에 설명 된대로 E13.5 및 E14.5의 기관 폐 조직을 해부하다. 스크류 캡 바이알에 유리 전송 피펫에게 장소 조직을 사용. 2 ml의 기관 폐 조직 해결4 ℃에서 하룻밤 2 % PFA 솔루션입니다. 고정 후, PBS에서 10 분마다 세척을 위해 세 번 샘플을 씻어.
- 완충 용액 10 ㎖의 최종 부피 보통 차단 준비한다. PBS의 8 ml의 BSA (1 %) 0.1 g을 추가합니다. BSA는 용해 할 수 있습니다. 염소 혈청 (2 %) 트리톤 X-100 (0.3 %)의 0.03ml의 0.2 ML을 추가합니다. PBS 10 ml의 최종 볼륨을 가져와. 실온에서 차단 완충액 0.5 ml를 1 시간 동안 차단 샘플.
- 전송 피펫을 사용하여 차단 버퍼를 제거하고 렉틴의 50 μg의 / μL, 10 % 염소 혈청과 PBS로 구성 렉틴 용액으로 교체합니다. 샘플 당 렉틴 용액 250 μl를 사용합니다. 4 ℃에서 밤새 품어. 알루미늄 호일과 조직을 포함하는 유리 병을 포함해야합니다. 렉틴 용액으로 배양 한 후, 10 분 동안 PBS로 세 번 샘플을 헹군다.
- 샘플을 충당하기 위해 충분한 PBS를 포함하는 아가로 오스 코팅 된 배양 접시에 장소 외식. 형광 - 해부 현미경을 사용하여 전체 마운트 사진. approp를 선택riate 필터는 형광을 검출한다. 렉틴 PNA 보통 GFP에 연결된다.
3. 전체 마운트 면역 형광 염색 및 공 초점 현미경
- 4 ml의 유리 스크류 캡 바이알에 전송하고 4 % PFA에서 하룻밤 수정, 기관 폐 조직을 분리합니다. E11.5 조직은 2 % PFA에서 수정 될 수 있습니다. 메탄올 스토어 100 %. 시료는 -20 ° C에서 몇 개월까지 저장할 수있다.
- 전송 피펫을 사용하여 메탄올을 제거하고 2 시간 동안 덴트의 블리치 (4 부 메탄올, 1 부 DMSO 1 부 30 % H 2 O 2)를 사용하여 샘플을 Permeabilize 하시려면. 다음 PBS에 희석 메탄올 등급 시리즈 하이드레이트 조직 : 100 % 메탄올, 75 % 메탄올, 50 % 메탄올, 25 % 메탄올, 100 % PBS. 수화의 각 단계에서 실온에서 10 분 동안 인큐베이션.
- PBS로 희석 한 0.5 % 차단 시약 블럭 조직 교반하면서 실온에서 2 시간 (상세한 재료 참조).
- 차단에 차 항체를 희석솔루션 (Sox9 1 : 100, Nkx2.1 1 : 200, αSMA 1 : 250), 4 ℃에서 하룻밤 샘플을 품어. 실온에서 PBS 다섯 번 씻을 샘플. 1 시간 동안 각 세척을 수행합니다.
- 0.5 % 차단 솔루션 (500) 희석 : 1에서 차 항체를 적용합니다. 조심스럽게 차 항체 간의 결합을 방지하기 위해 이차 항체를 선택합니다. 어두운 방에 4 ° C에서 밤새 품어. 세척 된 샘플을 실온에서 20 분간 3 회. 다음 PBS에 희석 메탄올 등급 직렬 샘플 탈수 : 25 % 메탄올, 50 % 메탄올을 75 % 메탄올, 100 % 메탄올, 10 분마다 단계.
참고 : 시료를 알루미늄 호일로 덮여 남아 있는지 확인하고 빛에 노출을 최소화 할 수 있습니다. 촬영까지 조직을 지금 몇 주 동안 4 ℃에서 저장 될 수있다. - 전송 샘플은 사용자 정의 머레이의 맑은 용액의 약 200 μl를 19, 20 (2 부 벤질 벤조 에이트, 1 부 벤질 알코올) 즉시 BEF 메탄올과 맑은 제거, 무대 판을 제작하기광석 영상. 공 초점 현미경을 사용하여 사진. 프로세스 및 이미징 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석한다.
4. 세포 증식
- 체중 100 μg의 BrdU의 / g 농도의 BrdU의 용액으로 복강 내 E11.5 임신 마우스를 주사. E12.5 또는 E13.5에서 배아를 프로토콜의 섹션 1에서 설명하고 분리로 여성을 희생. 칼 블레이드, 소비세 머리와 흉강 아래 신체의 아래 부분을 사용.
- 4 ml의 캡 튜브를 나사에 가슴 조직을 놓고 하룻밤 4 % PFA 1 ㎖에 고정합니다. 30 %, 50 % 및 70 % 에탄올을 5 분마다 단계 : 세척에서 5 분 동안 PBS로 2 번 샘플은 다음과 같이 70 % 에탄올에 증류수까지 희석 에탄올 시리즈를 통해 샘플을 탈수.
- 중간 크기의 화면 카세트에 넣어 샘플. 사용 파라핀 삽입 및 자동 프로세서에 대한 프로세스 조직. 8 분 동안 알코올의 여섯 변화 각각 6 분 각각 세 가지 C에 대한 크실렌의 세 가지 변화를 다음과 같이주기를 설정25 분, 9 분, 8 분 동안 파라핀의 hanges.
- 1 시간 동안 42 ° C에서 슬라이드 따뜻한 설정에 슬라이드 준수 조직을 슬라이드에 섹션 1. 섹션에 설명 된대로 6 μm의 가로 또는 세로 섹션을 생성 할 수 있도록 원하는 위치에서 조직을 배향 파라핀에 포함.
- 구워 슬라이드, 자신의 옆에, 하룻밤 56 ° C에서 오븐한다. 플라스틱 랙에 슬라이드를 놓습니다. 100 % 크실렌의 세 가지 변화, 변화 당 10 분 침지하여 탈 paraffinize 슬라이드. 완전히 슬라이드를 잠수함에 크실렌 200 ㎖를 사용합니다. PBS (5 분)로 등급을 EtOH 시리즈 (100 %, 70 %, 50 % 및 30 %, 교반 단계 당 5 분)를 이용하여 슬라이드를 재수.
- 0.1 M 시트르산 18 ㎖의 시트르산 완충 monohydrated 혼합물을 100 ml의 0.1 M 시트르산 나트륨 용액 (82)을 준비하기 위해 10 mM의 시트르산을 완충액, pH가 6을 사용하여 항원 검색을 수행한다.
- 높은 전력에서 6.5 분 동안 항원 검색 솔루션과 전자 레인지로 가득 플라스틱 코 플린 항아리에 넣어 샘플. DIS 추가6 분 동안 40 % 전력에서 증발 - 시트 레이트 완충액 재가열을 보상하기 위해 코 플린 병에 물을 경작.
- 물 위로, 6 분 동안 40 %의 전력으로 다시 재가열 코 플린 항아리를 채우십시오. 전자 레인지 시간은 사용하는 전자 레인지에 따라 달라질 수 있습니다.
- 슬라이드를 5 분 동안 PBS 다음 1 분, 증류수로 세척 슬라이드 전에 실온에서 20 분 동안 냉각시킵니다. PBS를 후 TBS를 함유하는 용액 (트리스 염기 2.425 g 및 1- 증류수 L로 희석 염화나트륨 8.765 g) 10 % 당나귀 혈청과 1 % BSA를 차단에서 2 시간 동안, 블록 슬라이드를 세척한다.
- 용액 (10 % 당나귀 혈청과 1 % BSA를 포함하는 TBS)를 차단에 희석 일차 항체를 추가합니다. BrdU의 (유사 분열 마커), Nkx2.1 (호흡기 상피) Sox9 및 αSMA (평활근 세포) (연골 세포를 야기 할 것이다). 4 ° C에서 밤새 슬라이드를 품어. 항체를 보존하기 위해 오버레이 방법을 사용합니다. 가스켓에 항체의 180 μl를 적용하고 커버 슬립 것처럼 슬라이드를 첨부핑.
- 증류수로 슬라이드를 찍기로 가스켓을 분리합니다. 개스킷 제거한 후, TBS는 0.1 % 트윈 -20을 함유하는 여섯 5 분간 세척을 행하여 언 바운드 차 항체를 세척한다.
- 실온에서 1 시간 동안, 200 : 1의 희석 용액을 차단 희석 이차 항체로 슬라이드 부화. 그 중 원하지 않는 바인딩을 방지하기 위해주의 깊게 이차 항체를 선택합니다. 0.1 % 트윈을 포함하는 TBS로 3 ~ 5 분 세척을 수행하여 언 바운드 차 항체를 제거합니다.
- 5 분 동안 두 번 0.1 M 트리스베이스에 슬라이드를 세척하고 5 분 동안 두 번 다음 0.05 M 트리스베이스. 또는 DAPI (1.5 μg의 / ㎖)없이 설치 미디어를 사용 coversliping 동안 슬라이드는 0.05 M 트리스베이스에 남아있을 수 있습니다. 저장 4 ° C에서 슬라이드 폴더에서 슬라이드와 알루미늄 호일로 폴더를 덮어 빛으로부터 보호합니다.
- 염색 및 사진 자동화 된 형광 현미경을 사용하여 시각화합니다. 촬영 표지 세포 및 필드 당 총 세포 수를 계산20X 및 40X 총 세포에 세포 증식의 비율을 결정합니다.
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Representative Results
이 Wnt / β-catenin의 활동
전체 마운트 락-Z 염색은 기자 Axin2 락 -Z 마우스 (11)에서 분리 된 배아의 기관 - 폐 조직에서 검출되었다. 염색 사이트의 Wnt / β-catenin의 활성을 나타냅니다. 전체 마운트 염색 부분의 분석의 Wnt / β-catenin의 활동이 기관의 중간 엽에서 개발 폐의 주변 영역의 중간 엽에 존재하는 것을 결정했다. (호흡기의 상피 세포에서의 Wnt 리간드의 분비가 폐지 된 것을 특징) WlsShhCre 배아에서 락-Z 염색 거의없는 (그림 1)이었다.
기관 중간 엽에서 중간 엽 응축
연골에 중요한 단계는 중간 엽 세포 연구를 제공하는 운명하는 과정입니다이세가 응축을 연골. 세포의이 꽉 집계는 중간 엽 응축로 알려져 있습니다. WlsShhCre 마우스에서 관찰 된 연골의 부족 PNA 렉틴으로 염색 하였다 E14.5에 임신 나이 E12.5에서 중간 엽 응축, 기관 폐 조직의 부재로 인해 여부를 테스트합니다. E13.5 및 E14.5에서 형광 연골이 형성 될 것입니다 사이트에서 기관 중간 엽에서주기적인 밴드로 검출되었다. WlsShhCre 배아의 기관 조직에서 검출 형광의 부족은 기관 중간 엽에 내배엽 Wnt 신호가 중간 엽 응축 (그림 2)에 필요한 있음을 나타냅니다.
호흡기 세포 사양
기관 폐 조직의 전체 마운트 면역은 E11.5에서 Sox9, Nkx2.1 및 αSMA의 발현 패턴을 결정했다. 기관 조직, Sox9 표현은 제한이(그림 3A, B 및 C의 화살표 머리) 호흡기 상피의 주변에서 관찰되는 현상 폐 Sox9에있는 동안 연속 스트라이프와 같은 기관의 중간 엽에 에드 (그림 3A와 B의 화살표). Nkx2.1은 폐의기도의 상피 세포에 제한 별개의 발현 패턴을 제공합니다. 상피 세포에서의 Wnt 리간드의 방지 분비 기관 중간 엽에 Sox9의 감소 표현을 야기하지만, 주변 폐 상피 세포에서 Sox9 표현에 영향을주지 않습니다. αSMA의 발현이 용이 기관 중간 엽 검출되지 않지만 염색은 후두 (노란색 화살표, 그림 3)과 위 (그림 3)의 수준에서 검출되었다.
개발 기관에서 세포 증식
상피 세포와 중간 엽에서 대량 살상 무기 확산기관의 BrdU의와 조직의 생체 표지 후 검출되었다. 기관 조직의 섹션 BrdU의, Sox9 및 αSMA을 인식하는 항체로 염색 하였다. 기관 중간 엽의 확산 프로파일은 Sox9 염색 된 세포 겪고 증식의 수준이 증식을 겪고 αSMA 염색 된 세포의 레벨보다 높은 것을 나타냅니다. 이 확산 패턴은 WlsShhCre의 tracheas (그림 4)에 복귀 할 것으로 보인다.
그림 1 :이 Wnt / β-catenin의 활동이 기관의 중간 엽에서 동작 Axin2-LacZ를하고 WlsShhCre에서 격리 E13.5의 기관 폐 조직, :. Axin2-LacZ를 마우스는, X-여자 (A와 B)으로 염색 하였다. 기관 폐 조직의 섹션 ( 'B'A) 빠른 빨간색으로 대조 하였다. X-여자의 부족을 참고WlsShhCre에 염색;의 Wnt / β-catenin의 활동 (B ')의 부재를 보여 Axin2 - 락-Z 마우스는. X-여자로 염색 Axin2 LacZ를 마우스에서 E14.5 조직은 미래의 연골 고리 (C)의 위치를 나타낸다 그러나 Axin2 활성은 중간 엽 응축 (화살표) (D)의 외주 (화살표 머리)로 제한 하였다. 스케일 바 A, B 및 C = 500 μm의; B ', D'와 D = 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :. 기관 조직을 개발 중간 엽 응축 E13.5 기관 - 폐 외식은 PNA 렉틴으로 염색 하였다. 지역을 묘사 제어 기관의 조직이 표시됩니다 응축 중간 엽 세포했다 (화살표 A를 C). 아니 중간 엽 응축은 WlsShhCre 마우스 검출되지 (B와 D의 화살표) 하였다. C와 D는 A와 B에 도시 기관 - 폐 조직의 낮은 배율을 묘사한다. 스케일 바 A와 B = 1mm; C와 D는 = 2 mm이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 :. 식 패턴 prechondrogenic 전부는 기관 Nkx2.1과 Sox9 염색이 E11.5 외식 검출되었다 탑재합니다. 패널 B는 20 μm의 제어 조직의 광학 단면을 도시하는 동안 패널 A는 제어 조직의 이미지를 나타낸다. WlsShhCre 조직에 Sox9의 중간 엽 표현의 부족 (C에서 화살표)를 참고 BUSox9의 주변 표현의 t의 유지 보수 (C에서 화살촉). αSMA 염색이 E11.5 조직의 trachealmesenchyme 낮은 수준에서 감지하지만 후두 지역에서 관찰 (D 및 E 노란색 화살표)하고, 위 (S)와 나머지 심장 조직 (CT) (E). Nkx2.1는기도와 폐 (D, E)를 개발 상피로 표현된다. 스케일 바 = 10 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 :. prechondrogenic 중간 엽 세포 증식 패턴 E13.5 배아의 섹션이 안티 BrdU의, Sox9 및 αSMA 항체로 염색 하였다. 패널 C와 D는 높은 배율입니다 B. 점선은 기관 상피의 한계를 나타냅니다. Sox9 스테인드 증식 세포 (화살촉 C) 및 αSMA 염색 증식 세포 (D에서 화살촉)를 참고. T = 기관, E = 식도. 스케일 바 A와 B = 50 μm의, C 및 D = 20 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
호흡 기관의 형태 형성의 기초 이벤트 완전히 도통기도의 패터닝에 필요한 공정, 특히 이해되지 않는다. 이전의 연구 개발 이식편 공기 - 액체 계면에서의 배양이나 마트 리겔 (21, 22)에 포함 된 상기 생체 외 기법을 이용 하였다. 성장 인자가 개발 기관의 패터닝 및 기관 연골의 형성에 미치는 영향이 연구에서 나타났다. 이러한 연구에 대한 제한은 상기 조직의 구조가 적절하게 유지되지 않기 때문에, 그들은 매우 연골의 생체 프로세스 요점을 되풀이하지 않을 수 있다는 것이다.
우리는기도를 행하는 과정에서 Wnt 신호의 역할을 연구 착수 접근은 전체 산 염색 기법, 면역 형광 이미징 결합 생체 연구에 포함 된 패터닝을. 전체 마운트 조직의 X-여자 염색은 그 자체로 다음ctioning 및 카운터 - 염색, 파라핀 섹션의 염색을 통해 이점을 제공합니다. 전체 마운트 염색의 Wnt / β-catenin의 활동이 동작하는 사이트를 직접 검출 할 수 있습니다. 또한, 스테인드 외식의 절편은 개발이 진행되면서 활동이 위치한 상기 중간 엽의 정확한 위치를 결정. 후자는 파라핀 섹션 β 갈 락토시다 제 효소의 발현의 검출에 비해 더 정확한 판독된다. 효소 활성이 절에서 검출 할 수 있지만,이 절차는 항상 발생하기 쉬운되지 않습니다 작은 샘플의 구조를 유지하지 않을 수 있습니다 저온부가 필요합니다. 이 문서에 설명 된 프로토콜의 한계는, 신호의 손실의 원인이됩니다 전체 마운트 염색 후 파라핀 삽입에 대한 샘플의 처리이다. 따라서, 샘플은 X-여자 용액에 이상을 유지해야 파라핀 삽입에 대한 짧은 사이클이 섹션에 좋은 신호를 얻기 위해 사용되어야한다.
한편, Ahnfelt-로네 (23)에 의해 기재된 기술 후 변형 전체 마운트 면역 절차, 예컨대 Nkx2.1와 같은 핵심 전사 인자에 의해 코딩되는 단백질의 정의 발현 패턴,기도 및 폐 조직 개발 삼차원 시각화 허용 Sox9. 원하는 경우, 전체 마운트 얼룩은 기관 폐 조직의 다른 깊이를 묘사 한 이미지의 공 초점-도움 Z 스택으로 표시 할 수 있습니다. 작은 외식 이미징 동안, 조직의 청산은 무대 판에서 수행해야합니다. 우리는 두꺼운 금속을 사용샘플을 취소하고 이미지화되는 경우 사용자 정의 광학 바닥 무대 판을 만들었다. 단계를 삭제 한 후 작은 조직을 전송하는 동안이 물질의 손실을 방지 할 수 있습니다. 전체 마운트 면역 작은 조직의 염색에 적합한 기술이지만, 우리는 기술에 한계를 인정합니다. 특히, 전체 산 반대 부분에서 더 항원을 인식하는 항체 이종 성능을 관찰 하였다. 대안 항체를 사용할 수없는 경우이 문제가 기술의 성능을 방해 할 수 있습니다. 머의 맑은 메탄올 및 클리어링의 사용이 관찰 된 신호에 부정적인 영향을 미칠 수 있다는 것도 가능하다. 미래에, 우리는 다른 비 유기 청산 솔루션을 테스트하고이 목적을 24 제대로 프로토콜을 조정합니다. 마지막 고려 사항은 전체 마운트가 하나의 주어진 시간에 조직에서 발현 몇 가지 단백질의 연구를 허용하는 것입니다.
이전 보고서의 유용성을 보여 주었다PNA 렉틴 염색 기관 조직 21, 25의 섹션에서 중간 엽 응축을 감지합니다. 본 연구에서 우리는 염색이 연골이 형성 될 상기 기관의 지역의 더 나은 시각화를 용이하게 전체 마운트에서 수행 된하여 방법을보고합니다. 시판 PNA 렉틴은 GFP에 결합 렉틴으로 염색 관리를 수행하는 것이 아니라 위에 얼룩 렉틴에 적절한 농도를 사용하여 배치되어야하지만. 조직의 자동 형광 응축을 간엽에 대응하는 대역을 구분하기 어렵게 만드는 결과를 가릴 수있다.
마지막으로, 절편 및 면역 염색 하였다 BrdU의 조직과의 생체 표지는 PPH3 또는 PCNA 26,27 전형적인 정적 염색보다 이점을 제시 세포 증식을 결정하기 위해 실행 가능한 기술이다. 후자의 방법은 염색이에 따라 달라질 수로, 한계를 제시세포주기 단계. 이 문제는 우리의 기술 된 기술에 의해 제거된다. , 내장 절편 및 면역 형광 다음에 생체 내 라벨을 결합하면 우리는 상피 세포의 Wnt이 기관 연골과 근육 7을 야기 할 것이다 발현 세포 Sox9 및 α-SMA의 차동 확산의 균형을 리간드 것을 확인 할 수있었습니다.
요약하면, 현상 호흡기 패터닝을 연구하는 여러 기술 방식은기도 형태 형성을 실시에서 Wnt 신호의 역할 깊은 분석을 허용한다. 이러한 연구들은 상기 기관 조직의 Wnt / β 카테닌의 정확한 위치뿐만 아니라 명세서 기관 중간 엽 세포 계통의 차동 증식뿐 아니라 연골 형성을 위해 요구되는기도 상피에 의해 제공 유도하고 유익한 시그널링을 결정 하였다. 우리의 미래 방향 최근에 확인 된 WLS의 전체 마운트 얼룩의 최적화를 포함목적 유전자뿐만 아니라 렉틴 염색과 조합하여 행하는 전체 마운트 면역.
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Disclosures
"저자는 공개 아무것도 없어."
Acknowledgments
우리는 조직 학적 절차에 마이크 Muntifering 및 공 초점 이미지와 매트 코프 론 (Kofron)와 게일 Macke의 도움을 인정합니다. 이 작품은 부분적으로 건강 NHLBI의 국립 연구소 (DS에 K01HL115447)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti Sox9 ab. | Millipore | AB5535 | 1:400 , rabbit |
| Anti Sox9 ab. | Santa Cruz | Sc-20095 | 1:50, rabbit |
| Anti Smooth Muscle Actin ab. | Sigma | A5228 | 1:2k, mouse |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:100, guinea pig |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:400, mouse |
| Anti Brdu ab. | Abcam | AB1893 | 1:200, sheep |
| Anti Brdu ab. | Santa Cruz | Sc-32323 | 1:4k, mouse |
| PNA Lectin | Sigma | L 7381 | |
| Secondary antibodies | Life technologies | Alexa fluor Molecular probes | |
| K3Fe(CN)6 | Sigma | P8131 | |
| K4Fe(CN)6 | Sigma-Aldrich | P3289 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| NaDOC | Life Technologies | 89905 | |
| NP4O | Life Technologies | 85124 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A-3157 | |
| Fisher brand super-frost plus | Fisher | 12-550-15 | |
| PFA (16%) | EMS | 15710 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | |
| Fetal Calf Serum | Sigma | 11K413 | |
| Blocking reagent | Invitrogen | Component of TSA kit #2 ( T20932) | |
| BrDu | Sigma | B5002-5g | |
| Vectashield mounting medium | Vector labs | H-1000 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Tissue-loc cassettes Histoscreen | Fisher | C-0250-GR | |
| Biopsy cassettes | Premiere | BC0109 | Available in different colors |
| Nuclear fast red Kernechtrot 0.1% | Sigma | N3020 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-500G | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | S4641-1Kg | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T5941-500G | |
| Xylene | Pharmco-AAPER | 399000000 | |
| Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Micro knives | FST | 10318-14 | |
| Dumont #5 ceramic coated | FST | 11252-50 | |
| Dumont #5CO | FST | 11295-20 | |
| Dumont # 5 | FST | 91150-20 | |
| Thermo/Shandon Excelsior ES | Thermo Fisher | ||
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Nikon i90 | Nikon | Wide field microscope | |
| NikonA1Rsi | Nikon | Confocal microscopy. Settings:NikonA1 plus camera, scanner: Galvano, detector:DU4. Optics Plan Apo lambda 10X. Modality: Widefield fluorescence laser confocal. | |
| Leica MS 16 FA | Leica | Fluorescence Dissecting microscope | |
| Zeiss | Zeiss | Automated fluorescence microscope | |
| Leica Application suite | Leica | Leica imaging software | |
| NIS | Nikon | Nikon imaging software | |
| IMARIS | Bitplane | Imaging processing software |
References
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